双水相萃取的应用

双水相萃取的应用twoaqueousphaseextraction主讲人：宋孟娇组员：于宝云刘红高健云李洋王立华刘永花孙越陈美静李志鹏双水相萃取　　　双水相系统：因两种水溶性聚合物水溶液或一种水溶性聚合物的水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。　　特点：因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成。萃取原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：K=C2/C1其中K为分配系数，C2和C1分别为被分离物质在上、下相的浓度。生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。　分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。　　　　可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙醇(PEG)/葡聚糖(Dx)，聚丙二醇/聚乙二醇和甲基纤维素/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。　　除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。双水相体系　　常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/Dx体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。　　(2)与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。　　(3)聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。　　(4)可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。　　(5)能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合，即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生产。　　(6)亲和萃取(亲和分配)可大大提高分配系数和萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等粒子的提取。双水相萃取技术:　　双水相萃取技术是一种高效温和的新分离技术,在生物制药、分析检测、稀有金属分析等方面均有应用,特别是在生化分离工业中,比传统的萃取方法有着更加明显的技术和条件优势。双水相萃取技术的应用　　双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。到目前为止，双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面：　　(1)提取酶和蛋白质。这是双水相体系研究和应用最多的方面，发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可用双水相体系来提取。工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶，绝大多数是用PEG作上相成相聚合物，葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。案例　　采用聚乙二醇/聚丙烯酸双水相萃取体系萃取分离肌红蛋白和卵白蛋白。研究了聚合物的分子量、pH、温度的影响。实验表明，蛋白富集在上相的聚乙二醇相中，随着PEG分子量和温度的增加，分离的蛋白质量减少。当分离条件为PEG4000-聚丙烯酸、温度20℃、pH8.0时，蛋白质得到了很好的分离，提取分离到的肌红蛋白和卵白蛋白百分含量分别为95.2%和87.4%。　　(2)进行萃取性生物转化。应用实例有：利用葡萄糖和淀粉生产乙醇、利用葡萄糖生产丙酮丁醇、利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖、水解酪蛋白、发酵生产乳酸、将青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸等。　　(3)食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质。在生物技术方面，可用来提取DNA。　　(4)萃取细胞、细胞器、膜等粒子。大多数都是用亲和萃取方法来达到目的的。　　(5)应用于液-液分配层析(LLPC)。将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物)上，另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混合物。　　（６)应用于金属离子分离中：传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来，利用双水相技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。　　用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋酶素与菌体分离后进行提取，可实现全发酵液萃取操作，采用PEG/Na2HPO4体系，最佳萃取条件是PH=8.0~8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小试收率达69.12％，对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53.14%。　　(７)中草药中有效成分的提取：近年来有关双水相提取天然药物中有效成分的报道逐年增多。以乙醇-磷酸氮二钾-水双水相体系萃取甘草有效成分，在最佳条件下，分配系数(K)达12.8，收率(Y)高达98.3%。用双水相萃取体系富集分离银杏叶浸取液的研究，也有良好的分配系数和分离效果。　中药中含有大量的有机化合物且成分十分复杂，提高中草药中有效成分提取及分离技术对我国中医中药进入国际市场有很大的促进作用。中草药有效成分分子中多具有疏水性结构，因此双水相萃取技术在中草药有效成分分离纯化中具有一定的应用价值。案例　　利用聚乙二醇(PEG)-硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系从酸性溶液中萃取分离金。试验考察了萃取体系中的pH值、PEG和(NH4)2SO4的质量分数、PEG的聚合度、萃取温度等条件对萃取率的影响;经过三级萃取,金萃取率达到97.56%,富集金的PEG相无需反萃取可直接用Zn置换出单质金,还原率达到95.16%。双水相萃取为回收废弃印刷线路板中的金提供了一种新的可行方法。不同的双水相体系对天冬氨酸转氨酶的萃取分离效果，对聚乙二醇/无机盐成相系统进行丁系统的研究，确定PEG1000/NazHP04为研究体系，并考察体系pH值、无机盐对双水相体系分配系数和纯化系数的影响。当PEG1000的质量分数为18%,NazHP04的质量分数为20%时，双水相体系对天冬氨酸转氨酶的分离系数和纯化系数分别为2.36和2.940对三种双水相体系进行研究，通过制作相图，分析得出PEG（/NH4）2SO4双水相体系是萃取糖化酶最合适体系。研究PEG分子量、PEG溶液浓度、（NH4）2SO4溶液浓度对糖化酶分配系数、回收率影响，确定萃取糖化酶最佳条件，即PEG分子量为20000、PEG溶液浓度为28%、（NH4）2SO4溶液浓度为20%时，分配系数为0.15，糖化酶回收率最高为96.1%。利用PEG600（/NH4）2SO4双水相系统萃取木瓜蛋白酶。结果发现在PEG600百分含量为27%、（NH4）2SO4百分含量为21%、pH7.0和温度60℃时，木瓜蛋白酶分配系数达到最大，为9.28。用双水相萃取法从工业粗酶粉中分离纯化α–淀粉酶。实验表明，由21%~22%PEG400和14%~17%(NH4）2SO4所组成双水相体系，在室温下对α–淀粉酶的酶活回收率可达94.84%，分配系数可达17.1。另外，还有双水相萃取果胶酶、无花果蛋白酶、粗状假丝酵母脂肪酶等研究，也都取得满意结果运用双水相技术分离提取钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白，对构成双水相体系中不同分子量PEG和酒石酸钾钠浓度影响进行分析。确定双水相组成体系为16%PEG2000和25%酒石酸钾钠、pH值为6.0，在此体系中藻蓝蛋白主要分布在上相，最高纯度3.69、分配系数20.7、回收率94.56%。多次双水相萃取有利于藻蓝蛋白纯度提高，3次双水相萃取后，藻蓝蛋白纯化倍数达4.15。用阴阳离子型表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和十二烷基硫酸钠（SDS）表面活性剂体系形成双水相，萃取大豆蛋白水解液中L–苯丙氨酸。结果表明，当双水相体系CTAB与SDS摩尔比为0.256、提取液中初始苯丙氨酸含量为2mg/mL、Na2SO4浓度为0.23mol/L时，萃取率最高可达96.9%。亲水性离子液体四氟硼酸1–丁基–3–甲基咪唑（[Bmim]BF4）和NaH2PO4制备双水相体系，萃取分离苋菜红。结果表明：NaH2PO4加入量为2~2.5g、离子液量为1.0~2.0ml、苋菜红溶液量为1.5ml、溶液pH值4~6时，离子液体双水相体系对苋菜红具有较高萃取率（＞90%）。用聚乙二醇―硫酸铵双水相体系分离常见食用色素叶绿素铜钠盐（SCC），总量为50ml、10%SCC溶液体积为1.0ml、聚乙二醇浓度为30%、硫酸铵10.0g、表面活性剂TritonX–1001.0ml，在中性或微碱性条件下，常见离子不干扰SCC萃取，萃取率达97.98%。利用乙醇/硫酸铵组成双水相体系测定粮食中钼含量。该法利用乙醇增敏作用提高体系吸光度，消除常见离子铁干扰，具有较高选择性和灵敏度。在乙醇―硫酸铵双水相体系中，所形成粮食与油脂乙醇相对钼与水杨基荧光酮红色络合物具有增敏作用，方法检出限（3S/N）为0.06mg/L，回收率为97.4%~100.1%。　　甘草是一种应用价值很高的中草药，甘草的主要成分是具有甜味的皂苷——甘草皂苷。基于与水互溶的有机溶剂和盐水相的双水相萃取体系具有价廉、低毒、较易挥发等特点，采用与水互溶的有机溶剂的新型双水相体系萃取研究从甘草中提取甘草酸盐的新工艺，结果提取甘草酸盐的最佳溶剂为乙醇/磷酸氢二钾双水相体系，此体系的两相分配完全，分配系数达12.8，收率为98.3%。此双水相体系具有无需反萃取和避免使用黏稠水溶性高聚物等特点，易回收、易处理、操作简便。　　中药黄芩是一种疗效确切的传统中药，黄芩苷是黄芩主要有效成分,通过采用非离子表面活性剂聚乙二醇-磷酸氢二钾-水双水相体系分离纯化黄芩苷，萃取率为98.6%。此方法所形成双水相体系操作简便，萃取率高，方法重复性好，可适用工业化生产。　　采用微胶囊与双水相联合萃取技术提取柑桔精油。通过调整β-环糊精和硫酸钠的浓度比，可有效控制囊化萃取物中柑桔精油的质量，总收率高达96%以上。将微胶囊技术和双水相萃取技术相结合用于提取柑桔精油，不仅能提高柑桔精油的提取率和纯度，而且还能避免提取过程中的高温、氧化、聚合等情况的发生，有效地保护柑桔精油的天然组分。双水相萃取提纯白黎芦醇　　首先进行了双相体系的选择，然后考察双相萃取虎仗的提取也结果和有机溶剂萃取虎仗提取液的结果。两种体系萃取结果比较后得出：双相萃取时白藜芦醇的损失率为7.72%。稍高于有机溶剂萃取的损失率5.81%，但是双相萃取中白藜芦醇含量达34.29%，其含量高出有机溶剂萃取的5.81%。因此双水相体系可替代氯仿/水体系对虎仗提取液进行初步分离，方便产品进一步的富集。　　双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和纯度的有效成分的新型分离技术。目前利用双水相萃取技术从食品及发酵工业生物材料中提取有效成分的研究已经引起了人们的重视。由于这些生物材料中所含的化合物众多，而双水相萃取技术具有较高的选择性和专一性，因此，利用这项技术有希望为从食品及发酵工业生物材料中提取有效成分开辟了一条崭新的思路。双水相萃取技术工业应用上的问题　　但是,双水相萃取技术目前仍不是十分成熟,理论及技术均存在一定的问题。尽管双水相体系的分配机制已成为研究重点,但并未彻底清楚;体系的物理、化学性质还未完全了解,导致难以达到最佳萃取条件,因而应用有限。　　成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品，价格很高，用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高，使分离困难。新型双水相系统的开发：　　在生物物质分离过程中得到应用的双水相系统有2类：非离子型聚合物/非离子型聚合物/水系统和非离子型聚合物/无机盐/水系统。因为这2类系统所用的聚合物无毒性,己被许多国家的药典所收录,而且其多元醇、多元糖结构能使生物大分子稳定。五、双水相萃取技术进展及展望　　但在实际应用中,这2类双水相系统各有优缺点,前者体系对生物活性物质变性作用低,界面吸附少,但是所用的聚合物如葡聚糖价格较高,而且体系黏度大,影响工业规模应用的进展；后者成本相对低,黏度小,但是由于高浓度的盐废水不能直接排入生物氧化池,使其可行性受到环保限制,且有些盐对敏感的生物物质会在这类体系中失活。　　因此,寻求新型双水相体系成为双水相萃取技术的主要发展方向之一,新型双水相体系的开发主要有廉价的双水相系统及新型功能双水相系统。　　　　　　　廉价双水相系统的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用昂贵的高聚物,如采用变性淀粉、麦芽糊精、阿拉伯树胶等取代葡聚糖,羟基纤维素取代PEG等。　　对新型双水相系统的探索有：PEG/UCON(乙烯基氧与丙烯基氧共聚物的商品名）/水体系、UCON/水体系、EOPO[环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的随机共聚物简称EOPO]/羟基淀粉/水体系和EOPO/水体系等。这些体系分相的依据仍是聚合物之间的不相溶性,但此性质与特定的临界温度有关。此类双水相系统也被称作热分离型双水相系统,它们的优点之一是聚合物易于回收可实现循环利用。〔参考文献〕〔1〕吕斌，陈有容，陈舜胜.双水相萃取技术及其在生物食品工业中的应用[J].食品与发酵工业，2001，27（6）：70―74.〔2〕LiL，LiuF，KongXX，etal.Investigationofaliquid–liquidextractionsystembasedonnon–ionicsurfactant–salt–H2Oandmechanismofdrugextraction[J].AnalyticaChimicaActa，2002，452：321―328.〔3〕周莉，汤皎宁，陈群英，等.SDBS/TTAC混合表面活性剂双水相体系性质的研究[J].精细化工，2008，25（3）：226―230.等