第11章基因组学与比较基因组学

基因组与比较基因组学第11章　什么是基因组，基因组学？ 基因组（Genome）：是指生物体的单倍体细胞中所有的DNA，包括细胞核内的DNA和各种细胞器中的DNA，是生物体内遗传信息的集合。 基因组学（genomics）：是研究并解析生物体整个基因组所有遗传信息的一门学科。*基因组学这一名词是美国人T·H·Rodehck在1986年7月造出来的，与一个新的杂志genomics一道问世。 结构基因组学 功能基因组学 比较基因组学基因组学的发展：从序列到功能结构基因组学结构基因组学：基因组计划 基因组作图 测定核苷酸序列 基因定位功能基因组学功能基因组学：后基因组学（postgenomics) 利用结构基因组学提供的 信息和产物，在基因组系 统水平上全面分析基因的 功能的一门学科。 比较基因组学比较基因组学：研究不同物种之间在基因组结构和功能方面的亲源关系及其内在联系的学科。基因组计划的主要任务是获得全基因组序列；现在的测序方法每次只能测800-1000bp，大量的测序片段要拼接；要知道序列在染色体上的位置才能正确拼接，因此需构建基因组图谱。教学内容 一、高通量DNA序列分析技术 二、人类基因组计划 三、比较基因组学DNA序列分析技术DNA序列分析鸟枪法测序技术及其改良一、高通量DNA序列分析技术（一）DNA序列分析技术 DNA序列测定： 是指DNA一级结构的测定，是在核酸酶学和生物化学的基础上，创立并发展起来的一门重要的DNA技术学。DNA序列测定的技术 杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA芯片法经典方法:双脱氧链末端终止法(Sanger,1977)DNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法: 是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。 利用双脱氧核苷酸作为链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法。1980年诺贝尔奖金获得者F.Sanger1、双脱氧链末端终止法*（1）Sanger双脱氧链末端终止法测定DNA序列的基本原理： 以DNA合成反应为基础，加入ddNTP生成特定末端不同长短的DNA片段； 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，在DNA合成反应中，加入ddNTP，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-P端形成3′、5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP。*ATP、dATP和ddATP的结构 这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和4种dNTP（其中一种为α-32P标记），将此反应物分为4等份，每份内加入一定比例的一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可形成以一种ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段。PEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystemsTHEPROCESSPEAppliedBiosystemsDNA模板ATTGCAGTCGAC生成的新链TAACGTCAGCTGT管：C管：TAACGTCAGCTTAACGTCAGCTAACGTTAACGTCTTAACG管：A管：TAACGTCAGCTGTAACGTCATAACGTCAGTAATAACGTA TAACGTCAGCTG TAACGTCAGCT TAACGTCAGC TAACGTCAG TAACGTCA TAACGTC TAACGT TAACG TAAC TAA TA T（2）双脱氧末端终止法主要步骤 单链DNA模板的制备 DNA模板与测序引物退火 延伸-终止反应 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射性自显影 阅读测序结果 将DNA克隆到质粒载体 将DNA克隆到M13噬菌体载体 将DNA克隆到酵母人工染色体——基因组DNA大片段文库 PCR双脱氧链末端终止法要求单链作为模板如何得到单链DNA？2、DNA测序自动化 DNA测序的自动化是在Sanger的双脱氧链末端终止法的基础上在1987年由美国应用生物系统公司进一步发展起来的激光测序法，其基本原理与末端终止法一样，都是通过ddNTP竞争性的终止新合成的DNA链。DNA测序自动化步骤：4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物电泳分离激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序PEAppliedBiosystemsdNTPPEAppliedBiosystemsTHEPROCESSPEAppliedBiosystems以荧光化合物标记双脱氧核苷酸的自动测序*（二）鸟枪法测序技术及其改良 基因组的每条染色体长度可达数百万碱基对以上，将链终止法测定的小片段DNA组装成真实的排列顺序是一项浩繁而精细的工作。 DNA顺序的组装主要方法： 全基因组鸟枪法测序 改良鸟枪法：大片段克隆法、靶标鸟枪法1、全基因组鸟枪法测序鸟枪法的顺序组装是直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠，然后依次向两侧邻接的序列延伸。DNA的鸟枪法测序的主要步骤 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。 第二，高效、大规模的末端测序。 第三，序列集合。 第四，填补缺口。鸟枪法测序示意图*鸟枪法的优势：鸟枪法的主要优势在于：测序速度快，并且无须提供相关的遗传图谱和物理图谱。20世纪90年代末，用鸟枪法在较短时间内成功地完成了流感嗜血杆菌的基因组测序，引发了一场微生物基因组测序的热潮。这些研究项目的实施， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明鸟枪法测序可以组建一条流水工作线，一个科研小组可以分工合作，一部分人专门负责制备DNA，一部分人负责测序和数据分析。经验证明，一个5Mb大小基因组的测序可以在一年内完成。*鸟枪法的局限： 拼接组装困难：对于结构复杂的大基因组而言，鸟枪法的序列组装的起始阶段工作量非常大。。 重复序列的存在：在序列组装时可能出现错误连接，使某些片段从原位置跳到另一无关位置。因此，对于缺少重复顺序的小基因组（<5Mb）而言，鸟枪法仍为最佳的选择，但对于大基因组而言，还需要更加有效的策略。*2、改良鸟枪法 （1）大片段克隆法： 将基因组DNA分解为若干个较大的DNA片段，构建基因组文库；根据克隆插入子两端的DNA序列查找与之连接的克隆建立重叠群；每个克隆可以独立进行鸟枪法测序；依据克隆重叠群进行序列组装这种方法又称为克隆重叠群测序法。克隆重叠群大片段克隆法 （2）靶标鸟枪法 根据染色体上已知基因或遗传标签的位置来确定部分DNA片段的排列顺序，再逐步确定各片段在染色体上的相对位置，是建立在基因组图谱基础上的”鸟枪法”。教学内容 一、高通量DNA序列分析技术 二、人类基因组计划 三、比较基因组学二、人类基因组计划 人类基因组计划（Humangenomeproject）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。（一）人类基因组计划概述1988年美国能源部和国家卫生研究院率先在美国开展人类基因组计划，并经国会批准由政府给予资助。此后，成立了一个国际间的合作机构——人类基因组织(HumanGenomeOrganization)，由多个国家筹集资金和科研力量，积极参加这一国际性研究计划。1989年，美国国立卫生研究院成立了人类染色体研究中心，沃森出任第一任主任。 1990人类基因组计划起动； 1995第一个原核生物（细菌）基因组测序完成； 1996第一个真核生物（酵母）的基因组测序完成； 1998第一个多细胞生物（线虫）的基因组测序完成； 2000果蝇和拟南芥的基因组测序完成； 人类和水稻的第一张基因组草图完成； 2001人类基因组测序（精细图）完成； 水稻（籼稻和粳稻）基因组草图完成。 2003年4月，人类基因组序列图（完成图）完成。人类基因组计划的进展状况二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成 2000年6月26日，美国总统克林顿(中)、塞莱拉公司董事长兼首席科学家克雷格·文特尔(左)和人类基因组计划首席科学家弗胡西斯·柯林斯(右)在华盛顿白宫参加庆祝人类基因组草图绘制成功。人类基因组计划的科学意义 （1）确定人类基因组中约数万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。 （2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。 （3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。 （4）研究空间结构对基因调节的作用。 （5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。 （6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，为疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。 （7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。遗传图、物理图、转录图、序列图（二）人类基因组计划的工作任务*1、遗传图 遗传图概念： 又称连锁图，是指采用遗传学技术构建显示基因或DNA分子标记在基因组上相应位置和遗传距离的图谱。遗传作图是将每条染色体上的基因或DNA标记的相对位置经连锁分析确定下来，构成图谱，因此，需借助相应的遗传标记。遗传作图遗传图谱的标记是什么呢？标记1标记2标记3染色体上的基因和DNA序列均可作为路标,他们由特定的DNA顺序组成.路标位于染色体上的位置是固定的，不会更改的，从而而提供了作图的依据。遗传标记 最早的遗传标记——基因 第一代遗传标记——限制性片段长度多态性 第二代遗传标记——简单序列长度多态性 第三代遗传标记——单核苷酸多态性（1）基因是首先被使用的标记 孟德尔→豌豆植株高矮、豌豆的形状等 摩尔根—显微镜、肉眼→果蝇躯体颜色、翅膀形状等 生化表型→细菌、酵母遗传学研究；人类中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白 基因是非常有用的标记，但并不是理想的，基因标记的缺点： 1、可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉及多基因。 2、高等生物基因组中存在大量的基因间隔区，遗传图中留下大片的无标记区段。 3.只有部分基因其等位基因成员可以通过常规实验予以区分，因而产生的遗传图是不完整的。（2）限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP） 最早发现的DNA分子标记： 指同一物种的亚种、品系或个体间基因组DNA受到同一种限制性内切酶作用而形成不同的酶切图谱的现象，称为限制性片段长度多态性（RFLP)。 限制性片段长度多态性是由于基因组DNA某一位点上的变异引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变（原有位点的消失或出现新的酶切位点），致使酶切片段长度随之发生变化而产生。RFLP多态性的产生与检测RFLP的优点 （1）遍布于整个基因组，位置相对固定； （2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和杂合子； （4）结果稳定、可靠；共显性:两个亲本的性状在子代个体中同时出现，没有显隐关系。限制性片段长度多态性的缺点 制备可表现基因组DNA多态性的探针较为困难； DNA需要量大，实验操作较繁锁，检测周期长成本费用也很高； RFLP分子标记分布密度过于稀疏，现已逐步被其他类型分子标记所取代。 RFLP是最早发现的分子标记，也被称为第一代分子标记。 又称串联重复序列，其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化，包括小卫星DNA和微卫星DNA。 小卫星DNA—由15-65bp的基本单位串联重复而成，长度一般不超过20kb。重复次数（小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的；按照孟德尔的规律遗传 微卫星DNA/简短串联重复（STR、STRP或SSLP），重复单元2-8bp，通常重复10-60次 GCTTATATATATATATATATATATATAAGCT（3）简单序列长度多态性微卫星序列（SSR）如何检测SSR根据简单重复顺序两侧的序列MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714246430304_2引物,经聚丙烯胺凝胶电泳分辩.SSR标记的优点 （1）在基因组中随机分布，检测的多态性频率高； （2）PCR特异引物，重复性好； （3）共显性，操作相对简单。SSR标记的缺点 （1）SSR需要测序和设计引物，因而需要大量的人力、物力和时间； （2）另外其种属特异性强，开发所需的费用高昂。SSLP标记又称为第二代分子标记（4）单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）SNP是指同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差异的现象。其中最少一种在群体中的频率不小于1％；如果出现频率低于1％，则视作点突变。人类99．9％的基因密码是相同的，而差异不到0．1％，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础。SNP与RFLP和STR标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。连锁互换定律的基本内容 位于同一染色体上的两个或两个以上的基因遗传时，常有连在一起遗传的倾向——连锁； 但在配子形成过程中，同源染色体的非姊妹染色单体间发生局部交换的结果导致重组类型的产生——互换（重组）； 连锁的频率大于重组的频率。遗传作图——连锁互换分析ABAbaBab(25)(25)(25)(25)(50)(0)(0)(50)(48)(2)(2)(48)配子类型(%)独立遗传孟德尔第二定律完全连锁不完全连锁连锁遗传定律ABABabab×遗传作图——连锁互换分析 基因（遗传标记）在染色体上的位置是相对恒定的，它们之间的重组率也是相对恒定的，不同基因之间的重组率不同。 相邻的两个基因（遗传标记）由于重组而分开的概率将低于距离较远的两个，所以重组率的大小可反应它们之间在染色体上距离的远近； 因此可通过基因重组率的计算来估算基因（遗传标记）间的遗传距离。 遗传图距的单位：厘摩（cM）——每单位厘摩为1％重组率 如果两个基因间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 计算出不同基因（遗传标记）之间的重组率，就可以构建出显示基因在染色体上相对位置的图——遗传图谱。遗传作图的主要方法 杂交实验 家系分析杂交实验的连锁分析的程序:选择已知基因型的亲本→设计杂交 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 →获得交配的子代→分析其表型及基因型玉米中的连锁遗传有色饱满X无色皱缩CS/CScs/cs↓测交：F1CS/csXcs/cs（双隐性）↓CS/csCs/cscS/cscs/cs有、满有、皱无、满无、皱自由组合预期：1111实验结果：40321491524035亲组合重组合96.4%3.6% 重组率绘制遗传图重组率为测量基因之间相对距离的尺度. 与经典遗传作图类似，只是统计性状改为DNA分子标记。程序：选择已知基因型的亲本→设计杂交方案→获得交配的子代→分析其DNA分子标记DNA分子标记遗传图绘制 物理图概念： 采用分子生物学方法直接将基因或DNA分子标记标定在基因组实际位置的图谱。 以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-taggedsite,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。2、物理图STS作图的原理 两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。 两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来算。STS作图原理图示* 通过PCR或分子杂交检测含有标记的STS克隆，根据重叠的STS标记可绘制克隆连锁图。物理作图3、转录图 以EST（expressedsequencetag，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500bp左右。4、序列图（分子水平的物理图） 序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图。（三）人类基因组计划后续 1、人类基因组测序结果：(1)人类遗传基因数量比原先估计的少很多。目前研究表明，人类基因组中约有3万至4万个蛋白编码基因，仅仅是果蝇基因数目的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。(2)人类99.9％的基因密码是相同的，而差异不到0.1％，不同人群仅有140万个核苷酸差异——SNP。2、人类基因组计划的伦理学A)个人DNA顺序的隐私权，如：“次等”基因携带者可能受到岐视，职业限制，医疗保险等问题。B)基因专利问题。教学内容 一、高通量DNA序列分析技术 二、人类基因组计划 三、比较基因组学三、比较基因组学 概念：是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。 由于生物在进化上是相互关联的，对一种生物的研究可以为其它生物提供有价值的信息。 与数据库中已知序列比较，基因组的序列可分为3类: 1、确知其生理功能的; 2、有相匹配的蛋白质序列，但并不知道其功能的; 3、找不到任何相匹配的蛋白质序列的新基因。比较基因组学的威力就在于它能根据对一种生物相关基因的认识来理解、诠释甚至克隆分离另一种生物的基因。远缘基因组间的比较为认识生物学机制的普遍性，寻找研究复杂生理和病理过程所需的实验模型提供了理论依据，而近缘基因组间的比较则为认识基因结构与功能等细节提供了参数。 小结 学校三防设施建设情况幼儿园教研工作小结高血压知识讲座小结防范电信网络诈骗宣传幼儿园师德小结 掌握： 基因组、基因组学、DNA序列分析技术的基本概念，HGP的四张图。 熟悉： 双脱氧链终止法测序的基本原理、鸟枪法拼接序列的原理及基本策略，DNA遗传标记的种类。*基因组学这一名词是美国人T·H·Rodehck在1986年7月造出来的，与一个新的杂志genomics一道问世。********