维普资讯http://www.cqvip.com第6卷第2翔寰毒卓杂恚Yo1．B№．21991年6月VIR0LOCICASINICAI--．1。。1一种回收DNA小片段的有效方法沈英(同济医科大学微生物学教研室武汉430030)摄要在分子生物学中回收DNA小片段柱柱不够理想，本文通过一个sihp多橐接头的消化、电辣，超速离心普步骤．介绍了一种有效的回收DNA小片段的方法。美麓蜀：DNA片段回收多聚接头从凝胶中分离回收DNA片段是基因工程的常用手段，特别是对100bp以下的小片段的电泳和回收更是分子生物学的重要内容⋯。例如。为了构建多功能高效表达载体，经常需要从一个质粒切下多聚接头，单一酶切序列，操纵子，启动子等等，然后插入到另一个质粒中。上述DNA片段常为较小片段，而DNA小片段的回收又较为困难，至今还没有十分完善的方法。我#1c。在构建昆虫枉状病毒转移载体的过程中，用EcoRI和HindⅢ双酶消化质粒pu西1取得一个大小只有匿3个限制酶位点的多聚接头，重组后成为多克隆位点的转移载体，这样不仅增加了转移载体的应用范围，而且使用起来更加方便，对于这种多聚母叁里垒尘墼旦墼0我们摸索了如下几点经验。1．阻捌性一消化和点样⋯由于此DNA片段很小，仅51bP，用溴化乙锭染色在凝胶中带微弱，我们采取了分管消化合并点样的方法，即每支Eppeadrof管内加底物0．8～1．Oug，用酶化后，5管合并点到一个点样孔内，这样每个样品孔中DNA含量可迭‘～5g。2．PAG电涞和包收用琼脂糖凝胶回收小于100bp的DNA小片段是很困难的，即使将凝胶浓度提高到1～1．2，也难以回收。因此，我们在回收5lbp小片段时，选用了垂直扳式10N聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳(12，电泳缓冲液为PH7．2的TBE(5倍浓缩贮备液每开含ITris碱54g、硼酸27．5g，0．05mol／LEDTAPH8．020m1)，以Hac'l消他的PBR322作为片段大小的标准，电泳后，在紫外灯下可清楚的看封5lbp小片段，切下所需部分凝胶带，装入透析袋中，电泳洗脱回收(t2。}此项工作是在武汉大学病毒系齐义鹏教授实验室完成。一本文-T-Is9o~,9月14日收到。{109啤lo月19B惨田．·：。．维普资讯http://www.cqvip.com182霸毒学杂志第6卷0．盘蕊一心，用电泳洗脱法从PAG中回收这个DNA小片段，经常规酚，氯仿l异戊醇(241)抽提，加2．5倍冷乙醇，，转入超速离心管中，精确平衡，一35℃过夜或一8O℃放置1小时，取出后，用40．000rpm超速离心1小时，弃上清，沉淀于IO／LI无菌双蒸水中·立即进行连接反应或溶于1×TE中，4℃保存备用。用超速离心法回收DNA小片段，多次实验都能得到满意结果，回收率为8o％以(图2)，且克分子浓度和末端总浓度均较高，足以保证构建载体所需DNA片段的数量，是一个可以推广的回收小片段的有效方法。田110和裹丙蜡蘸骑■膻电泳结果图2．羟10和裹丙蜡蘸胺壤胶回收柏51bp1．2．·l8／Hind■．EeoRI；DNA小片段<箭头所示)3．pBR32丑·eI；Fig．2Recovered511~pfrsgmen*JF‘1．1EIetlltphee-i●ofDNA‘tllwhichi‘abe-ⅡhT-rro--onfrsgmeatsonlO~polyaerylsmidegel0l~Olyae,ylamld0。l考参文献【1】齐义一年．基饵工程原理和方涪。1989，I~Jll大掌出版社·鹿都·CI)deB。。t．R．A．ete1．，1883．ProcNalAcadSciUSA·78：21_【3】YietrzJ．sadMeeslag．，1982，T．Gene．19：269,(●)PetZinc|et41．1990，Vth[nternstionslCell。qu~umoⅡInvertebratePethol。gyandMicrobialeeatto]，Proceedings●jdAloztraete．Australia．P．2630AnEfficientMethodtoR主eco．■verDNASmallFragmentsShenYing(De#t．Microbiology,TonjiMedicalUniversity．Wuhan430030)It“difficulttorecoverDNAsmallfragmentinmoleeularbiology．ByuBingcomeproceduresofdigestion，eleetrophorecisandultrecentrifugetionetc。enefficientmethodtorecover51bppolylinkerisintroducedinthepaper．KeywordsIDNAfregmentBecoveryPolylinher
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