地西泮的质量研究

地西泮的质量研究 华中科技大学 硕士学位论文 地西泮的质量研究 姓名:江莹 申请学位级别:硕士 专业:药物分析学 指导教师:江明;姜 红 2010-11-09 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 地西泮的质量研究 研究生:江 莹 导 师:江 明(讲师)姜 红(教授) 中文摘要 本课题系统地对地西泮及制剂的质量控制方法进行了研究。建立了地西泮有 关物质分析方法;确证了其中三个有关物质的结构;研究了影响其固体制剂 和液 体制剂质量的主要控制项目。为地西泮及其制剂质量标准的提高、不同生产 企业 产品的质量评价以及该品种的生产过程控制提供了基础和依据。 课题分为三部分: 一、原料的主要质量控制方法及杂质对照品研究。建立了 地西泮有关物质的 RP-HPLC分析方法;采用LC-MS联用技术和定向合成技术,对所含的主要杂质进 行了研究,得到了地西泮3个杂质并确证了其结构;测定了其对于地西泮的响应 因子并标化了杂质对照品。本研究为该品种的系统质量研究及评价奠定了基础。 二、固体制剂溶出特性研究。建立了新的溶出度测定方法。采用 4 个不同 pH的溶出介质,考察不同厂家的地西泮片的溶出特性,采用f2因子法对其溶出 行为进行评价。结果显示国内不同厂家样品的溶出行为差别较小,但发现中国药 典原溶出度测定方法不能反映溶出特性的差异。本研究为中国药典溶出度检查方 法的修订以及该固体制剂的溶出特性评价提供了依据。 三、液体制剂中防腐剂研究。建立了地西泮注射液中防腐剂苯甲醇的定量方 法并对处方的合理性进行了探讨。本研究为将液体制剂中非活性成分的控制纳入 质量标准的必要性提供了依据。 【关键词】地西泮;有关物质;响应因子;溶出度;苯甲醇;RP-HPLC;LC-MS 1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Studies On Quality For Diazepam Candidate:Jiang Ying Supervisor:Jiang Ming Jiang Hong Abstract The paper systematically studied on quality for Diazepam and its preparations.The method for the test of related substances in diazepam was developed and validated.Structures of three related substances were determined.This paper also did a series of work in the key link of quality control of the solid and liquid preparations .The whole work provided reference for the reinforcement of the National Drug Standard,as well as for the quality-evaluation and the quality-control in the processing of diazepamThe paper consisted of three parts: First, study on the main methods for quality control of APIActive Pharmaceutical Ingredient,as well as the reference substances of the impurities.Established an RP-HPLC method for the analysis of related substances in diazepam.The validation result showed that this method was convenient,sensitive,and had a good specificity.Subsequently,we analyzed the crude products and decomposable compounds of diazepam by LC-MS,determined three related substances,prepared them by rational synthesis and determined their molecular structures by UV,IR,MS,NMR.Then,the purities of these related substances were calculated and the response factors were also determined for the selection of the quantative methods of these related substances Second,study on the dissolution property of diazepam tablets. Developed a new 2华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 method for dissolution test,carried out the tests in four mediums with different pH values,and evaluated the dissolution properties of the tablets produced by different factories by f2 factor. The results indicated that a small variation existed in the dissolution properties of these tablets,but also showed that the method in Ch.p could not reflect the dissolution differences.The study provided suggestion and reference for the dissolution method revision and evaluation for the dissolution of solid preparationsThird,study on preservative in liquid preparation.Set up and validated the determination method for benzyl alcohol,which acted as preservative in diazepam injection.Discussed the rationality and scientificalness of the prescription.The study provided reference for the necessity to incorporate the control of inactive components of liquid preparations into the National Drug Standard【Key Words 】 Diazepam, Related Substance, Response Factor,Dissolution, Benzyl Alcohol, RP-HPLC, LC-MS 3独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何 其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人 和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的 一切 法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅 和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前 言 地西泮又名安定,是于上个世纪六十年代上市的一种苯二氮卓类药物,于七 十年代用于临床,属于国家管制的二类精神药品。 苯二氮卓类药物在治疗剂量具有镇静、催眠、抗焦虑,以及抗惊厥、抗震颤 和中枢性肌肉松弛作用,临床上常用于治疗失眠、焦虑、癫痫等;但过量服用可 能会导致严重的不良反应,如共济失调、昏迷、呼吸抑制等;长期服用会产生 耐 [1] 受性,依赖性及成瘾性 。 随着社会生活步伐的加快和工作压力的增加,睡眠障碍和焦虑问题日益增 多,本类药物临床需求量及滥用现象也呈上升趋势。为了保证患者服药的安全性, 有效性,在质量检测这个环节上,应建立完善的药品标准,从各方面实现严格的 监控。 目前国内外对于地西泮及其他苯二氮卓类的药物研究,主要在苯二氮卓相关 [2]-[4] [5]-[7] 受体 和药理作用 等方面,而对其质量控制,尤其是有关物质分析方面的 的研究文献很少。 本课题分为三部分: 1. 地西泮有关物质分析及杂质对照品研究 药品中的有关物质泛指在药品的生产和(或)贮存过程中产生的工艺杂质或 [8] 降解产物 。有关物质的分析应考虑合成生产过程中的中间体、副反应产物,以 及贮存过程中的降解等因素,多采用色谱法分析,如 TLC,HPLC,GC,CE, 随着分析技术的发展,色谱-质谱联用也越来越多的应用于该项检查,在定量同 时还可获得结构信息。 目前我国药品标准多采用不加校正因子的主成分自身对照法,控制有关物质 的总量和(或)昀大单个有关物质量,大都未明确其结构,这种分析方法缺乏针 对性,不能有效的控制,也不能对药品的生产过程提供指导。为提高人民用药的 安全性和有效性,对于有关物质分析,应根据有关物质的结构,性质等,有针对 性的建立灵敏可靠的分析方法和合理的限度,达到有效的控制,同时对科学的生 4华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 产和贮存也具有指导意义。 本部分首先建立了地西泮有关物质分析的 RP-HPLC 方法,以 LC-MS 分析 地西泮粗品原料,获得了相关杂质的一级、二级质谱,结合地西泮生产工艺和强 制破坏试验,确定了三种杂质结构。通过定向合成技术获得了杂质单体并进行了 结构确证。昀后对杂质单体进行了标化,并测定了三个杂质相对于地西泮的响应 因子值。本研究为该品种的系统质量研究及评价奠定了基础。 2. 地西泮片溶出特性评价。 溶出度系指药物从片剂、胶囊剂或颗粒剂等固体制剂在规定条件下溶出的速 [8] 率和程度 。它是模拟人体吸收环境的体外试验,能较为直观的反映药物在体内 的溶出性能。对于口服固体制剂,溶出度作为一种简单价廉的方法,在一定条件 [9][10] 下与制剂的生物利用度有一定的相关性 ,故溶出度试验已作为一种控制药品 [11] 内在质量的重要指标,广泛应用于药品的研发、生产和监督检验中 。 我国自 1985 年开始,正式在中国药典中收载该检查法。但目前我国溶出度 [8] 质量 标准的拟定,仍存在不足,如溶出介质的选择不合理,介质中含有大量的 有机溶剂;转速设置不合理,搅动速度过快,等等。强烈的溶出条件似乎更倾向 于为了让产品合格而建立,并不能模拟人体环境,偏离了溶出度检查法建立的初 衷,且导致实验结果大都可达到合格,不能准确的区分制剂质量的优劣,更不能 通过溶出度的控制,达到促进生产厂家不断完善药品生产工艺,提高药品生产水 平的目的。故,开展溶出度评价工作是必要的,有利于我国口服制剂整体工艺水 品提高。 评价溶出度的方法有很多种,可分为非模型依赖法和模型依赖法,前者包括 有 f2 因子法、多变异法、方差分析和协方差分析等;后者包括 Weibull 模型、 [12]-[14] Logistic 模型、Higuchi 模型等 。其中 f2因子法自 1999年被美国 FDA 采用 以来,被越来越多的应用,目前为 FDA 推荐的评价溶出度的首选方法。该方法 [15] 由 Moore 和 Flanner昀先提出 ,其计算方法为: 2 n 1 ?0.5 f 50lg[1 + Rt ?Tt ] *100 2 ? n t 1 5华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 其中 Rt 和 Tt 为各取样点参比和供试制剂的平均溶出率,n为取样点个数。 当 50?f2?100时,则供试制剂的溶出曲线与参比制剂相似。f2因子法能综 合考虑溶出行为间的差异,且计算方便,通过简单的数字便可对溶出曲线进行比 [16][17] 较 。 本部分参照日本橙皮书的思路,考察四个厂家在 pH1.2、pH4.0、pH6.8 和 水中的溶出情况,绘制溶出曲线,以 f2 因子法对溶出行为进行评价。结果显示 国内不同厂家样品的溶出行为差别较小,但发现中国药典原溶出度测定方法不能 反映溶出特性的差异。本研究为中国药典溶出度检查方法的修订以及该固体制剂 的溶出特性评价提供了依据。 3:注射液中苯甲醇的含量分析及处方合理性初步评价。 苯甲醇是注射液中常用的添加剂。在制备注射液时,为提高制剂的安全性、 稳定性,常需要添加一种或几种附加剂,如 pH调节剂碳酸氢钠等,用于调节注 射液 pH,减轻注射时疼痛;抗氧化剂亚硫酸氢钠等,防止主药被氧化;络合剂 依地酸二钠等,络合可能存在的金属离子;防腐剂如苯甲醇,尼泊金类等,还有 增溶剂,助溶剂等。苯甲醇在注射用制剂中应用广泛,但其不易被人体吸收, 反复多次使用,会长期积留在注射部位,使周围肌肉发生创伤性炎症,甚至变 [18]-[20] 性坏死,昀终导致肌肉伸缩障碍、萎缩、硬化 。已有苯甲醇所致臀肌挛缩 症,注射处皮下组织溶解等不良反应的报道。它还有一定的溶血作用,人红细胞 在 1.2%的苯甲醇溶液(含 0.9%氯化钠)中,37? 45 分钟后产生溶血。苯甲醇 所致的不良反应已引起专家学者的广泛关注, 2005年 6月 10日, SFDA发出《关 于加强苯甲醇注射液管理的通知》,开始对苯甲醇注射液,及含有苯甲醇的注射 [21]-[23] 液加强管理,关于注射剂中苯甲醇定量的方法的报道也受到关注 ,中国药 典 2010年版二部首次在盐酸林可霉素注射液中对苯甲醇含量进行控制。本部分建立了地西泮注射液中苯甲醇定量分析方法,同时对不同企业生产的 注射液中的苯甲醇含量进行了测定,显示企业的投料量和处方基本吻合,但是不 同企业处方中苯甲醇的量分别为 10-20mg/ml 不等。该结果反映出该制剂处方中 苯甲醇处方量的科学性不足,美国药典中林可霉素注射液中苯甲醇的控制限度为 不高于 9.45mg/ml。提示应对地西泮注射液中苯甲醇的量进行控制,以保障用药 的安全。6华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 第一章 地西泮有关物质分析及杂质对照品研究 药品中的杂质是指除了原料药或赋形剂以外的任何其他成分,按其理化性质 分为有机杂质、无机杂质以及残留溶剂。按照来源,又可以分为降解产物、工艺 杂质、由反应物及试剂中混入的杂质等。还有按照毒性、化学结构等各种不同的 分类方法。其中工艺中引入的杂质和降解产物等,可能是已知的或未知的、挥发 性的或不挥发性的。由于这类杂质的化学结构一般与活性成分类似或具渊源关 [24] 系,故通常又可称之为有关物质 。 国内外关于地西泮文献大部分都是关于体内药物分析及临床应用或中成药 [25] 中非法添加的监控等方面,而关于有关物质分析的很少。英国药典 2010 列出 [26] 了地西泮中 6个杂质的结构,USP32 也列出了去甲西泮、有关物质 A、有关物 质 B的检查项,分别相当于 BP 的杂质 A,D,C。BP2010 收载的有关物质的 结 构及名称如下: CH 3 O N H N R O N Cl Cl 杂质B :RCO-CH2-Cl 杂质D :RH 杂质A CH 3 CH 3 OCH 3 N O N N O N N NH 2 Cl Cl Cl 杂质C 杂质E 杂质F 杂质 A:7-氯-5-苯基-1,3-二氢-2H-1,4-苯二氮卓-2-酮(去甲西泮) 杂质 B:2-氯-N-(4-氯-2-苯甲酰基)-N-甲酰胺 杂质 C:1-甲基-3-氨基-6-氯-4-喹唑啉-2-酮 杂质 D:2-甲氨基-5-氯-二苯甲酮 杂质 E:1-甲基-6-氯-4-喹唑啉-2-酮 杂质 F:7-氯-2-甲氧基-5-苯基-3H-1,4-苯二氮卓 7华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 表 1 各国药典地西泮有关物质分析方法药典 剂型 检查方法 检查项 限度 原料药 总杂质 0.3% HPLC:C18 柱;甲醇-水(70:30)为流 注射液 总杂质 0.5% Ch.p2010 动相;波长 254nm 片剂 总杂质 0.5% HPLC:C18 柱;乙腈-甲醇-磷酸二氢钾 A,B,E:0.10% 杂质 原料药 溶液(3.4g/L,pH5.0) (22:34:44)为流动 其它:0.10% A,B,E 相;波长 254nm 总量:0.2% C:1.0% TLC:GF254 薄层板;乙酸乙酯-正己烷 杂质 口服溶液 D:2.0% (1:1)为展开剂,254nm紫外灯下观察 C,D BP2010 其它:0.2% TLC:GF254 薄层板;乙酸乙酯-正己烷 片剂 总杂质 0.5% (1:1)为展开剂,254nm紫外灯下观察 注射液 未考察 未考察 未考察 直肠溶液 A:0.3% C:0.1% HPLC: C18柱;乙腈-甲醇-水(40:20:40)杂质 原料药 D:0.01% 为流动相;波长 254nm A,C,D 其它:0.1% USP32 总量:1.0% 胶囊,缓释胶 囊,注射液, 未考察 未考察 未考察 片剂 各国药典地西泮有关物质分析方法如表 1,通过对比,我国药典对于地西泮 有关物质的分析均是直接控制杂质总量,未明确地西泮杂质的结构,不能有针对 性的加以控制。本部分我们对地西泮有关物质进行了深入的研究,可能全面的了 8华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 解了其有关物质的结构、来源、性质等,建立了灵敏可靠的分析方法,为地西泮 的系统质量研究和评价奠定基础,也为指导科学合理的制备工艺提供依据。 本章主要包括三个部分,首先,通过对比不同的色谱条件,建立了地西泮有 关物质分析方法,并进行了验证,统一了地西泮注射液和片剂的有关物质分析方 法;再以 LC-MS 分析地西泮中的有关物质,结合一级质谱的分子量信息和二级 质谱的裂解途径的推导,确定了三个杂质的结构,并通过定向合成获得三者的单 体;昀后,将合成的有关物质纯品进行了标化,并测定了其相对于地西泮的响应 因子。 第一节 地西泮有关物质分析方法的建立与验证 一.地西泮有关物质分析方法的建立 1.试剂及试药 地西泮粗品原料(A厂家,批号 200912002,201001016);地西泮精制品原料 (A厂家,批号 20070402,20071101;B厂家,批号 0040402);乙腈,甲醇(色 谱纯,美国天地);超纯水(自制);磷酸二氢钾(分析纯,天津博迪化工股份有 限公司);氢氧化钠(分析纯,天津市北方天医化学试剂厂) 2.仪器 Waters-E2695 高效液相色谱仪;梅特勒 AL-204电子天平;梅特勒 320型酸 度计 3.色谱条件 流动相:Ch.p2010:甲醇-水(60:40)USP32:乙腈-甲醇-水(40:20:40)BP2010: 乙腈-甲醇-3.4g/L磷酸二氢钾溶液(以 NaOH试液调节 pH至 5.0) (22:34:44) 色谱柱:Agilent Extend C 250*4.6mm,5 μm 18 9华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 检测波长:254nm 流速:1.0ml/min 柱温:35? 4.溶液的配制 取地西泮粗品 200912002,201001016适量,以流动相溶解并稀释成约为 1mg/ml 的溶液。 5.结果 分别量取上述样品溶液 10μl,分别以三种流动相洗脱,比较各流动相下,杂 质洗脱、分离情况及色谱峰的塔板数、对称性等参数,比较结果及图谱如表 2 及图 1-图 3。表 2 三国药典色谱条件下参数对比表 主峰与其前杂 主峰与其后杂 主峰板数 主峰拖尾因子 杂质个数 归一化杂质量 质分离度 质分离度 参 数 20091 20100 20091 20100 20091 20100 20091 20100 20091 20100 20091 20100 2002 1016 2002 1016 2002 1016 2002 1016 2002 1016 2002 1016 Ch 9383 9301 1.5 1.5 2.8 3.8 3.5 7.9 8 9 1.24% 0.97% .p BP 10634 10698 1.3 1.3 3.0 2.6 5.6 8.3 13 14 1.19%1.03% U 10270 10280 1.4 1.4 2.6 2.7 3.6 3.7 16 19 1.63% 1.3% SP 10华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 分钟a 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 分钟b 图 1中国药典方法(a: 粗品 200912002,b:粗品 201001016) 11 AU AU 2.27 9 2.5 1 8 3.9 8 4 3.9 8 9 6.0 3 0 8.3 0 8 8.3 2 9 9.0 2 4 9.01 9 10 .1 60 11 .5 87 11 .9 29 13 .4 73 13 .4 81 15 .7 36 18 .9 0 9 18 .8 86 23 .2 92 23 .3 37 33 .8 58 33 .9 48 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟 a 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟 b 图 2 BP方法(a: 粗品 200912002,b:粗品 201001016)12 AU AU 0 .04 5 2.27 2 2.2 6 7 3.82 1 3.7 9 8 4.4 5 2 4.4 6 8 5.62 7 5.9 2 3 6.16 9 6.60 5 7.48 8 8.48 5 8.5 6 9 9.07 1 9.2 6 0 9.17 5 10 .1 3 1 10.7 35 12 .2 81 12 .4 1 4 13 .9 08 14 .0 60 17 .5 40 19.3 0 2 19 .8 99 20 .1 23 21 .6 94 22 .0 54 24 .7 77 25.2 09 26 .1 20 26.5 43 30 .0 18 30.3 8 4 30.8 8 6 34 .8 76 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 分钟 a0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 分钟 b 图 3 USP 方法(a: 粗品 200912002,b:粗品 201001016) 三国药典的色谱条件均能较好的分离主成分与杂质,且都峰形良好,但从杂 质峰个数以及杂质的量来看,USP 的流动相不仅能较好的洗脱主成分,对杂 质也 能达到较好的的洗脱和分离,故选择 USP的色谱系统分析地西泮有关物质。 6.耐用性试验及结果 在 USP洗脱条件下,更换使用不同型号的色谱柱,考察方法的耐用性。 13 AU AU 2.19 8 2.20 5 3.03 7 3.03 8 3.99 5 3.976 4.63 4 4.62 6 5.12 3 5.39 6 5.3 9 1 5.72 7 5 .726 6.10 8 7.21 4 7.24 1 8.04 8 8.05 0 9.31 0 9.32 2 10.0 0 8 10.3 3 6 10.9 2 0 11.7 0 7 11 .7 24 13.0 0 3 13.0 0 3 13.4 0 3 13.4 5 0 14.1 1 6 14 .1 6 3 14.9 8 3 14.9 9 6 17.0 3 0 17 .0 26 24.0 3 2 23.9 4 4 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 色谱柱:柱 1:Diamonsil C 250*4.6mm,5 μm 18 柱 2:AE.Kromasil C 250*4.6mm,5 μm 18 柱 3:Agilent TC-C 250*4.6mm,5μm 18 耐用性试验 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 的色谱图如图 4-图 5,各参数对比见表 3。在 USP的洗脱 条 件下,不同型号的色谱柱均能使三批样品中主峰与其相邻杂质色谱峰完全分 离, 主峰峰型良好,本方法耐用性好,进一步说明方法适用于地西泮有关物质的 分析。表 3 耐用性结果表 参数 主峰与其前杂 主峰与其后杂 色 主板峰数 主峰拖尾因子 杂质个数 归一化杂质量 质分离度 质分离度 谱 柱 20091 20100 20091 20100 20091 20100 20091 20100 20091 20100 20091 20100 2002 1016 2002 1016 2002 1016 2002 1016 2002 1016 2002 1016 柱1 7739 7508 1.4 1.5 1.3 2.4 4.3 5.0 18 13 1.35%1.09% 柱2 8873 8654 1.4 1.6 2.1 2.4 5.0 4.8 23 16 1.41%1.09% 柱3 7982 7795 1.3 1.4 2.0 1.8 4.7 4.1 21 14 1.49%1.19% 14华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文0.04 0.02 0.00 -0.02 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 分钟a 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 -0.010 -0.020 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 分钟b15 AU AU 3.859 3.967 4.23 4 5.81 3 6.072 6.296 6.906 7.109 7.467 7.945 8.17 8 8.483 8.70 6 9.28 9 9.646 9.972 10.184 10.798 11.328 11.146 11.863 12.515 13.429 14.454 14.885 15.394 15.470 16 .0 13 16.689 18.141 18 .487 19.097 20.339 20.6 81 21.860 22 .4 51 24.0 88 24.965 27 .4 22 27.802 29.578 33.100 36 .3 15 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 -0.005 -0.010 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 分钟c 图 4 粗品 200912002 耐用性图谱(a:柱 1;b:柱 2;c:柱 3) 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 -0.010 -0.020 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 分钟 a 16 AU AU 3.946 4.291 4.254 5.407 5.931 6.201 6.910 6.929 7.260 7.664 8.210 8.756 8.266 8.839 9.627 11.234 12.588 11.888 12.945 14.155 15.950 15.454 16.244 18.707 17.406 20.109 18.840 22.670 21.263 24.297 22.096 22.981 27.632 32.568 29.853 36.332 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 -0.010 -0.020 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 分钟b0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 -0.010 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 分钟c图 5 粗品 201001016 耐用性图谱(a:柱 1;b:柱 2;c:柱 3) 7.讨论 7.1.在选择色谱条件时,曾查阅相关文献,收集地西泮或其他苯二氮卓类药 物的 色谱分析方法,文献报道的大都是关于该类药物的含量或生物样品的分析, 其流 [27]-[37] 动相基本是以甲醇,乙腈和水或磷酸盐缓冲液组成 等,故我们选择三国药 典的方法,以甲醇-水系统,甲醇-乙腈-水系统及乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液系 统进 行了对比。 17 AU AU 3.866 4.298 5.151 6.292 6.222 7.440 6.943 7.944 7.262 8.454 7.683 8.284 9.598 8.857 10.197 9.621 11.372 11.577 14.281 12.943 14.160 16.709 15.451 16.252 18.074 17.437 20.319 21.896 24.960 23.013 33.019 29.921 36.570 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7.2.中国药典 2010年版二部地西泮原料药有关物质分析,流动相为甲醇- 水 (70:30),但在该比例下,主峰与相邻杂质峰无法完全分离。故逐步加大水相 比 例,至水相为 40%时,能保证色谱峰良好的分离度,且主峰柱效及保留时间适宜, 故确定比例为甲醇-水(60:40)。 7.3.在色谱条件的选择时,三种流动相洗脱,USP的流动相下这两批粗品分离出 的杂质峰的数目昀多,归一化法计算的杂质百分比也昀高,主峰柱效高,与前后 杂质峰分离度好,且不含盐,适用于 LC-MS分析。而中国药典的甲醇-水系统的 洗脱方法,虽然归一化法计算的杂质量与 BP 方法下的相近,但杂质峰个数远少 于其它两种色谱系统,可能是由于保留时间相近的杂质峰无法分离,或是洗脱效 率差,杂质峰被“拉平”,不能被检测,也有可能是该流动相不能洗脱有些杂质。 综上,选择了 USP的色谱条件进行分析。 二.地西泮有关物质分析方法学验证 1.试剂及试药 地西泮原料药(A 厂家,批号 20070101);乙腈(色谱纯,美国天地);甲 醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司) (色谱纯,美国天地);超纯水(自制); 盐酸(武汉市洪山中南化工试剂有限公司);氢氧化钠(天津市北方天医化学 试 剂厂);30%过氧化氢溶液(中南化工试剂有限公司);磷酸二氢钾(天津博迪化 工股份有限公司) 2.仪器 YB-I型澄明度检查仪(照度为 4500LX); HH-2S型恒温水浴锅; Waters-E2695 高效液相色谱仪;梅特勒 AL-204电子天平 3.色谱条件 色谱柱:Agilent Extend C 250*4.6mm,5 μm 18 流动相:乙腈-甲醇-水(40:20:40) 检测波长:254nm,柱温:35?,流速:1.0ml/min 4.方法专属性试验及结果 对地西泮原料进行强光、高热、强酸、强碱、强氧化的强制破坏试验,考察 拟定的色谱方法是否能有效分离主成分与各降解产物。 18华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 强酸破坏:精密称取地西泮原料约 25mg,置于 25ml 量瓶中,以少量流动相 溶解,以 3mol/L 的盐酸溶液 1ml 破坏,水浴中加热 15min,加速反应,冷却至 室温后以同摩尔浓度的氢氧化钠溶液中和至中性,以流动相定容,过滤后进样。 同法破坏空白溶剂。 强碱破坏:取样方式同强酸破坏,以 3mol/L的氢氧化钠溶液 1ml 破坏,水 浴中加热 15min,加速反应,冷却至室温,以同摩尔浓度的盐酸溶液中和至中 性, 以流动相定容,过滤后进样。同法破坏空白溶剂。 强氧化破坏:取样方式同强酸破坏,以 30%过氧化氢 1ml 破坏,水浴 15min, 以流动相定容,过滤后进样。同法破坏空白溶剂。 高热破坏:取样方式同强酸破坏,水浴中加热 3小时,以流动相定容。 强光破坏:精密称取经强光照射 1周的地西泮原料 25mg,置于 25ml 量瓶 中, 以流动相溶解并定容,过滤后进样。 取上述溶液各 10μl 注入高效液相色谱仪,记录色谱图附图 6。 0.04 0.02 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟a 19 AU 2.09 9 2.44 9 5.62 5 8.02 4 9.3 1 0 12.7 3 7 28.1 0 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟b 0.04 0.02 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟c 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟d 20 AU AU AU 2.1 9 0 2.26 3 2.26 3 2.63 4 2.98 8 3 .041 3.12 7 4.07 5 4.41 7 4.55 9 5.72 9 6.10 3 8.02 4 8.05 7 10.3 3 6 12 .7 0 7 13 .5 4 1 27.9 9 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟e 0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟f 图 6 专属性试验色谱图 (a:酸破坏;b:碱破坏;c:氧化破坏;d:氧化破坏空白;e:热破坏;f:光破坏) 5.检测限的计算 精密称定地西泮原料 0.0113g,以溶剂稀释成 0.226μg/ml 的溶液,精密量取 5μl 注入高效液相色谱仪,使 S/N3,检出限为 1.13ng。 6.结论 由强制破坏色谱图可见,地西泮在氧化,高热和强光条件下稳定,几乎不发 生降解,在酸和碱中则在保留时间约 3倍处出现较大的降解产物峰。溶剂同法破 坏,除氧化条件外,其它破坏条件均未出现新的色谱峰。本色谱条件下地西泮主 峰可与强制降解产物峰完全分离,专属、灵敏。适用于地西泮有关物质的分析。 21 AU AU 2.19 2 2.19 0 2.69 7 2.70 3 5.69 0 5.68 5 5.89 5 6.0 6 8 6.06 1 7.99 8 7.99 7 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 三.片剂及注射液有关物质分析方法的统一 在建立了地西泮原料药有关物质分析方法的基础上,考虑将地西泮制剂的有 关物质分析方法与之统一。制剂中添加了大量的辅料,需要考察辅料或辅料 的强 制降解产物对是否影响测定。 1.空白干扰试验 分别取两种制剂的辅料和地西泮,以流动相溶解稀释后,取 10μl 注入高效 液相色谱仪。图谱见图 7。片剂辅料无明显吸收峰,注射液辅料由丙二醇, 乙醇, 苯甲醇,氯化钠和烟酰胺混合而成,其中烟酰胺和苯甲醇在 254nm波长处都 产 生较大的吸收,但均不影响主峰的测定。 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 分钟a 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 分钟b 22 AU AU 2.218 2.310 3.108 4.046 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.060 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 分钟c 图7 空白干扰试验(a:片剂辅料;b:注射液辅料;c:地西泮 2.专属性试验 按照原料药的强制破坏试验条件,分别对片剂和注射液的辅料进行强酸、强 碱、强氧化、高热和强光的破坏试验,考察各破坏条件下,辅料是否发生降解, 降解产物峰是否对主成分峰产生干扰。片剂辅料除氧化破坏外,其他强制破 坏均 未见降解产物峰(图 8),注射液辅料在强制破坏试验中产生的降解产物峰 (图 9) 也均不影响地西泮的测定。 0.050 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 分钟图 8 片剂辅料氧化破坏 23 AU AU 2.26 3 8.01 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 分钟a 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 分钟b 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 分钟c 24 AU AU AU 2.270 2.289 2.283 3.089 3.092 3.104 3.998 3.562 4.005 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 分钟 d 0.30 0.20