非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展

技术非洲猪瘟(AfricanSwineFever，ASF)是由非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。临床症状与猪瘟极其相似，以高热、皮肤发绀、内脏器官严重出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征。本病传播快、致死率高，对养猪业危害巨大，是我国一类动物疫病和世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的动物疫病，受到世界各国的高度重视。本病是唯一以节肢动物作为传播媒介的DNA病毒。迄今为止，ASF已在非洲、欧洲和美洲等几十个国家暴发。虽然我国尚未发生，但防控ASF传入的形势非常严峻。目前，本病尚无有效的预防疫苗和治疗药物，防止疫情扩大的唯一有效措施就是扑杀。因此事先建立简便、快速、准确的ASFV检测方法显得十分必要。本文综述了ASFV最新实验室检测方法研究进展，以期为我国开展ASF的监测提供技术参考。1 血清学检测方法1.1酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA应用于血清抗体的检测，具有操作方便、特异性较好、灵敏度高的特点，适用于大批量样品的检测，OIE将ELISA作为诊断ASF的首选血清学方法。ASFV含有约150种蛋白，目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等。Wardly等[1](1979)首次建立了间接ELISA方法检测ASFV抗体，具有较好的敏感性和特异性。Pastor等[2](1990)分别以ASFV主要结构蛋白VP73和病毒感染的细胞培养物中高特异胞质可溶性抗原(CS-P)建立了两种间接ELISA方法，两种方法特异性均较高，但是CS-P抗原比VP73抗原至少能提前2d检测出ASFV抗体。Vidal等[3](1997)用VP73单抗建立的固相ELISA，能够检测到浓度为0.5μg/mL的VP73抗原和2.3×102pfu/mL的全病毒颗粒。Hutchings等[4](2006)比较了用全病毒多抗血清和针对VP73蛋白的单抗进行间接夹心ELISA检测ASFV，显示多抗血清的敏感性高于单抗。Perez等[5](2006)以昆虫细胞表达的P30重组蛋白为包被抗原，建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法，敏感性高，可用于ASFV特异性抗体的早期检测。Gallardo等[6](2009)利用重组蛋白pK205R、pB602L、p104R和P54建立的ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性。蒋正军等[7](2000)以杆状病毒表达的ASFVVP72蛋白为抗原，研究和组装了间接ELISA抗体检测试剂盒，具有反应体系小、快速、非洲猪瘟病毒实验室检测方法研究进展■文/山东省滨州畜牧兽医研究院庄金秋梅建国谢金文李峰沈志强摘 要非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其临床症状与猪瘟极其相似。本病已在非洲、欧洲和美洲等几十个国家暴发。虽然我国尚未发生，但防控其传入的形势也非常严峻。本文综述了非洲猪瘟病毒最新实验室检测方法研究进展，以期为我国开展非洲猪瘟的监测及综合防控提供技术参考。关键词非洲猪瘟；非洲猪瘟病毒；检测；研究进展基金项目：山东省重点研发计划项目(2015GSF121027)；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-08-17)。规模养猪MODERNSWINEINDUSTRY32特异等优点，且比Dot-ELISA方法更加敏感。仇华磊[8](2006)采用大肠杆菌表达的GST-VP72融合蛋白为包被抗原，建立了间接ELISA。朱红[9](2007)成功获得5株分泌抗ASFVVP72蛋白单克隆抗体的细胞株，也建立了间接ELISA方法。李秋霞[10](2010)以大肠杆菌表达的ASFVpET32a-VP73L重组蛋白作为包被原，也建立了间接ELISA方法。曾少灵等[11](2013)利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达的ASFV的VP73重组蛋白作为检测抗原，建立了间接ELISA方法。靳雯雯[12](2014)以VP73纯化蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA方法，与商品化的阻断ELISA相比，其具有较好的敏感性和特异性。董志珍等[13](2012)针对ASFVP54蛋白建立了单克隆抗体竞争法ELISA并构建了检测试剂盒，灵敏度高于间接免疫荧光(IFA)方法。梁云浩等[14](2014)利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出的ASFVP54重组蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法。邬旭龙等[15](2016)以原核表达的ASFVpK205R蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA检测方法。张倩等[16](2012)采用瑞典SvanovaASFV间接ELISA抗体检测试剂盒对辽宁绥靖、内蒙古赤峰、大连东港共计92份猪血清进行了ASFV抗体的检测，结果全部为阴性。邓飞等[17](2016)采用西班牙IngenasaASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒对来源于四川省内的92份猪血清进行检测，结果表明，92份血清样本均为ASFV抗体阴性。1.2胶体金免疫层析(GICA)试纸条张鑫宇等[18](2014)用原核表达的ASFVP54重组蛋白制备了ASFV抗体快速检测胶体金试纸条，通过对ASFV不同感染时期141份猪血清样品进行比对检测，显示该试纸条在感染早期的符合率高于OIE推荐的ELISA检测方法。刘波[19](2014)也运用原核表达系统和胶体金免疫层析技术，对ASFV快速检测试纸条的技术进行了研究。吴海涛[20](2015)运用双抗体夹心法原理纯化后的抗ASFV单克隆抗体制备金标抗体，制备了用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条。1.3其他血清学方法荧光抗体试验(FAT)可用于检测野外可疑猪或实验室接种猪的脾、淋巴结等组织压片和冰冻切片中的ASFV抗原。该方法具有快速、经济、敏感性和特异性高等优点，但需要专业试验人员，同时需要荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。因此仅作为ASFV的辅助检测方法。间接免疫荧光试验(IFA)可用于检测感染ASFV的猪血清样品。该方法的优点是当ELISA检测结果不确定或制备抗原困难或复杂时，可选用此法。Malmquist等[21](1960)提出并建立了血细胞吸附试验方法，血细胞吸附是指猪的红细胞附着在感染ASFV的单核细胞或者巨噬细胞的表面。绝大多数从非洲分离的ASFV毒株以及最初从欧洲国家分离的ASFV毒株均产生猪红细胞吸附现象。Pan等[22](1978)应用免疫过氧化物酶噬斑染色技术，对接种ASFV的Vero细胞进行检测，3d后观察到噬斑。可对ASFV进行抗原定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。此方法快速、特异，不用借助其他仪器，肉眼便可观察结果。Pastor等[23](1992)用细胞质可溶性抗原CS-P，建立了斑点免疫(DIA)检测方法，敏感性与OIE推荐的ELISA方法相当。Marco等[24](2007)建立了免疫组化法，用来检测急性感染ASFV猪的扁桃体组织病理学变化，通过检测发现，感染ASFV猪有出血、单核细胞增多现象。免疫组化法是通用的检测方法之一，但对于临床症状不明显的病例，确诊有一定难度，因此，该方法仅作为ASFV的辅助检测方法。2 分子生物学检测方法2.1PCRPCR具有简单快速、灵敏度高和特异性强的优点，是目前ASFV最常用的实验室检测方法。Aguero等[25](2003)和曾少灵等[26](2009)先后根据ASFVVP72基因 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物，建立了ASFV的PCR检测方法，均具有良好的敏感性和特异性，可以检测出极低含量的ASFV，为ASFV早期感染的快速诊断提供了有效的分子生物学检测方法。Aguero等[27](2004)和张倩[28](2010)先后建立了一步法多重RT-PCR方法，能够鉴别诊断猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)和ASFV，可以从临床样品(如抗凝全血、细胞培养物和组织)中检测到病毒，这为早期快速、特异性诊断非洲猪瘟和猪瘟提供了可靠的方法。Basto等[29](2006)建立了检规模养猪MODERNSWINEINDUSTRY33技术测蜱ASFV的套式PCR方法，敏感性高于OIE推荐的PCR检测方法。Giammarioli等[30](2008)建立了检测CSFV、ASFV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)5种病毒的多重PCR检测方法，可以用于这5种病毒感染的鉴别诊断。崔尚金等[31](2012)建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法，该方法采用纳米金颗粒作为热导介子，提高了PCR反应效率。敏感性试验表明，纳米PCR是常规PCR检测技术敏感性的1,000倍以上，最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份临床送检的69份样品进行检测，结果均为阴性，表明该地区均无ASFV感染情况。2.2荧光定量PCR实时荧光定量PCR比常规PCR具有更高的敏感性和特异性，可同时快速检测大批量样品。King等[32](2003)、李维彬等[33](2007)、张泉等[34](2007)、黄萍等[35](2010)、Tignon等[36](2011)、李洪利等[37](2012)先后根据ASFVVP72基因，曾少灵等[38](2010)根据VP73基因，董志珍等[39](2009)根据P54基因各自设计引物和探针，建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法。McKillen等[40](2007)建立的实时荧光定量PCR分子信标(molecularbeacon)技术具有快速、特异性强、灵敏性和准确性高的特点。该检测方法可快速鉴别PRV、ASFV、PCV2和PPV。郭少平等[41](2010)根据ASFVK205R基因序列设计合成引物及TaqMan探针，建立了基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR检测方法。McKillen等[42](2010)根据9GL基因建立了MGB探针实时荧光定量PCR检测方法，最低可以检测到20拷贝 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 DNA。该方法检测临床样品中的ASFV，敏感性与OIE推荐TaqMan荧光定量PCR方法相当。Fernandez等[43](2013)利用通用探针库建立了ASFV的实时荧光定量PCR方法。陈静静等[44](2012)建立了双重荧光定量PCR，可同时检测CSFV和ASFV，只需一步即可完成，可作为鉴别两种病毒的诊断方法。王建华等[45](2016)根据ASFVCP530R基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)NSP2基因为靶序列，分别设计特异性引物和TaqMan-MGB探针，建立了一种可同时鉴别检测ASFV和HP-PRRSV的二重荧光定量RT-PCR方法。2.3重组酶聚合酶扩增(RPA)技术RPA是一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术，该方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠，王建昌等[46](2016)基于ASFVVP72基因保守序列设计并合成引物，建立了ASFVRPA等温检测方法，为ASFV的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。2.4线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)技术LATE-PCR是不对称PCR的一种形式，该方法用于检测组织样品的病毒，其敏感性可以达到大约1拷贝的病毒DNA。Ronish等[47](2011)基于ASFVVP72基因建立了LATE-PCR方法，为ASFV的实验室诊断提供了敏感的检测方法。2.5环介导恒温扩增(LAMP)技术LAMP技术操作简单、灵敏、快速，检测成本远低于荧光定量PCR，且不需要特殊仪器设备，具有较高的临床实用性。江彦增等[48](2009)、王彩霞等[49](2010)、杨吉飞等[50](2011)先后根据ASFVVP72基因序列设计引物，建立了快速检测ASFV的LAMP方法，最低检测限可达10拷贝质粒DNA，且具有良好的特异性。邬旭龙[51](2014)根据ASFVK205R基因序列设计引物，建立了LAMP检测方法。LAMP方法不需要PCR中的变性、退火 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 即可进行靶序列的循环扩增，不但大大缩短了时间，且使反应能够在恒温条件下进行，无需特殊仪器设备，肉眼判读，可以满足基层快速诊断的需要，非常适合于基层兽医实验室和养殖场使用。2.6探针杂交技术张鑫宇等[52](2011)针对ASFVVP72基因分别设计合成１条与保守区域互补的5'生物素标记及3'烷巯基修饰短链寡核苷酸探针，并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上，制备纳米金标记探针，将PCR扩增产物与生物素探针及纳米金标记探针进行杂交，杂交产物加入吸附链霉亲和素的酶标板，利用亲和原理，捕获杂交产物，银染增强法对纳米金标记探针进行信号放大，进而建立了检测ASFVVP72基因的纳米金探针杂交方法。探规模养猪MODERNSWINEINDUSTRY34针杂交技术检测灵敏度高，能有效排除PCR检测过程中的非特异性结果，省去了琼脂糖凝胶电泳步骤，操作简便、检测迅速，在酶标板中可批量反应，为ASFV核酸检测方法开辟了新的途径，但该方法的建立难度较高、操作较繁琐，对试验人员技术水平要求较高。3 小结近年来，随着世界经济和贸易全球化趋势的发展，一些严重危害动物和人类健康的跨国疫病接连发生，使我国现代农业、养殖产业受到了沉重的打击，严重影响了我国的经济和进出口贸易的健康发展。ASFV虽然尚未在我国发现，但从西非至东非、欧洲、亚洲传播的态势已经形成，该病对我国潜在的威胁也越来越大，是我国贸易中监测的重要疫病，必须保持高度警惕，严防该病入境。由于本病尚无有效的疫苗用于防控，因此研究并建立敏感、特异、快速的ASFV实验室检测对ASF的防控至关重要。目前，ASFV的检测技术主要有针对病毒DNA的核酸检测技术和基于病毒抗原、抗体反应的免疫学技术两大类。OIE推荐检测ASFV的方法主要有PCR、实时荧光定量PCR、ELISA等。用免疫学方法检测抗体可以了解ASFV感染、发生、发展的进程，但抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，故ELISA等抗体检测方法存在一定的局限性。PCR、实时荧光定量PCR、LAMP等分子生物学技术在猪感染ASFV的早期即可检测到病毒核酸，在ASFV的早期检测中具有重要作用。总之，ASFV的实验室检测方法多种多样，各有优缺点，但对各种方法的检测结果均要求准确、快速、敏感，这不仅对感染ASFV的动物治疗非常重要，而且对未感染的动物及时采取有效的预防措施同样具有重要的意义。随着免疫学与分子生物学技术的不断发展，ASFV的实验室检测方法必将不断完善，进一步为我国开展ASF的监测与综合防控提供技术支持。■参考文献：[1]WardleyRC,AbuElzeinEM,CrowtherJR,etal.Asolid-phaseenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionofAfricanswinefeverantigenandantibody[J].JHyg,1979,83(2):363~369.[2]PastorMJ,AriasM,EscribanoJM.Comparisonoftwoantigenforuseinanenzyme-linkedimmunosorbentassaytodetectAfricanswinefevervirusantibody[J].AmJVetRes,1990,51(10):1540~1543.[3]VidalMI,StieneM,HenkeLJ,etal.Asolid-phaseenzymelinkedimmunosorbentassayusingmonoclonalantibodiesforthedetectionofAfricanswinefevervirusantigensandantibodies[J].JVirolMethods,1997,66(2):211~218.[4]HutchingsGH,FerrisNP.IndirectsandwichELISAforantigendetectionofAfricanswinefevervirus:comparisonofpolyclonalandmonoclonalantibodies[J].JVirolMethods,2006,131(2):213~217.[5]Perez-FilgueiraDM,Gonzalez-CamachoF,GallardoC,etal.OptimizationandvalidationofrecombinantserologicaltestsforAfricanswinefeverdiagnosisbasedondetectionofthep30proteinproducedinTrichoplusianilarvae[J].JClinMicrobiol,2006,44(9):3114~3121.[6]GallardoC,ReisAL,Kalema-ZikusokaG,etal.RecombinantantigentargetsforserodiagnosisofAfricanswinefever[J].ClinVaccineImmunol,2009,16:1012~1020.[7]蒋正军,马世东,蔡丽娟,等.非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究[J].中国预防兽医学报,2000,22(1):107~113.[8]仇华磊.非洲猪瘟病毒VP72基因表达与ELISA检测方法的建立[D].扬州:扬州大学,2006.[9]朱红.非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立[D].扬州:扬州大学,2007.[10]李秋霞.非洲猪瘟病毒VP73基因和主要抗原表位区的原核表达及其ELISA检测方法的建立[D].杨凌:西北农林科技大学,2010.[11]曾少灵,廖立珊,唐金明,等.非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立[J].动物医学进展,2013,34(1):1~6.[12]靳雯雯.非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及其杆状病毒载体疫苗的构建[D].武汉:华中农业大学,2014.[13]董志珍,肖妍,赵祥平,等.检测非洲猪瘟McAb-ELISA竞争试剂盒的建立及初步应用[J].中国动物检疫,2012,29(4):37~40.[14]梁云浩,曹琛福,陶虹,等.非洲猪瘟病毒P54蛋白的真核表达及间接ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科学,2014,44(4):373~378.[15]邬旭龙,彭彬,姜睿姣,等.以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2016,38(10):800~803.[16]张倩,刘明团,任玮杰.非洲猪瘟ELISA抗体检测报告[J].中国畜牧兽医文摘,2012,28(1):49.规模养猪MODERNSWINEINDUSTRY35技术[17]邓飞,李丽,裴超信,等.阻断ELISA法检测非洲猪瘟抗体[J].四川畜牧兽医,2016,43(6):22~23.[18]张鑫宇,孙怀昌,刘文俊,等.非洲猪瘟病毒p72基因的纳米金探针研究[J].扬州大学学报:农业与生命科学版,2011,32(1):55~58.[19]刘波.非洲猪瘟病毒K205R基因的原核表达及金标试纸的初步研制[D].成都:四川农业大学,2014.[20]吴海涛.非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[D].扬州:扬州大学,2015.[21]MalmquistWA,HayD.HaemadsorptionandcytopathiceffectproducedbyAfricanswinefevervirusinswinebonemarrowandbuffycoatcultures[J].AmJVetRes,1960,21(21):104~108.[22]PanIC,ShimizuM,HessWR.Africanswinefever,microplaqueassaybyanimmunoperoxidasemethod[J].AmJVetRes,1978,39(3):491~497.[23]PastorMJ,AriasM,AlcarazC,etal.AsensitivedotimmunobindingassayforserodiagnosisofAfricanswinefeverviruswithapplicationinfieldconditions[J].VetDiagnInvest,1992,4:254~257.[24]MarcoMFD,SalgueroFJ,BautistaMJ,etal.AnimmunohistochemicalstudyofthetonsilsinpigswithacuteAfricanswinefevervirusinfection[J].ResVetSci,2007,83(2):198~203.[25]AgueroM,FernandezJ,RomeroL,etal.HighlysensitivePCRassayforroutinediagnosisofAfricanswinefevervirusinclinicalsamples[J].JClinMicrobiol,2003,41(9):4431~4434.[26]曾少灵,花群义,张彩虹,等.非洲猪瘟病毒PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2009,30(10):6~10.[27]AgueroM,FernandezJ,RomeroL,etal.Ahighlysensitiveandspecificgel-basedmultiplexRT-PCRassayforthesimultaneousanddifferentialdiagnosisofAfricanswinefeverandclassicalswinefeverinclinicalsamples[J].VetRes,2004,35(5):551~563.[28]张倩.非洲猪瘟病毒和古典猪瘟病毒双重PCR及双重荧光PCR检测方法的建立与应用[D].扬州:扬州大学,2010.[29]BastoAP,PortugalRS,NixRJ,etal.DevelopmentofanestedPCRanditsinternalcontrolforthedetectionofAfricanswinefevervirus(ASFV)inOrnithodoroserraticus[J].ArchVirol,2006,151:819~826.[30]GiammarioliM,PellegriniC,CasciariC,etal.Developmentofanovelhot-startmultiplexPCRforsimultaneousdetectionofclassicalswinefevervirus,Africanswinefevervirus,porcinecircovirustype2,porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcineparvovirus[J].VetResCommun,2008,32:255~262.[31]崔尚金,胡泉博,刘业兵.非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国预防兽医学报,2012,34(10):807~809.[32]KingDP,ReidSM,HutchingsGH,etal.DevelopmentofaTaqManPCRassaywithinternalamplificationcontrolforthedetectionofAfricanswinefevervirus[J].VirolMethods,2003,107:53~61.[33]李维彬,蒋正军,王玉炯,等.非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].宁夏大学学报(自然科学版),2007,28(1):56~59.[34]张泉,朱鸿飞,孙怀昌.非洲猪瘟病毒常规PCR及R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