SNT 1182-2010 禽流感检疫技术规范

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 犛犖／犜１１８２—２０１０ 代替ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３，ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４ 禽流感检疫技术 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪狏犻犪狀犻狀犳犾狌犲狀狕犪 ２０１０１１０１发布 ２０１１０５０１实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 禽流感检疫技术规范 ＳＮ／Ｔ１１８２—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １．７５　字数 ４９ 千字 ２０１１年７月第一版　２０１１年７月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２２１９２　定价 ２７．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准参考了ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）２．３．４章以及 ＷＨＯ《ＷＨＯ动 物流感诊断和监测手册》（ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＳＲ／ＮＣＳ／２００２．５Ｒｅｖ．１）。 本标准代替ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３《禽流感抗体 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方法：琼脂免疫扩散试验》和ＳＮ／Ｔ１１８２．２— ２００４《禽流感微量红细胞凝集抑制试验》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３、ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４相比， 主要技术变化如下： ———增加了临床诊断方法； ———增加了病原分离鉴定方法； ———增加了禽流感病毒核酸检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：高志强、乔彩霞、徐海聂、张鹤晓、薄清如、谷强、廖秀云、蒲静、罗宝正、汪琳、 张伟、柏亚铎、薛景山、潘文波、周思波、王小玉。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ———ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３； ———ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４。 Ⅰ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 禽流感检疫技术规范 １　范围 本标准规定了进出口禽类及其产品禽流感检疫的技术规范。 本标准适用于禽流感的检验检疫。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ１９４３８．１　禽流感病毒通用荧光ＲＴＰＣＲ检测方法 ＧＢ／Ｔ１９４３８．２　Ｈ５亚型禽流感病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测方法 ＧＢ／Ｔ１９４３８．３　Ｈ７亚型禽流感病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测方法 ＧＢ／Ｔ１９４３８．４　Ｈ９亚型禽流感病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测方法 ＧＢ１９４８９　实验室生物安全通用要求 ３　符号和缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ＡＧＩＤ：　　　　　　　　琼脂凝胶免疫扩散试验 ＡＩ： 禽流感 ＡＩＶ： 禽流感病毒 ｃＤＮＡ： 互补ＤＮＡ ＤＮＡ： 脱氧核糖核酸 ＤＥＰＣ： 焦碳酸乙二酯 ＨＰＡＩ： 高致病性禽流感 ＨＰＡＩＶ： 高致病性禽流感病毒 ＨＰＮＡＩ： 需通报的高致病性禽流感 ＨＡ： 血凝试验 ＨＩ： 血凝抑制试验 ＨＡＵ： 血凝单位 ＩＶＰＩ： 静脉接种致病指数 ＬＰＡＩＶ： 低致病性禽流感病毒 ＬＰＮＡＩ： 需通报的低致病性禽流感 ＭΜＬＶ反转录酶： 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶 ＮＡ： 神经氨酸酶试验 ＮＡＩ： 神经氨酸酶抑制试验 ＮＡＵ： 神经氨酸酶活性单位 ＰＢＳ： 磷酸盐缓冲盐水 １ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ＲＴＰＣＲ： 反转录—聚合酶链反应 ＲＮＡ： 核糖核酸 ＳＰＦ： 无特定病原体 犜犪狇酶： 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶 ２．５ｍｍｏｌ／ＬｅａｃｈｄＮＴＰ：４种脱氧核糖核苷酸的混合物，每种脱氧核糖核苷酸的浓度均为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４　临床诊断 ４．１　流行病学 ＡＩＶ的宿主广泛，各种家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。其中以鸡和火鸡感染禽流感病毒后的 危害最为严重。各种日龄的禽均可感染。ＡＩＶ主要通过患禽间（包括与患禽接触的器皿）的直接接触 和间接接触传染。此外，带毒的飞鸟或水禽常常成为传染源。根据 ＡＩＶ 的致病性不同，可分为 ＨＰＡＩＶ，ＬＰＡＩＶ和无致病性ＡＩＶ。任何ＨＰＡＩＶ分离株都属于 ＨＰＮＡＩ病毒。对于 Ｈ５或 Ｈ７亚型病 毒，如果其血凝素切割位点的氨基酸序列同任何一株强毒力病毒的相应序列相似，即为 ＨＰＮＡＩ病毒 株；如果其血凝素切割位点的氨基酸序列同任何 ＨＰＮＡＩ毒株的相应序列都不同，则为ＬＰＮＡＩ病毒。 对于非 Ｈ５或非Ｈ７的禽流感病毒株，如果不具有高致病性，则认为是ＬＰＡＩＶ。 ４．２　临床症状 ＡＩ的潜伏期从几小时到３ｄ不等。 ＨＰＡＩ常可引起家禽大批发病死亡，常常突然爆发，无任何临床症状而死亡。病程稍长可见精神萎 顿、不食、衰弱、羽毛松乱，头翅下垂，饮欲增加。可出现水样腹泻。鸡冠和肉髯呈暗紫色，头部水肿，有 时可波及到颈部，脚鳞出血等症状。结膜肿胀发炎，有时可见出血。有些病例出现神经症状，抽搐，运动 失调，瘫痪和半瘫痪，失明。鼻腔内有粘性分泌物，病鸡常摇头，呼吸困难，呼吸症状的严重程度取决于 气管的病变程度。对于蛋鸡，通常开始时仅有部分笼舍的鸡发病，然后逐渐传播到邻近的笼舍。出现症 状后可在２４ｈ内发生死亡，死亡高峰在４８ｈ内，但有时病程可达１周，一些病重的母鸡有时可发生康 复。对于肉鸡，精神沉郁，食欲不振等症状相对不明显，开始常仅表现为死亡率增加，也可出现头颈水肿 和神经症状。火鸡的症状同蛋鸡相似，病程为２ｄ～３ｄ或更长，偶尔可见窦部水肿。对于家养鸭和鹅， 表现为精神沉郁，厌食，腹泻等类似蛋鸡的症状，此外可见窦部水肿；幼鸭和幼鹅常表现神经症状。 ４．３　病理变化 ４．３．１　眼观病变 对于最急性病例，除严重的肌肉充血和脱水外，看不到其他病变。但对于一般的急性病例，通常可 看到明显的肉眼病变。头颈部皮下水肿明显。死亡鸡的眼观病变主要表现为大量充血、出血、渗出液或 漏出液和坏死变化。在前驱期症状变化主要是由于眶下窦的肿胀而导致的头面部肿大，冠、肉垂出血， 发绀，水肿。在腿部还可看到充血、出血等。随着病程进展，内脏变化较大，表现为各器官的出血、变性 和坏死。内脏器官浆膜面和粘膜面斑块出血，特别是腺胃、肌胃连接处附近的腺胃粘膜面出血严重。气 管粘膜充血，出血，积有干酪样分泌物，心外膜及冠状沟出血，血管受损，水肿，有出血点，有时可见胰腺 出血或有淡黄色坏死点。 ４．３．２　组织学病变 组织学病变主要见于心脏、脾脏、肾脏、脑、肉髯及卵巢等脏器和组织，主要特征为水肿、充血、出血 和血管周围的淋巴细胞管套形成为特征。在心、脾、肾等内脏气管和组织中，可见到嗜酸性细胞和异嗜 ２ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 性细胞的浸润及坏死灶的形成。脑的病变为充血，坏死，淋巴细胞管套形成，神经胶质细胞浸润和血管 增生等一系列非化脓性脑炎的病理变化。 ５　实验室诊断 ５．１　病原分离鉴定 ５．１．１　实验室生物安全要求 ＡＩＶ病原分离鉴定以及致病性测定应在具有生物安全３级条件的实验室中进行，实验室条件符合 ＧＢ１９４８９要求。 ５．１．２　设备、材料和试剂 ５．１．２．１　设备 ———高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）； ———台式离心机（离心速度３０００ｒ／ｍｉｎ）； ———旋涡振荡器； ———冰箱（２℃～８℃和－２０℃两种）； ———微量可调移液器（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）。 ５．１．２．２　材料和试剂 采样用： ———棉拭子、剪刀、镊子、注射器、１．５ｍＬ离心管、研钵。采样工具应经１２１℃±２℃，１５ｍｉｎ高压 灭菌并烘干； ———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ； ———抗生素：青霉素、链霉素。 鸡胚接种用： ———照蛋器、打孔器、酒精灯； ———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ； ———５％碘酊； ———７０％酒精； ———１．０ｍＬ一次性灭菌注射器； ———石蜡； ———９日龄～１１日龄ＳＰＦ鸡胚。 ＡＧＩＤ鉴定用： ———酒精灯； ———琼脂板，制备方法见附录Ｂ； ———标准抗原，标准阴性和阳性血清。 ＨＡ以及ＨＩ鉴定用： ———９６孔Ｖ型微量反应板，振荡器，２５μＬ微量加样器； ———阿氏（Ａｌｓｅｖｅｒｓ）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录Ｃ； ———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ； ———标准离流感病毒血凝素分型抗原，分型阳性血清和阴性血清。 ＮＡ及ＮＡＩ鉴定用： ３ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ———０．４ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．９的磷酸缓冲液，配制方法见Ｄ．１； ———胎球蛋白溶液，配制方法见Ｄ．２； ———过碘酸盐试剂，配制方法见Ｄ．３； ———亚砷酸盐试剂，配制方法见Ｄ．４； ———硫代巴比妥酸试剂，配制方法见Ｄ．５； ———酸化正丁醇试剂，配制方法见Ｄ．６； ———０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．３ＰＢＳ，配制方法见Ｄ．７。 病毒株致病性测定用： ———６周龄ＳＰＦ鸡，１０只； ———新鲜无菌的鸡胚感染尿囊液，且血凝价大于１／１６； ———无ＲＮＡ酶的带滤芯吸头； ———无ＲＮＡ酶的离心管（１．５ｍＬ）； ———病毒ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩＺＯＬ； ———ＲＴＰＣＲ酶颗粒（如ＡｍｅｒｓｈａｍＲｅａｄｙｔｏＧｏＲＴＰＣＲＢｅａｄｓ或其他等效试剂）； ———ＤＥＰＣ处理的灭菌双蒸水，配制方法见Ｅ．１； ———５０×ＴＡＥ缓冲液，配制方法见Ｅ．２； ———０．８％琼脂糖凝胶，配制方法见Ｅ．３； ———１０×电泳上样缓冲液，配制方法见Ｅ．４； ———ＤＮＡ分子量标准。 ５．１．３　采样、送检和处理 ５．１．３．１　活禽样品 咽喉拭子采样：采样时要将拭子深入喉头及上腭裂来回刮３次～５次，取咽喉分泌液。 泄殖腔拭子采样：将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便。 将采样后的咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有１．０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素 １００００ＩＵ／ｍＬ）的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。 对于小珍禽，直接采集新鲜粪便１．０ｇ以上，放入盛有１．０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉 素１００００ＩＵ／ｍＬ）的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。 ５．１．３．２　死禽及禽肉产品 对于死禽，应采集肠内容物以及包括气管、肺、气囊、小肠、脾、肾、脑、肝、心等组织脏器；对于禽类产 品，可直接采集相应样品２．０ｇ以上。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品２．０ｇ于研钵中充分研磨，再 加１０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００００ＩＵ／ｍＬ）混匀，或置于组织匀浆器中，加入 １０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００００ＩＵ／ｍＬ）匀浆，然后将组织悬液转入无菌１．５ｍＬ 离心管中３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液转入另一无菌１．５ｍＬ离心管中，编号备用。 ５．１．３．３　血清或血浆 用无菌注射器直接吸收至无菌１．５ｍＬ离心管中，编号备用。 ５．１．３．４　样品保存 上述样品应尽快处理，可在４℃保存４ｄ，如要保存更长时间，需保存于－８０℃条件下。 ４ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．１．４　操作步骤 ５．１．４．１　鸡胚病毒分离 ５．１．４．１．１　将９日龄～１１日龄ＳＰＦ鸡胚用照蛋器照视检查，并用铅笔画出气室与胚胎位置，在气室边 缘上２ｍｍ～８ｍｍ处避开血管作一标记，并在鸡胚绒毛尿囊膜血管相对较少一侧气室作标记。 ５．１．４．１．２　将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用５％碘酊消毒蛋壳气室后，用７０％的酒精脱碘消毒，用 无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔（勿损伤壳膜）。 ５．１．４．１．３　用１．０ｍＬ注射器吸取０．２ｍＬ处理好的样品，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜注入尿囊腔， 如图１所示。每个样品接种５个鸡胚。 图１ ５．１．４．１．４　接种后，加热熔化石蜡封孔，于３５℃～３７℃孵化箱内孵育９６ｈ，１８ｈ后开始观察鸡胚死亡 情况，以后每间隔８ｈ观察一次，记录鸡胚死亡情况。 ５．１．４．１．５　收集尿囊液：对于１８ｈ以后的死胚以及９６ｈ仍存活的鸡胚，于４℃冷却４ｈ～１２ｈ后，无 菌收取尿囊液。 ５．１．４．２　尿囊液血凝性测定 对于５．１．４．１．５收集的尿囊液，应用血凝试验测定其血凝性： ———在微量反应板的１孔～１２孔每孔均加入０．０２５ｍＬＰＢＳ； ———吸取０．０２５ｍＬ鸡胚尿囊液加入第１孔，混匀； ———从第１孔吸取０．０２５ｍＬ液体加入第２孔，混匀后吸取０．０２５ｍＬ液体加入第３孔，如此对倍 稀释至第１１孔，吸弃０．０２５ｍＬ； ———每孔再加入０．０２５ｍＬＰＢＳ； ———每孔加入０．０２５ｍＬ１％的鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）； ———轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置４０ｍｉｎ后观察结果（也可于４℃下静置６０ｍｉｎ后观察 结果）。 ５．１．４．３　结果判定 　　对照孔（第１２孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流 淌，完全血凝（不流淌）的最高稀释倍数代表１个血凝单位（ＨＡＵ）。若尿囊液具有血凝性， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 尿囊液 中可能含有禽流感病毒；若尿囊液不具有血凝性，则用此尿囊液继续接种ＳＰＦ鸡胚进行传代，连传２代， ５ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 再检测尿囊液的血凝性，若仍无血凝性，则判为禽流感病毒分离阴性。 ５．１．４．４　犃型流感病毒特异性抗原鉴定（犃犌犐犇试验） ５．１．４．４．１　抗原制备 从具有血凝性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ冲洗后，用研磨器磨碎后连续 冻融３次～４次，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后取上清液，按终浓度０．１％的量加入甲醛溶液。置３７℃灭 活３６ｈ后，用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定。 ５．１．４．４．２　打孔 在制备的琼脂板上，按图２打孔，孔径约５ｍｍ，孔距２ｍｍ～５ｍｍ。将孔中的琼脂用针头轻轻挑 出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。 图２ ５．１．４．４．３　封底 用酒精灯轻烤平皿或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。 ５．１．４．４．４　加样 用微量移液器吸取标准阳性血清加到○Ｓ孔，标准抗原滴入孔中，按照５．１．４．４．１制备好的抗原悬 液加入其他外周孔，每孔均以加满不溢为度。每加一个样品换一个吸头。 ５．１．４．４．５　作用 加样完毕后，静置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，然后将平皿水平倒置或玻璃板水平正置放入湿盒内，于３７℃温 箱中作用，分别于作用２４ｈ、４８ｈ及７２ｈ后观察并记录结果。 ５．１．４．４．６　结果判定 ５．１．４．４．６．１　在暗背景下，将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准抗原悬液孔与中心标准阳性血 清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做。 ５．１．４．４．６．２　若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间出现沉淀线，并与标准抗原悬液的沉淀线末 端相吻合，即可判定被检抗原悬液为阳性（如图２所示１号孔）。 ５．１．４．４．６．３　若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线，但标准抗原悬液的沉淀线一 端弯向抗原悬液孔（如图２所示３号孔），则被检抗原悬液判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱 阳性者，判为阳性）。 ５．１．４．４．６．４　若被检抗原悬液与中心标准阳性血清孔之间不出现沉淀线且标准抗原悬液沉淀线直向 被检抗原悬液孔或向其外侧偏弯者（如图２所示２号孔），则被检抗原悬液判为阴性。 ６ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．１．４．４．６．５　若被检抗原悬液与中心标准阳性血清之间的沉淀线与标准抗原悬液和中心标准阳性血 清孔之间的沉淀线交叉直伸（如图２所示４号孔），则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特 异性反应则判为阴性。 ５．１．４．５　血凝素亚型鉴定 ５．１．４．５．１　总则 当鸡胚尿囊液具有血凝活性，且经ＡＧＩＤ试验证明其中含有Ａ型流感病毒后，采用血凝和血凝抑 制试验对样品中的病毒进行亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清。 ５．１．４．５．２　步骤 按照５．１．４．２所述的操作方法进行ＨＡ。 根据ＨＡ试验结果配制４ＨＡＵ的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释 倍数除以４即为４ＨＡＵ抗原的稀释倍数。 在微量反应板的１孔～１１孔加入０．０２５ｍＬＰＢＳ，第１２孔加入０．０５ｍＬＰＢＳ。 吸取０．０２５ｍＬ血清加入第１孔内，充分混匀后吸取０．０２５ｍＬ于第２孔内，如此对倍稀释至第 １０孔，吸弃０．０２５ｍＬ。 于１孔～１１孔加入含４ＨＡＵ 的病毒悬液，在２０℃～２５℃下静置３０ｍｉｎ（也可于４ ℃下静 置６０ｍｉｎ）。 每孔加入０．０２５ｍＬ１％的鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。 轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置４０ｍｉｎ后观察结果（也可于４℃下静置６０ｍｉｎ后观察结 果）。 ５．１．４．５．３　结果判定 红细胞均匀分散在孔底周围，将板倾斜，红细胞不流淌判为完全凝集，记作“＋＋＋＋”；７５％凝集记 作“＋＋＋”；５０％凝集记作“＋＋”；２５％凝集记作“＋”。红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时 呈泪珠状流淌，判定为不凝集或血凝抑制，记作“－”。 以完全抑制４个 ＨＡＵ抗原的血清最高稀释倍数作为 ＨＩ滴度。 只有阴性对照孔血清滴度不大于１／４（或表示为２２），阳性对照孔血清误差不超过１个滴度，红细胞 对照无自凝现象，试验结果才有效。ＨＩ价小于或等于１／８（或表示为２３），判定 ＨＩ试验阴性，说明分离 的病毒与抗血清的亚型不一致；ＨＩ价等于１／１６（或表示为２４）为可疑，需重复试验；ＨＩ价大于或等于 １／３２（或表示为２５）为阳性，说明分离的病毒与抗血清的亚型一致。 ５．１．４．６　神经氨酸酶亚型鉴定 ５．１．４．６．１　总则 ＮＡ和ＮＡＩ可用于鉴定禽流感分离株神经氨酸酶亚型和感染禽鸟病毒的神经氨酸酶亚型抗体。 ＮＡ亚型鉴定要求有ＮＡ亚型的参考抗原和参考抗血清。本试验的原理为底物胎球蛋白在神经氨酸酶 的作用下，可释放出唾液酸，而亚砷酸盐试剂可终止神经氨酸酶的活性。唾液酸可与硫代巴比妥酸作用 生成粉红色产物。释放的唾液酸的量与生成的粉红色产物的量呈比例关系，而生色产物的量，可用分光 光度计测定，这样可测知标本中神经氨酸酶活性，并可选择用于ＮＡＩ的标准剂量。神经氨酸酶活性抑 制实验是测定血清抑制标准量酶活性的效价。 因ＮＡＩ测定结果是禽流感病毒神经氨酸亚型划分的主要依据之一。有时该法也用于了解禽流感 病毒神经氨酸酶抗原性变异和血清诊断等方面。ＮＡＩ测定不受血清中非特异性抑制素的影响，但易受 ７ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 病毒血凝素抗体的影响即空间干扰。因此在禽流感病毒鉴定中，应使用只针对神经氨酸酶的单价血清。 ５．１．４．６．２　犖犃 ５．１．４．６．２．１　将病毒液或参考抗原用ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．３）作系列稀释，以０．５ｌｏｇ１０（１／３．１６）为 间距作以下稀释度：０（未稀释的病毒液或参考抗原），１００．５，１０１，１０１．５，１０２，１０２．５，１０３。例如，１００．５稀释： ０．１ｍＬ未稀释的病毒液或参考抗原中加入０．２１６ｍＬ的ＰＢＳ；１０－１稀释：０．１ｍＬ１０－０．５稀释的病毒液 或参考抗原中加入０．２１６ｍＬ的ＰＢＳ。 ５．１．４．６．２．２　对每一稀释度的病毒液或参考抗原均采用平行的两管进行测试，每管中分别加入 ０．０５ｍＬ各个稀释度的病毒液或参考抗原，然后加入０．０５ｍＬ的ＰＢＳ，然后每管中再加入０．１ｍＬ胎球 蛋白溶液。并设定阴性对照，即０．１ｍＬ的ＰＢＳ中加入０．１ｍＬ胎球蛋白溶液。 ５．１．４．６．２．３　充分混合后加盖于３７℃水浴１８ｈ。 ５．１．４．６．２．４　从水浴中取出试管，室温冷却２ｍｉｎ，每管加入０．１ｍＬ过碘酸盐试剂，充分混合，置室温 下２０ｍｉｎ。 ５．１．４．６．２．５　每管缓慢加入１．０ｍＬ砷试剂，溶液呈现棕色，强烈摇荡直至棕色消失并呈现乳白色为 止（试验可在此步暂停，测定物于４℃冰箱加盖存放）。 ５．１．４．６．２．６　每管加入２．５ｍＬ硫代巴比妥酸试剂，强烈摇荡后。立刻置沸水浴中煮１５ｍｉｎ，此时溶 液呈粉红色，颜色深度与游离唾液酸的量呈比例关系。 ５．１．４．６．２．７　冰浴冷却，然后每管加入３．０ｍＬ酸化正丁醇，加盖后旋涡振荡１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，２００ｒ／ ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。 ５．１．４．６．２．８　将上层液体转入比色皿。用分光光度计依次测定其在５４９ｎｍ处的光密度值（ＯＤ），测 定前用阴性对照管调零点。 ５．１．４．６．２．９　以病毒液或参考抗原的稀释度对数的绝对值作为横坐标，以神经氨酸酶活性（即５４９ｎｍ 处测得的ＯＤ值）为纵坐标作线性回归，绘制神经氨酸酶活性曲线（见图３），并将５４９ｎｍ处ＯＤ值为 ０．５００的病毒液或参考抗原的稀释度定义为一个 ＮＡＵ。例如图３所示，作１∶６５０（１０－２．８１）稀释的 ０．０５ｍＬ病毒液为１个ＮＡＵ。 图３ ５．１．４．６．３　抗血清的标化 ５．１．４．６．３．１　ＮＡＩ试验要求有神经氨酸酶亚型的参考抗原、参考抗血清和正常阴性血清。依据 ８ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．１．４．６．２的测定结果用ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．３）将参考抗原稀释为１个ＮＡＵ。 ５．１．４．６．３．２　将参考抗血清和正常阴性血清用ＰＢＳ（ｐＨ７．２）作系列稀释，以０．５ｌｏｇ１０（１／３．１６）为间距 作以下稀释度：０（未稀释的血清），１０－０．５，１０－１，１０－１．５，１０－２，１０－２．５，１０－３，１０－３．５。例如，１０－０．５稀释： ０．１ｍＬ未稀释的血清中加入０．２１６ｍＬ的ＰＢＳ；１０－１稀释：０．１ｍＬ１０－０．５稀释的血清中加入０．２１６ｍＬ 的ＰＢＳ。 ５．１．４．６．３．３　每一稀释度参考抗血清和正常阴性血清均采用平行的两管进行测试，每管中分别加入 ０．０５ｍＬ各个稀释度的血清，然后加入０．０５ｍＬ１个ＮＡ活性单位的参考抗原或病毒液，并设定阴性对 照，即０．１ｍＬ的ＰＢＳ。 ５．１．４．６．３．４　室温作用３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ。 ５．１．４．６．３．５　每管加入０．１ｍＬ胎球蛋白溶液，以下操作按照５．１．４．６．２．３～５．１．４．６．２．８进行。 ５．１．４．６．３．６　根据参考抗血清与正常阴性血清的测定结果，求出经血清作用后的剩余酶活性百分数。 具体计算方法见式（１）： 剩余酶活性百分数＝（每一稀释度参考抗血清作用后的ＯＤ值）／ （同一稀释度正常血清作用后的ＯＤ值）×１００％ ………………（１） ５．１．４．６．３．７　以抗血清的稀释度对数的绝对值作为横坐标，以未被抗血清抑制的酶活性百分数为纵坐 标作线性回归，并绘图（见图４），计算出能抑制５０％酶活性的参考抗血清稀释度。例如图４所示，作 １∶２８０（１０－２．４５）稀释的０．０５ｍＬ抗血清可抑制５０％的神经氨酸酶活性。 图４ ５．１．４．６．４　犖犃犐鉴定神经氨酸酶亚型 ５．１．４．６．４．１　将待检病毒液用ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．３）稀释至１个 ＮＡＵ（即５４９ｎｍ 处 ＯＤ值 为０．５００），取１．５ｍＬ置于冰上备用。 ５．１．４．６．４．２　取２０支试管，分为２组，每组１０支，分别标记为Ｐ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３……Ｎ９备用。 ５．１．４．６．４．３　根据５．１．４．６．３的结果，将Ｎ１～Ｎ９每种参考抗血清稀释至能抑制５０％酶活性的稀释 度，取０．２５ｍＬ备用。 ５．１．４．６．４．４　标记为 Ｎ１的２支试管，分别加入５．１．４．６．４．１稀释的０．０５ｍＬ待检病毒液和 ５．１．４．６．４．３稀释的０．０５ｍＬＮ１亚型参考抗血清，标记为Ｎ２～Ｎ９的试管，依此类推，进行同样的操 作；对于标记为Ｐ的２支试管，分别加入５．１．４．６．４．１稀释的０．０５ｍＬ待检病毒液和０．０５ｍＬＰＢＳ。 ９ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 如图５所示。 图５ ５．１．４．６．４．５　用ＰＢＳ将Ｎ１～Ｎ９的神经氨酸酶亚型参考抗原分别稀释至１个 ＮＡＵ（即５４９ｎｍ处 ＯＤ值为０．５００），取０．２ｍＬ置于冰上备用。 ５．１．４．６．４．６　取２７支试管分为３组，每组９支，其中１组标记为 ＶＣ１～ＶＣ９；其余２组分别标记为 ＳＣ１～ＳＣ９。 ５．１．４．６．４．７　标记为ＶＣ１的试管，分别加入５．１．４．６．４．５稀释的Ｎ１亚型参考抗原和０．０５ｍＬＰＢＳ， 标记为 ＶＣ２～ＶＣ９的试管，依此类推，进行同样的操作；对于标记为ＳＣ１的２支试管，分别加入 ５．１．４．６．４．５稀释的Ｎ１亚型参考抗原和５．１．４．６．４．３稀释的０．０５ｍＬＮ１亚型参考抗血清，标记为 ＳＣ２～ＳＣ９的试管，依此类推，进行同样的操作。如图６所示。 图６ ５．１．４．６．４．８　将所有检测管和对照管于室温温育６０ｍｉｎ。 ５．１．４．６．４．９　每管加入０．１ｍＬ胎球蛋白溶液，以下操作按照５．１．４．６．２．３～５．１．４．６．２．８进行。 ５．１．４．６．５　结果判定 所有抗原对照管均应呈粉红色；加相应抗血清的对照管应无色或仅出现轻微的颜色，表明神经氨酸 酶活性受到相应参考抗血清的抑制。否则，结果无效。 如果加入参考抗血清的被检病毒液管同阴性对照管（即被检病毒液加ＰＢＳ的对照管）相比较，颜色 消失或锐减，即可判定该病毒液的神经氨酸酶亚型。 如果该病毒液对不同的神经氨酸酶亚型抗血清出现交叉反应，则需要进一步对该病毒液的ＮＡ基 因进行序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 比对来判定该病毒液的神经氨酸酶亚型。 ５．１．４．７　病毒株致病性测定 ５．１．４．７．１　犐犞犘犐测定 ５．１．４．７．１．１　将鸡胚感染尿囊液用灭菌生理盐水作１／１０稀释，以０．１ｍＬ／羽的量经静脉接种上述 ＳＰＦ鸡。 ５．１．４．７．１．２　接种后，每隔２４ｈ观察１次，连续观察１０天，根据每只鸡的症状每天进行打分；正常鸡 记为０，病鸡记为１，重病鸡记为２，死鸡记为３（病鸡和重病鸡的判定主要依据临床表观，仅表现下述其 ０１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 中一种症状的判为病鸡，而表现下述其中多种症状的判为重病鸡。作为判定依据的症状包括：呼吸症状， 精神沉郁，腹泻，暴露皮肤或鸡冠肉髯发绀，头部肿胀，神经症状。死亡鸡在其死后的每次观测都记为３）。 ５．１．４．７．１．３　按式（２）计算ＩＶＰＩ值。 ＩＶＰＩ值＝每只鸡在１０ｄ内所有数字之和／１０只鸡×１０ｄ ………………（２） 如ＩＶＰＩ值为３．００，说明所有鸡在２４ｈ内全部死亡，如ＩＶＰＩ值为０．００，说明１０ｄ内所有鸡都没有 表现出５．１．４．７．１．２所述的症状。 ５．１．４．７．１．４　结果判定：当ＩＶＰＩ值大于１．２时，判定此分离的病毒为 ＨＰＮＡＩ病毒。 ５．１．４．７．２　血凝素裂解位点氨基酸序列确定 注：对于按照５．１．４．７．１进行ＩＶＰＩ测定，结果为低致病性的 Ｈ５和 Ｈ７的禽流感病毒，需进一步确定血凝素裂解位 点的氨基酸序列。 ５．１．４．７．２．１　犚犜犘犆犚扩增引物 采用以下引物或其他等效引物扩增包含血凝素裂解位点的基因序列。 ———Ｈ５ＨＡＲＴＰＣＲ引物：ＡＩＨ５Ｆ：５’ＡＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴ３’（２１ｎｔ） ＡＩＨ５Ｒ１：５’ＣＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＹＡＡＡＴ３’（２２ｎｔ） ＡＩＨ５Ｒ２：５’ＴＴＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＡ３’（２３ｎｔ） ———Ｈ７ＨＡＲＴＰＣＲ引物：ＡＩＨ７Ｆ：５’ＧＧＧＡＴＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＹＴＣＡＡＡＴ３’（２４ｎｔ） ＡＩＨ７Ｒ：５’ＴＴＣＹＭＡＡＣＴＴＡＴ ＡＴＡ ＣＡＡＡＴＲＧＴＧＣＡ３’（２６ｎｔ） 　　以上引物浓度均为２５ｐｍｏｌ／μＬ。病毒ＲＮＡ提取见ＧＢ／Ｔ１９４３８．１。 ５．１．４．７．２．２　目的片段的犚犜犘犆犚扩增 ＲＴＰＣＲ体系为５０μＬ，按表１配制反应体系。对于引物ＡＩＨ５Ｒ１和ＡＩＨ５Ｒ２，使用前等体积混合。 表１　犚犜犘犆犚反应体系配置表 试　　剂 体　　积 灭菌ＤＥＰＣ水 ３８μＬ ＲＴＰＣＲ酶颗粒 １粒 上游引物：ＡＩＨ５Ｆ（Ｈ５）或ＡＩＨ７Ｆ（Ｈ７） １．０μＬ 下游引物：Ｈ５：ＡＩＨ５Ｒ１／ＡＩＨ５Ｒ２（Ｈ５）或ＡＩＨ７Ｒ（Ｈ７） １．０μＬ 模板ＲＮＡ １０μＬ ５．１．４．７．２．３　犘犆犚反应 将加样后的ＰＣＲ管放入ＰＣＲ检测仪内，记录样本摆放顺序。 反应参数设置： ———第一阶段，反转录４２℃／１ｈ； ———第二阶段，预变性９４℃／３ｍｉｎ； ———第三阶段，９４℃／１ｍｉｎ，５３℃／１ｍｉｎ，７２℃／２．５ｍｉｎ，３０个循环； ———第四阶段，７２℃／８ｍｉｎ。 ５．１．４．７．２．４　电泳 ＲＴＰＣＲ完毕，用０．８％的琼脂糖凝胶，取１０μＬＰＣＲ扩增产物进行电泳，检测约１．７ｋｂ的扩增产物。 １１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．１．４．７．２．５　序列测定分析 对扩增的产物直接进行序列测定或将目的片段克隆后进行序列测定，并测得的序列进行推导氨基 酸序列分析。 ５．１．４．７．２．６　判定 对于Ｈ５亚型和 Ｈ７亚型病毒，如果血凝素裂解位点氨基酸基元为ＢＸＢＲ（Ｂ，代表精氨酸或赖氨 酸；Ｘ，代表非碱性氨基酸；Ｒ，代表精氨酸），判定为ＨＰＮＡＩ病毒；而血凝素裂解位点氨基酸基元为ＢＸ ＸＲ，ＢＸＲ，ＸＸＸＲ和ＢＸＸＫ（Ｂ，代表精氨酸或赖氨酸；Ｘ，代表非碱性氨基酸；Ｒ，代表精氨酸；Ｋ， 代表赖氨酸），则判定为ＬＰＮＡＩ病毒。 ５．２　血清学检测方法 ５．２．１　琼脂免疫扩散试验检测禽流感病毒抗体 ５．２．１．１　设备、材料和试剂 ５．２．１．１．１　设备 ———培养箱； ———分析天平； ———冰箱（２℃～８℃）。 ５．２．１．１．２　材料和试剂 ———磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、叠氮钠、琼脂糖，均匀分析纯。 ———器材：吸管、量筒、平皿（规格为９０ｍｍ×１５ｍｍ）或玻璃板（规格２６０ｍｍ×１２０ｍｍ），三角瓶 （２５０ｍＬ～５００ｍＬ），内径约５ｍｍ金属打孔器，２００μＬ可调微量移液器和吸头、湿盒等； ———禽流感琼扩抗原，标准阳性血清和标准阴性血清，由指定单位提供。 ５．２．１．２　样品前处理 按常规方法采血分离血清。应无溶血，无细菌污染。保存于４℃。 ５．２．１．３　操作方法 ５．２．１．３．１　制备琼脂板 琼脂板的制备见附录Ｂ。 ５．２．１．３．２　打孔 反应孔现用现打。在制备的琼脂板上，按图７或图８打孔，孔径约５ｍｍ，孔距２ｍｍ～５ｍｍ。将 孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘，以免渗漏。 图７ ２１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 图８ ５．２．１．３．３　封底 用酒精灯轻烤平皿或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏。 ５．２．１．３．４　加样 用微量移液器吸取抗原悬液加到?孔，阳性血清对照加入孔中，被检血清按照顺序分别加入其余 各孔中，每孔均以加满不溢为度。每加一个样品换一个吸头。 ５．２．１．３．５　作用 加样完毕后，静置１０ｍｉｎ，然后将平皿水平倒置或玻璃板水平正置放入湿盒内，放入湿盒于室温 ２２℃～２５℃下作用４８ｈ～７２ｈ，分别于２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ观察并记录结果。 ５．２．１．３．６　结果判定 ５．２．１．３．６．１　在暗背景下，将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔之间出现一 条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立，否则视为无效，需重做。 ５．２．１．３．６．２　若被检血清孔与中心抗原孔之间出现沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相吻合， 则被检血清判为阳性（如图７所示１号孔）。 ５．２．１．３．６．３　若被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线，但标准阳性血清的沉淀线一端弯向被检 血清孔（如图７所示３号孔），则此孔的被检血清判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判 为阳性）。 ５．２．１．３．６．４　若被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线且标准阳性血清的沉淀线直向被检血清 孔或向其外侧偏弯者（如图７所示２号孔），则被检血清判为阴性。 ５．２．１．３．６．５　若被检血清孔与中心抗原孔之间的沉淀线与标准阳性血清和抗原孔之间的沉淀线交叉 直伸（如图７所示４号孔），则判为非特异性反应，应重复该试验。若仍出现非特异性反应则判为阴性。 ３１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．２．２　血凝和血凝抑制试验对禽流感病毒抗体的检测和分型 ５．２．２．１　设备、材料和试剂 ５．２．２．１．１　设备 ———恒温箱； ———微型振荡器； ———冷冻离心机； ———冰箱（２℃～８℃）。 ５．２．２．１．２　材料和试剂 ———器材：吸管、量筒、湿盒等。９６孔Ｖ型微量反应板，振荡器，２５μＬ微量加样器； ———阿氏（Ａｌｓｅｖｅｒｓ）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录Ｃ； ———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ； ———标准禽流感病毒血凝素分型抗原，分型阳性血清和阴性血清，由指定单位提供。 ５．２．２．２　样品前处理 按常规方法采血分离血清。应无溶血，无细菌污染。保存于４℃或－２０℃。除鸡外，其余禽类的 血清须确定是否存在非特异性凝集。如存在非特异性凝集，血清按如下方法进行处理：每０．５ｍＬ血清 加２５μＬ鸡红细胞泥，轻轻振荡，２０℃～２５℃静置３０ｍｉｎ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸取经红细胞吸附 后的血清待检。 ５．２．２．３　操作方法 ５．２．２．３．１　血凝试验 首先进行血凝试验，见表２。 表２　禽流感微量血凝试验 ５．２．２．３．２　步骤 ５．２．２．３．２．１　在微量反应板的每孔均加入０．０２５ｍＬＰＢＳ。 ５．２．２．３．２．２　吸取０．０２５ｍＬ禽流感病毒血凝素分型抗原加入第１孔，反复吹打混匀。 ５．２．２．３．２．３　从第１孔吸取０．０２５ｍＬ液体加入第２孔，混匀后吸取０．０２５ｍＬ液体加入第３孔，如此 ４１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 对倍稀释至第１１孔，第１１孔混匀后吸弃０．０２５ｍＬ。 ５．２．２．３．２．４　每孔再加入０．０２５ｍＬＰＢＳ。 ５．２．２．３．２．５　每孔加入０．０２５ｍＬ１％的鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。 ５．２．２．３．２．６　轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置４０ｍｉｎ后观察结果（也可于４℃下静置６０ｍｉｎ后 观察结果）。 ５．２．２．３．２．７　血凝效价确定：对照孔（第１２孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观 察红细胞有无呈泪珠状流淌，完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，代表１个血 凝单位（ＨＡＵ）。 ５．２．２．３．２．８　根据５．２．２．３．２．７的结果，配置４ＨＡＵ的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作 为终点，终点稀释倍数除以４即为４ＨＡＵ抗原的稀释倍数。例如表２抗原效价为２７（１∶１２８），４ＨＡＵ 抗原的稀释倍数为２５（１∶３２）。 ５．２．２．３．２．９　将２５μＬ含４个血凝单位的抗原用ＰＢＳ做等量倍比稀释，使每孔（２５μＬ）含有２ＨＡＵ、 １ＨＡＵ、０．５ＨＡＵ和０．２５ＨＡＵ，每孔补加２５μＬＰＢＳ，再加入１％鸡红细胞２５μＬ，判定血凝结果与预期 结果是否相符合。２ＨＡＵ、１ＨＡＵ 孔红细胞应出现完全凝集，０．５ＨＡＵ 孔红细胞应出现５０％凝集， ０．２５ＨＡＵ孔红细胞应不凝集。若不相符，应重新配制抗原，测定效价。以下为血凝抑制试验，见表３。 表３　禽流感微量血凝抑制试验 ５．２．２．３．２．１０　在微量反应板的每孔均加入０．０２５ｍＬＰＢＳ。 ５．２．２．３．２．１１　吸取０．０２５ｍＬ被检血清加入第１孔内，充分混匀后吸取０．０２５ｍＬ于第２孔内，如此 对倍稀释至第１２孔，混匀后吸弃０．０２５ｍＬ。 ５．２．２．３．２．１２　每孔加入４ＨＡＵ的抗原０．０２５ｍＬ，在２０℃～２５℃下静置３０ｍｉｎ（也可于４℃下静置 ６０ｍｉｎ）。 ５．２．２．３．２．１３　每孔加入０．０２５ｍＬ１％的鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）。 ５．２．２．３．２．１４　轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置４０ｍｉｎ后观察结果（也可于４℃下静置６０ｍｉｎ 后观察结果）。 ５．２．２．３．２．１５　每次测定应设已知滴度的阳性血清、阴性血清和红细胞对照（仅含２５μＬ１％鸡红细胞 和５０μＬＰＢＳ）。 ５．２．２．４　结果判定 红细胞均匀分散在孔底周围，将板倾斜，红细胞不流淌判为完全凝集，记作“＋＋＋＋”；７５％凝集记 作“＋＋＋”；５０％凝集记作“＋＋”；２５％凝集记作“＋”。红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时 ５１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 呈泪珠状流淌，判定为不凝集或血凝抑制，记作“－”。 检查各个对照。以完全抑制４个 ＨＡＵ抗原的血清最高稀释倍数作为 ＨＩ滴度。阴性血清滴度不 大于１／４（或表示为２２）；阳性血清误差不超过１个滴度，红细胞对照无自凝现象，试验有效。 ＨＩ价大于或等于１／３２（或表示为２５）为阳性，ＨＩ价等于１／１６（或表示为２４）为可疑，需重复试验， 重复试验结果仍为１／１６（或表示为２４），判为阳性。 ５．３　禽流感病毒核酸检测方法 ５．３．１　犚犜犘犆犚检测与分型 ５．３．１．１　设备、材料和试剂 ５．３．１．１．１　设备 ———高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）； ———台式离心机（离心速度３０００ｒ／ｍｉｎ）； ———混匀器； ———冰箱（２℃～８℃和－２０℃两种）。 ５．３．１．１．２　材料和试剂 ———病毒ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩＺＯＬ； ———ＭＭＬＶ反转录酶（２００Ｕ／μＬ）及相应５×反转录反应缓冲液； ———ＲＮＡ酶抑制剂（４０Ｕ／μＬ）； ———犜犪狇ＤＮＡ聚合酶及相应１０×缓冲液、２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２； ———ＤＥＰＣ处理的灭菌双蒸水，配制方法见Ｅ．１； ———５０×ＴＡＥ缓冲液，配制方法见Ｅ．２； ———１％琼脂糖凝胶板，配制方法见Ｅ．３； ———１０×电泳上样缓冲液，配制方法见Ｅ．４； ———２．５ｍｍｏｌ／ＬｅａｃｈｄＮＴＰ； ———ＤＮＡ分子量标准。 ５．３．１．１．３　引物或其他等效引物 ———反转录引物：Ｕｎｉ１２：５’ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ３’ ———通用ＲＴＰＣＲ引物：Ｍ２２９Ｕ５’ＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＣ３’ Ｍ２２９Ｌ５’ＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣ３’ ———Ｈ５引物：Ｈ５３８０Ｕ：５’ＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧ３’ Ｈ５３８０Ｌ：５’ＡＡＣＴＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＡＴ３’ ———Ｈ７引物：Ｈ７５０１Ｕ：５’ＡＡＴＧＣＡＣＡＲＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＹ３’ Ｈ７５０１Ｌ：５’ＴＧＡＹＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡ３’ 以上引物浓度均为２５ｐｍｏｌ／μＬ。 ５．３．１．２　采样、送检和处理 同５．１．３。 ６１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ５．３．１．３　操作方法 ５．３．１．３．１　病毒犚犖犃提取 见ＧＢ／Ｔ１９４３８．１。 ５．３．１．３．２　反转录 取５μＬＲＮＡ，加１μＬ反转录引物，７０℃５ｍｉｎ；冰浴２ｍｉｎ，继续加入：５×反转录反应缓冲液 ４μＬ，２．５ｍｍｏｌｄＮＴＰｓ２μＬ，ＭＭＬＶ反转录酶０．５μＬ，ＲＮＡ酶抑制剂０．５μＬ，ＤＥＰＣ处理的灭菌双 蒸水１１μＬ。 ４２℃水浴１ｈ，合成ｃＤＮＡ链。取出后可以直接进行ＰＣＲ。试验中同时设立阳性和阴性对照。 ５．３．１．３．３　犘犆犚 根据扩增目的不同，选择不同的上／下游引物，Ｍ２２９Ｕ／Ｍ２２９Ｌ是型特异性引物，用于扩增禽流感 病毒的 Ｍ 基因片段；Ｈ５３８０Ｕ／Ｈ５３８０Ｌ、Ｈ７５０１Ｕ／Ｈ７５０１Ｌ、Ｈ９７３２Ｕ／Ｈ９７３２Ｌ分别特异性扩增 Ｈ５、Ｈ７、亚型血凝素基因片段。 ＰＣＲ为５０μＬ体系，如表４所示。 表４　犘犆犚反应体系配置表 试　　剂 体　　积 灭菌双蒸水 ３７．５μＬ 反转录产物 ４μＬ 上游引物 ０．５μＬ 下游引物 ０．５μＬ １０×ＰＣＲ缓冲液 ５μＬ ２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２ １．５μＬ ２．５ｍｍｏｌ／ＬｅａｃｈｄＮＴＰ ２．０μＬ 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶５Ｕ／μＬ ０．５μＬ 　　首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。全部加完后， 混悬，瞬时离心，使液体都沉降到ＰＣＲ管底。在每个ＰＣＲ管中加入１滴液体石蜡（约２０μＬ）。循环参 数为９５℃５ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５２℃４５ｓ，７２℃４５ｓ，循环３０次，７２℃延伸６ｍｉｎ结束。设立阳性对照 和阴性对照。 ５．３．１．３．４　电泳 制备１．０％琼脂糖凝胶板。取５μＬＰＣＲ产物与０．５μＬ１０×电泳上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝 胶板的加样孔中。加入分子量标准。盖好电泳仪，插好电极，５Ｖ／ｃｍ电压电泳，３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ。在紫 外线灯下观察照相存档；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档。用分子量标准比较判断ＰＣＲ片段 大小。 ５．３．１．３．５　结果判定 在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带时判定结果。用 Ｍ２２９Ｕ／Ｍ２２９Ｌ检测，出现大 ７１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 小为２２９ｂｐ扩增片段时，判定为禽流感病毒阳性，否则判定为阴性；用 Ｈ５３８０Ｕ／Ｈ５３８０Ｌ检测，出现 大小为３８０ｂｐ扩增片段时，判定为 Ｈ５血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性；用７５０１Ｕ／Ｈ７ ５０１Ｌ检测，出现大小为５０１ｂｐ扩增片段时，判定为 Ｈ７血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。 对于阳性扩增，应对扩增片段进行序列测定分析确认。 ５．３．２　荧光犚犜犘犆犚检测与分型 可直接用于临床样品的检测。具体方法见 ＧＢ／Ｔ１９４３８．１、ＧＢ／Ｔ１９４３８．２、ＧＢ／Ｔ１９４３８．３ 和ＧＢ／Ｔ１９４３８．４。 ８１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （规范性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方 　　所用试剂均为分析纯以上。 犃．１　犃液 ０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠水溶液 ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ２７．６ｇ，溶于蒸馏水中，最后稀释至１０００ｍＬ。 犃．２　犅液 ０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠水溶液 Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ５３．６ｇ，（或Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ７１．６ｇ或Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ３５．６ｇ）加蒸馏水 溶解，最后稀释至１０００ｍＬ。 犃．３　０．０１犿狅犾／犔、狆犎７．２磷酸盐缓冲生理盐水的配制 ０．２ｍｏｌ／ＬＡ液１４ｍＬ ０．２ｍｏｌ／ＬＢ液３６ｍＬ 加氯化钠８．５ｇ 用蒸馏水定容至１０００ｍＬ，高压灭菌后室温保存。 ９１ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犅 （规范性附录） 琼脂板制备方法 　　琼脂糖　　　　　　０．９ｇ 氯化钠　　　　　　８．０ｇ 叠氮钠　　　　　　０．１ｇ 用ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ定容至１００ｍＬ，１００℃沸水浴中至充分融化，冷却至４５℃～５５℃时， 将洁净干热灭菌的平皿或玻璃板置于平台上，倒入琼脂溶液，使琼脂凝胶厚度达２ｍｍ～３ｍｍ，待自然 冷却凝固后，放入湿盒中，４℃冰箱保存备用。 ０２ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犆 （规范性附录） 阿氏（犃犾狊犲狏犲狉狊）液、鸡红细胞悬液配制方法 犆．１　阿氏（犃犾狊犲狏犲狉狊）液配制 葡萄糖　　　　　　２０．５ｇ 二水合柠檬酸钠　　　　　　８．０ｇ 柠檬酸　　　　　　０．５５ｇ ＮａＣｌ　　　　　　 ４．２ｇ 溶于蒸馏水，并稀释至１０００ｍＬ，用１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ或１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ调节ｐＨ至６．１，用孔径 为０．２２μｍ的滤膜进行过滤除菌。 犆．２　１％鸡红细胞悬液制备 采集至少３只ＳＰＦ公鸡或无禽流感和新城疫血凝抑制抗体的公鸡血液与等体积阿氏液混合摇匀， 用ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗涤３次，每次均以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，洗涤后用ＰＢＳ配成体积分数 为１％红细胞悬液，４℃保存备用。 １２ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犇 （规范性附录） 犖犃及犖犃犐相关溶液配制 　　所用试剂均为分析纯以上。 犇．１　０．４犿狅犾／犔、狆犎５．９磷酸盐缓冲液配方 犇．１．１　犃液 ０．４ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠水溶液 ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ２７．６ｇ，溶于蒸馏水中，最后稀释至５００ｍＬ。 犇．１．２　犅液 ０．４ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠水溶液 Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ５３．６ｇ，（或Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ７１．６ｇ或Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ３５．６ｇ）加蒸馏水 溶解，最后稀释至５００ｍＬ。 犇．１．３　０．４犿狅犾／犔、狆犎５．９磷酸盐缓冲液的配制 Ａ液８１ｍＬ加Ｂ液１９ｍＬ混之，用Ａ液或Ｂ液调节ｐＨ至５．９。置室温保存。 犇．２　胎球蛋白溶液配方 胎球蛋白　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ ０．４ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．９磷酸缓冲液　　　　　　　　２０ｍＬ 蒸馏水　　　　　　　　 ２０ｍＬ 溶解后贮存于－２０℃。 犇．３　过碘酸盐试剂配方 ４．２８ｇ过碘酸钠加入３８ｍＬ蒸馏水中，加热溶解后，冷却至室温，加入６２ｍＬ８５％正磷酸，充分混 合，存于带玻璃塞的棕色瓶中，避光保存。 犇．４　亚砷酸盐试剂配方 亚砷酸钠　　　　　　　　　　１０．０ｇ 无水硫酸钠　　　　　　　　　　７．１ｇ 蒸馏水　　　　　　　　　　 １００ｍＬ 加热溶解后，冷却至室温，然后加入０．３ｍＬ浓硫酸，置室温保存。 犇．５　硫代巴比妥酸试剂配方 无水硫酸钠　　　　　　３５．５ｇ ２２ 犛犖／犜１１８２—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 硫代巴比妥酸　　　　　　３．０ｇ 蒸馏水　　　　　　 ５００ｍＬ 在沸水浴中加热溶解，现用现配，置室温保存。 犇．６　酸