灯盏花素自微乳在大鼠肠道吸收动力学研究

exp ression [ J ]. J Am Soc N ephrol, 2000, 11 ( 5 ) : 965 - 973. [ 7 ]　鹿克风 ,陈良华. 血红素氧合酶在心血管系统中的作用 [ J ]. 国外医学生理病理科学与临床分册 , 2001, 21 (30) : 214 - 215. [ 8 ]　ZHANG X, SHAN P, ALAM J, et al. Carbon monoxide modulates fas/ fas ligand, caspase, and bcl22 fam ily p roteins via the P38 am itogen2activated p rotein kinase pathway during ischem ia2reperfusion lung injury [ J ]. J B ioChem , 2003, 278 (24) : 22061 - 22070.[ 9 ]　陈奇国 ,杨光田.左旋四氢巴马汀在大鼠全脑性缺血 2再灌注时对脑组织电解质含量的影响 [ J ]. 中华急诊医学杂志 , 2003, 12 (3) : 179 - 181.[ 10 ]　刘德红 ,陈燕启 ,杨光田. 左旋四氢巴马汀在大鼠全脑性缺血 2再灌注时对核因子 2κB表达的影响 [ J ]. 中华老年医学杂志 , 2004, 23 (3) : 205 - 206. 灯盏花素自微乳在大鼠肠道吸收动力学研究 3 张新勇 1 ,张兴德 1 ,高运军 2 ,刘幸平 1 (1. 南京中医药大学药学院 , 210046; 2. 南京市中医院中医药研究所 , 210001) [摘 　要 ]　目的 　研究灯盏花素自微乳在大鼠肠道吸收的动力学特征。方法 　建立大鼠在体肠循环模型 ,采用酚 红标记校正肠循环液体积 ,以比色法和高效液相色谱法分别测定循环液中酚红和灯盏花素的含量。结果 　灯盏花素自 微乳在药物浓度为 20, 40, 80μg·mL21时 , Ka基本保持不变 ;不同肠段肠循环液中灯盏花素的剩余量的对数值与时间成 线性关系 ,且不同肠段灯盏花素的吸收速率差异无显著性。结论 　灯盏花素自微乳在小肠吸收呈一级动力学过程 ,吸收 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 为被动扩散 ,并且在小肠中无特定吸收部位。 [关键词 ]　灯盏花素 ;自微乳 ;在体肠循环法 ;酚红标记 [中图分类号 ]　R286; R965　　　[文献标识码 ]　A　　　[文章编号 ]　100420781 (2009) 0520571203 Study on the In testina l Absorption of Brev iscap ine Self2em ulsion in Ra ts ZHANG Xin2yong1 , ZHANG Xing2de1 , GAO Yun2jun2 , L I U Xing2p ing1 ( 1. College of Pharm acy, N anjing U niversity of Trad itiona l Chinese M edicine, N an jing 210046, Ch ina; 2. Institu te of Trad itiona l Ch inese M edicine, Trad itiona l Chinese M edicine Hospita l of N an jing C ity , N an jing 210001, Ch ina) ABSTRACT　O bjective 　 To study the intestinal absorp tion kinetics of breviscap ine self2emulsions. 　M ethods　 Establishing the in situ perfusion model in rats, and adjusting the volume of perfusion fluid by phenolsulfonphthalein. The contents of phenolsulfonphthalein and B reviscap ine of perfusion fluid were detected by using chromatometry and HPLC. 　 Results　Ka remained invariant as B reviscap ine in self2emulsions was at 20, 40, 80μg·mL21. There was linear relationship of B reviscap ine in self2emulsions between logarithm contents of the surp lus in different zone of bowel and time. Meanwhile, the rate of absorp tion in different zone of bowel showed no significant differences. 　Conclusion　The absorp tion of B reviscap ine self2 emulsions in small intestine is a first2order p rocess. The mechanism of absorp tion is a passive diffusion wihtout specific site. KEY WO RD S　B reviscap ine ; Self2emulsions; In situ perfusion method; Phenolsulfonphthalein 　　灯盏花素是从灯盏花中提取的黄酮类成分 ,以灯 盏乙素为主 ,含有少量灯盏甲素。临床上主要用于治 疗脑栓塞、脑梗死、卒中后瘫痪、冠心病、心绞痛等疾 病 ,疗效确切。灯盏花素自微乳是指以自微乳化给药 系 统 ( self2m icroemulsi2fying drug delivery system, [收稿日期 ]　2008210214 [基金项目 ] 　3 南京市卫生局基金 (基金编号 : YKK2 06123) [作者简介 ]　张新勇 ( 1985 - ) ,男 ,江苏沭阳人 ,在读硕 士 ,主要从事中药活性成分与制剂研究。电话 : 025 - 85811520, E2mail: zhangxinyong@ yahoo. com. cn。 [通讯作者 ]　张兴德 ,电话 : 025 - 85811517。 SMEDDS)作为给药载体的一种灯盏花素制剂 ,因为 SMEDDS能提高水难溶性药物的溶解度 ,增加细胞膜流 动性 ,促进药物淋巴吸收 ,从而提高药物的口服生物利 用度 [ 1 ]。笔者在本实验中采用大鼠在体肠吸收模型 ,考 察灯盏花素自微乳在大鼠肠道的吸收动力学 ,并对其吸 收机制进行初步探讨。 1　 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 　 1. 1　仪器与试药 　LC210AD高效液相色谱仪 (日本 岛津 ,包括 LC210AD泵 , SPD210A 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 器 , HT2230A柱 温箱 , C221色谱数据采集单位及计算机 ) , 752型紫外 可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司 ) , 1515型兰 格蠕动泵 (保定兰格恒流泵有限公司 )。灯盏乙素对 ·175·医药导报 2009年 5月第 28卷第 5期 照品 (中国药品生物制品检定所 , 批号 : 1108422 200605) ,灯盏花素 (南京苏朗医药科技开发有限公 司 , 99%灯盏乙素 ,批号 : SLMO7O714) ,酚红 (上海三 爱思试剂有限公司 ) , Krebs2R inger缓冲液 [ pH 值 = 7. 4, 1 L 缓冲液中含氯化钠 (NaCl) 7. 8 g、氯化钾 ( KCl) 0. 35 g、氯化钙 (CaCl2 ) 0. 37 g、氯化镁 (MgCl2 ) 0. 02 g、磷酸二氢钠 (NaH2 PO4 ) 0. 32 g、葡萄糖 1. 40 g、 碳酸氢钠 (NaHCO3 ) 1. 37 g] ,其他试剂均为分析纯。 1. 2　动物 　SD大鼠 ,体质量 (200 ±20) g,南京中医药 大学实验动物中心提供 ,动物合格证号 : 2008A045。 2　方法 　 2. 1　供试样品溶液的制备 　 2. 1. 1　灯盏花素自微乳的制备 　分别取处方量吐温 80、PEG400、1, 22丙二醇、肉豆蔻异丙酯等置于配液容 器中 ,搅拌均匀 ,加入适量灯盏花素 ,于 37 ℃振荡混 匀 ,至药物完全溶解形成澄清透明的棕黄色液体 ,即得 灯盏花素自微乳制剂。灯盏花素浓度 5 mg·g- 1。 2. 1. 2　灯盏花素自微乳肠循环液的制备 　取配制好 的适量灯盏花素自微乳 ,置于 250 mL容量瓶中 ,加入 酚红浓度为 20μg·mL21 Krebs2R inger缓冲液 ,定容 , 100 r·m in21磁力搅拌混匀即得。 2. 2　肠循环液酚红的测定 　 2. 2. 1　酚红 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的绘制 　用 Krebs2R inger缓冲 液配 制 浓 度 分 别 为 10. 8, 21. 6, 32. 4, 43. 2, 54. 0μg·mL21酚红标准溶液适量 ,分别吸取 0. 5 mL, 加入 1 mol·L21氢氧化钠 (NaOH )溶液 5. 0 mL,混匀 , 以同浓度 NaOH溶液为空白 ,在 558 nm波长处测定其 吸光度 ,以酚红的浓度 (C ,μg·mL21 )对吸光度 (A )进 行线性回归 ,得酚红的标准曲线方程 : C = 75. 872A - 2. 971 4, ( r = 0. 999 1 ) , 线 性 范 围 为 10. 8 ～ 54. 0μg·mL21。 2. 2. 2　酚红质量浓度的测定 [ 2, 3 ] 　取肠循环液适量 , 静置 ,离心 ,移取上清液 0. 5 mL,加入 1 mol·L21 NaOH 溶液 5. 0 mL,混匀 ,以同浓度 NaOH 溶液为空白 ,在 558 nm波长处测定其吸光度 ,由酚红标准曲线 ,计算 肠循环液中酚红的质量浓度。 2. 3　肠循环液中灯盏乙素含量测定 　 2. 3. 1　色谱条件 　Kromail C18柱 (4. 6 mm ×250 mm, 5μm ) , 流动相 : 甲醇 20. 1%磷酸 ( 60 ζ 40 ) , 流速 1. 0 mL·m in21 ,柱温 30 ℃,检测波长 335 nm,进样量 20μL。 2. 3. 2　灯盏花素标准曲线的绘制 　取灯盏乙素对照 品约 3 mg,精密称定 ,置于 25 mL 容量瓶中 ,甲醇定 容 ,得浓度为 138. 0μg·mL21的储备溶液 ;分别移取上 述储备液 1. 6, 1. 2, 0. 8, 0. 4, 0. 2, 0. 1 mL置于 2 mL容 量瓶中 ,甲醇定容 ,制得浓度分别为 110. 4, 82. 8, 55. 2, 27. 6, 13. 8, 6. 9μg·mL21对照品溶液 ;精密吸取 20μL进样 ,测定峰面积 ,以对照品浓度 (C ,μg·mL21 ) 对峰面积 (A )进行线性回归 ,得灯盏花素的标准曲线 方程为 : A = 42 827C - 16 666, r = 0. 999 8,线性范围为 110. 4～6. 9μg·mL21。 2. 3. 3　稳定性实验 　按“2. 1. 2”项配制灯盏乙素浓 度为 40μg·mL21、酚红浓度为 20μg·mL21的肠循环 液适量 ,置于 (37 ±0. 5) ℃恒温水浴中保温 1. 5 h,分 别于 0. 5, 1. 0, 1. 5 h取样 ,测定灯盏乙素和酚红的含 量 ,结果显示肠循环液在 1. 5 h内稳定性良好 ,两者 RSD分别为 0. 45%和 0. 55%。 2. 3. 4　精密度与回收率实验 　分别配制高、中、低 3 种浓度灯盏花素与酚红的灯盏花素自微乳循环液 ,测 定灯盏花素与酚红含量 ,计算日内精密度、日间精密度 ( n = 3)和回收率 ( n = 5)。结果灯盏花素高、中、低 3 种浓度日内、日间精密度分别为 1. 1% , 0. 6% , 0. 7% 和 0. 9% , 1. 4% , 0. 6% ,灯盏花素高、中、低 3种浓度 的平均回收率分别为 100. 6% , 100. 7% , 99. 5% ;酚红 高、中、低 3种浓度的日内、日间精密度分别为 1. 3% , 1. 1% , 0. 9%和 1. 7% , 0. 9% , 2. 2% ,酚红高、中、低 3 种浓度的平均回收率分别为 100. 3% , 99. 4% , 100. 2%。以上实验结果表明 ,该法准确可靠。 2. 3. 5　肠循环液中酚红浓度的测定 　取肠循环液适 量 ,按“2. 2. 2”项下处理方法处理样品 ,由酚红的标准 曲线计算样品中酚红的浓度。 2. 3. 6　肠循环液中灯盏花素浓度的测定 　取肠循环 液适量 ,静置 ,离心 ,移取部分上清液 ,甲醇稀释 ,过微 孔滤膜 (孔径 0. 45μm ) ,进样 20μL,测定峰面积 ,由 灯盏花素标准曲线计算样品中灯盏花素的浓度。 2. 4　实验模型的建立与操作 [ 4～6 ] 　取 SD大鼠 ,禁食过 夜 (自 由 饮 水 ) , 腹 腔 注 射 20% 乌 拉 坦 [ 0. 13 g· (100 g) 21 ] ,麻醉固定 ;在腹腔中下部 ,沿腹中线切开 腹部约 3 cm,按如下各肠段区间 :十二指肠段离幽门 1 cm处开始 ,空肠段离幽门 15 cm开始 ,回肠段距离盲 肠上行处 20 cm开始 ,每段均取 10 cm,两端插管并结 扎 ,用预热至 37 ℃的 0. 9%氯化钠溶液 (NS)轻缓的将 肠内容物冲洗干净 ,用浸有 NS的脱脂棉覆盖保湿 ,红外 灯下保温 ,装好回流装置。先以 Krebs2Ringer缓冲液回 流 15 m in平衡肠道 ,然后给予不同浓度的灯盏花素灌 流药液 50 mL,组成闭合回路 ,以 2. 5 mL·m in21流速进 行循环。在回流 0. 00, 0. 25, 0. 50, 0. 75, 1. 00, 1. 50 h分 别取 5 mL 肠循环液 ,同时补加 5 mL酚红浓度为 ·275· Herald ofMedicine Vol128 No15 May 2009 20μg·mL21 Krebs2Ringer缓冲液。取肠循环液适量 ,按 “2. 3. 5”和“2. 3. 6”项下方法分别测定肠循环液中的酚 红和灯盏花素浓度。 3　结果 　 3. 1　不同灯盏花素浓度自微乳肠循环液的肠吸收实 验 　分别按“2. 1. 2”项配制灯盏花素浓度 20, 40, 80μg·mL21、酚红浓度 20μg·mL21的自微乳灌流液 , 依照“2. 4”项中方法实验 ,计算 t1 /2、Ka值和每小时吸 收分数 ,结果见表 1。 表 1　不同浓度灯盏花素自微乳肠循环液在小肠的吸收动力学 参数 　 x ±s, n = 5 给药浓度 / (μg·mL21 ) 每小时吸收分数 3 1 t1 /2 /h Ka /h21 20. 12 0. 179 8 ±0. 003 0 28. 95 ±1. 00 0. 023 9 ±0. 000 8 40. 00 0. 183 7 ±0. 020 0 24. 10 ±3. 43 0. 029 2 ±0. 003 7 79. 89 0. 188 9 ±0. 002 4 20. 65 ±0. 46 0. 033 6 ±0. 000 7 　　3 1每小时吸收分数 = [ (初始药物量 - 终末药物量 ) /初始 药物量 ] /时间 ( h) 3. 2　不同肠段吸收实验　按“2. 1. 2”项下配制灯盏花 素浓度 40μg·mL21、酚红浓度 20μg·mL21的灌流液 , 依照“2. 4”项方法实验 ,分别进行不同肠段的肠吸收实 验 ,计算 t1 /2、Ka值和每小时吸收分数 ,结果见表 2。结 果表明 ,在不同灯盏花素浓度的自微乳肠灌流液的肠吸 收试验中 , Ka值基本保持不变 ;并且以各个肠段肠循环 液中灯盏花素的剩余量的对数值对取样时间进行线性 回归 ,各回归曲线的 r值均 > 0. 9,表明灯盏花素浓度的 下降与循环时间成线性关系 ,故初步判断灯盏花素自微 乳在大鼠肠道内的吸收属于一级动力学过程 ,吸收机制 为被动扩散。对表 2数据进行两两间多重比较 t检验 , 各肠段吸收速率差异无显著性 ,所以灯盏花素自微乳在 小肠内无特定的吸收部位。 　　表 2　不同肠段对灯盏花素自微乳的吸收动力学参数 　 x ±s, n = 5 吸收部位 每小时吸 收分数 t1 /2 / h Ka / h21 十二指肠 0. 176 9 ±0. 010 0 24. 27 ±0. 97 0. 028 6 ±0. 001 1 空肠 0. 183 8 ±0. 020 0 24. 10 ±3. 43 0. 029 2 ±0. 003 7 回肠 0. 182 2 ±0. 015 1 21. 06 ±1. 31 0. 033 0 ±0. 002 1 4　讨论 　 通过灯盏花素自微乳肠吸收实验 ,笔者发现灯盏 花素自微乳在肠吸收明显好于普通片剂和灯盏花素粉 (灯盏花素自微乳的每小时吸收分数 > 0. 17,普通片 剂和灯盏花素粉的肠吸收每小时吸收分数均 < 0. 06) ,可能由于自微乳能在肠道内自发形成粒径约 50 nm的微乳 ,易于通过胃肠道的水化层 ,同时对肠道 黏附性较好 ,延长了药物微乳与肠黏膜上皮细胞接触 的时间 ,从而促进药物吸收 [ 6～8 ]。 目前 ,国内大多数在体肠循环实验多采用不被肠 道吸收的物质来标示肠循环液体积的变化 ,用的较多 的为酚红和 14 C2PEG,出于样品处理复杂程度的考 虑 [ 4～9 ] ,笔者在本实验采用酚红作为标示物校正肠循 环液体积 ,灌流持续时间较短 (1. 5 h) ,减小了肠循环 液对肠壁的损伤 ,很好地减少了肠道对酚红的吸收 ,使 酚红可以很好地起到标示体积的作用。 [DO I]　10. 3870 /yydb. 2009. 05. 009 [参考文献 ] [ 1 ]　张 　隽 ,胡俊平 ,施建舫 . 盐酸左氧氟沙星注射液与灯盏 花素配伍的稳定性 [ J ]. 医药导报 , 2008, 27 ( 1) : 103 - 104. [ 2 ]　杨星钢 ,张立波 ,潘卫三 ,等. 芍药苷大鼠在体肠吸收动力 学的研究 [ J ]. 中国药学杂志 , 2006, 41 (11) : 854 - 857. [ 3 ]　李 　丹 ,陈金和 .新老复方甘草口服液的药效学等效性实 验研究 [ J ]. 医药导报 , 2007, 26 (10) : 1141 - 1143. [ 4 ]　杨星钢 ,李 　丁 ,郭 　宏 ,等. 川芎提取物中阿魏酸大鼠在 体肠吸收动力学的研究 [ J ]. 中草药 , 2007, 38 ( 1) : 61 - 64. [ 5 ]　唐晓荞 ,杨祥良 .灯盏花素磷脂复合物改善大鼠小肠吸收 的研究 [ J ]. 中国中药杂志 , 2005, 30 (3) : 223 - 225. [ 6 ] 　周庆颂 ,蒋学华 ,樊新星. 不同相对分子质量灯盏乙素 PEG酯大鼠在体小肠吸收动力学的研究 [ J ]. 中国药学 杂志 , 2006, 41 (5) : 374 - 378. [ 7 ]　许英爱 ,范国荣. 灯盏花素大鼠在体肠吸收动力学研究 [ J ]. 中草药 , 2007, 38 (7) : 1036 - 1039. [ 8 ]　唐 　灿. 中药肠吸收动力学的研究 2灯盏花素肠吸收动力 学的研究 [D ]. 成都中医药大学 , 2004: 36. [ 9 ]　姚 　静 ,卢 　韵 .川陈皮素自微乳的制备及其大鼠在体肠 吸收动力学 [ J ]. 中国药科大学学报 , 2007, 38 ( 1) : 35 - 38. ·375·医药导报 2009年 5月第 28卷第 5期