免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。二、操作步骤：将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片lh左右。脱蜡：二甲苯I10min-二甲苯II10min-梯度酒精(由高到低)各5min。1XPBS洗涤3次，每次5min。0.5%TritonX-100通透(PBS配制)，目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了，如果
检测
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的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min,之后转成低火15-30min。注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K)热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。1XPBS洗涤3次，每次5min。3%H2O2,室温孵育30min,目的是灭活内源性过氧化物酶。1XPBS洗涤3次，每次5min。使用1%BSA进行室温封闭30min,用于封闭非特异性抗原表位。根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C湿盒中静置过夜孵育。次日取出切片，室温下复温30min。lXPBS洗涤3次，每次5min。按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。DAB显色：DAB显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min(根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间)-流水清洗lmin-1%盐酸酒精分化瞬时-流水清洗1min-1%氨水反蓝瞬时一流水清洗lmin。脱水：梯度酒精(由低到高)各5min-二甲苯I10min-二甲苯II10min。中性树胶封片。三、免疫组化结果分析原则及具体方法必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。（3）阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分,有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。（4）尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。（5）定性分析：即用“＋”和“－”来表示染色结果。可将实验组织分为阳性组和阴性组，然后对两组的其它指标进行统计分析。这种分类方法是最简单的一种，一般意义也较小些。（6）半定量分析：即用“＋＋＋”、“＋＋”、“＋”和“－”来表示染色结果。其分组的标准在不同的文献中有不同的描述；一种是以着色细胞的密度来进行计算的：如阳性细胞占一个视野（高倍或低倍）中所有细胞总数的25%以下为“+”，25%〜50%为“+＋”，＞50%为“＋＋＋”；另一种是数量再结合着色细胞的颜色浓度来计算，在着色细胞百分率基本相同的实验中，“+”为浅染的棕黄色（DAB染色），无明显颗粒；“++”为较深的棕黄色，可见明显颗粒；“+++”为深棕黄色并且有浓染颗粒出现。（7）定量分析：即用数字来表示染色结果。也就是在显微镜下（通常是高倍视野）计数阳性细胞个数（或者血管条数等等）。计数最好是两人或多人同时通过多人共览显微镜进行，并且
要求
对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗
有相同的计数标准。同一张切片选择多个视野（3〜5个），然后取所有人的计数结果的平均值。这种方法较前一种为准确，但在视野的选择、计数的标准上也有一定的主观因素干扰。
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