中药何首乌促进黑色素生成的作用机理研究

�实验研究� 中药何首乌促进黑色素生成的作用机理研究* 姜泽群,吴琼,徐继敏,何光源* � (华中科技大学生命学院,湖北 武汉 � 430074) 摘要:目的 � 研究中药何首乌在 B16 黑素瘤细胞中促进黑色素生成的作用机理。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 � 用 MTT 法、多巴氧化法及 NaOH 裂解法测定何首乌对细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。RT�PCR 和Western blotting 法分别检测何首 乌作用前后酪氨酸酶、小眼相关转录因子( M ITF ) , 酪氨酸酶相关蛋白 1( TRP�1)和酪氨酸酶相关蛋白 2( TRP�2)基因表 达和蛋白合成的变化。结果 � 随何首乌加药浓度的增大, 细胞增殖率、酪氨酸酶活性和黑素合成能力明显增强; 何首乌 可明显促进酪氨酸酶和 MITF 的基因表达和蛋白合成, 但对 TRP�1、TRP�2的表达几乎没有影响。结论 � 何首乌在体外 能显著刺激 B16 细胞中黑色素的生成,上述变化可能是通过促进酪氨酸酶和 MIT F 的基因表达和蛋白合成以及激活酪 氨酸酶的活性来实现的。 关键词:何首乌; 酪氨酸酶;小眼相关转录因子; 酪氨酸酶相关蛋白 1;酪氨酸酶相关蛋白 2 中图号: R285. 5 文献标志码: A 文章编号: 1000- 5005( 2010) 03- 0190- 03 � � 现代医学认为,白发是由于黑色素(黑素)的 生成受阻所致,受阻的原因包括: 黑素细胞、黑素 体较少,酪氨酸酶活性降低等。临床上中医治疗 白发有大量方剂, 这些是研究白发治疗的宝贵资 源,其中何首乌在乌发方剂中频繁出现,说明它有 很好的促进黑色素生成的效果。由于黑色素的合 成过程十分复杂, 因此阐明何首乌的乌发机理有 着重要的意义。 1 � 材料 DMEM 高糖培养基购自 Gibico 公司, 胎牛 血清购自杭州四季青公司, MT T, DM SO 购自 Sigma公司, T rizol购自 Invit rog en 公司, PCR试 剂盒和 RT�PCR试剂盒均购自宝生物大连公司, PCR引物购自北京奥科公司, 多克隆兔抗人酪氨 酸酶( TYR)抗体、酪氨酸酶相关蛋白酶 1( TRP� 1)抗体、酪氨酸酶相关蛋白酶 2( T RP�2)抗体、小 眼相关转录因子( M ITF)抗体、肌动蛋白( act in) 抗体,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自 美国 Santa Cruz公司,其他为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯试剂。 2 � 方法与结果 2. 1 � 药物的提取 实验用何首乌为制首乌, 由武汉中医协会陈 昌一医生提供并鉴定, 符合中华人民共和国药典 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。提取方法采用加热回流法, 70%乙醇提取 后得到何首乌浸膏,用 pH6. 8, 0. 05 mol/ L 磷酸 缓冲液稀释至 100 mg/ mL, 临用时再稀释至指定 浓度,其终浓度分别为 0. 1、0. 5、1. 0 mg / mL。 2. 2 � 细胞培养和药物刺激 B16黑素瘤细胞株购自武汉大学典型培养物 保藏中心。用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基 37 、5% CO 2条件下常规培养, 传代 24 h 后对细 胞进行加药刺激, 并根据实验要求加药处理适当 的时间。 2. 3 � 细胞增殖的测定 将传代细胞的浓度调至 1 ! 105个/ mL 加入 96孔培养板,每孔 0. 1 mL。孵育 24 h,待细胞贴 壁后,吸去旧培养液, 加入含不同浓度( 0. 1、0. 5、 1. 0 mg / mL) 何首乌提取物的新鲜培养液, 置 37 , 5% CO 2条件下继续培养 48 h,采用经典的 MT T 比色法[ 1] 测定细胞增殖率。每一浓度设立 3个复孔,取平均值,并设置培养基为空白对照。 细胞增殖率( % ) = 各浓度平均吸光度值对照组平均吸光度值! 100% 每一处理因素重复测定 3次。 2. 4 � 酪氨酸酶活性测定 用上述浓度的何首乌提取物作用细胞 2 d ∀190∀ 南京中医药大学学报 2010 年 5月第 26 卷第 3 期JOURNAL OF N ANJ ING TCM UNIVERSIT Y Vol . 26 No. 3May . 2010 * 收稿日期: 2009- 10- 15;修稿日期: 2009- 11- 15 基金项目:国家重大基础研究前期专项 973预研( 2005CCA1900) ;国家自然科学基金科学部主任基金( 30640043) 作者简介:姜泽群( 1982- ) ,女,山东海阳人,华中科技大学 2006级博士研究生。* 通信作者: hegy@ hust . edu. cn 后,测定酪氨酸酶活性 [ 2]。每一浓度设立 3个复 孔,取平均值,并设置培养基为空白对照。 酪氨酸酶的激活率( % ) = 各浓度平均吸光度值对照组平均吸光度值! 100% 2. 5 � 黑素含量测定 [ 2] 将配制的细胞悬液以 1 ! 105个/ mL 密度接 种于 6孔板,孵育 24 h后加入以上浓度的何首乌 提取物继续培养 48 h, 然后收获细胞, 离心后用 PBS洗涤 2次,加入1. 0 mol/ L N aOH ,置 80 水 浴中 30 min使细胞团块完全溶解,并用双蒸水将 NaOH 的终浓度稀释至 0. 2 mol/ L, 用分光光度 计在 400 nm 测定 A 400值。黑素含量用每个细胞 加药处理组 A 400值占对照组 A 400值的百分率来表 示,每一处理因素重复测定 3次。 2. 6 � 逆转录�聚合酶链式反应( RT�PCR)测定黑 素合成相关基因 mRNA 的表达 采用 T rizol 方法(参照试剂说明书)提取用 上述浓度的何首乌提取物处理 48 h 的 B16黑素 瘤细胞株的总 RNA。引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 参照文献[ 3]。将 提取的 RNA 反转录成 cDNA 用于 PCR 扩增, PCR反应条件为: 94 60 s, 56 60 s, 72 60 s ( 26个循环)。在含 EB的 1. 5%琼脂糖凝胶中电 泳,紫外灯下拍照然后用凝胶成像系统分析, 读取 cDNA 荧光强度值, 再与空白对照组相比即为其 mRNA 的相对表达量。 2. 7 � 蛋白质免疫印迹 传代细胞孵育 24 h贴壁后,加入上述 3 种浓 度的何首乌提取物继续培养 48 h, 刮法收集细 胞,提取总蛋白, 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。 电泳结束后湿法转膜 4 封闭过夜, 洗膜后加入 适当稀释比例的多克隆兔抗人酪氨酸酶 ( T YR) 抗体、酪氨酸酶相关蛋白酶 1( TRP�l)抗体、酪氨 酸酶相关蛋白酶 2( TRP�2)抗体、小眼相关转录 因子( MIT F)抗体和肌动蛋白抗体 4 孵育过夜, 常规洗膜 3次, 继而与 1#1 000的辣根过氧化物 酶标记的山羊抗兔二抗抗体室温孵育 2 h, 常规 洗膜,显影,定影,观察条带并进行扫描处理, 最后 用 Quant ity one�4. 3. 0软件( Bio�Rad 公司)读取 蛋白条带的灰度值。 2. 8 � 统计学分析 统计学处理采用 t 检验, 全部数据均采用 SPSS10. 0医用统计软件包进行单因素方差分析。 3 � 结果 3. 1 � 何首乌提取物对 B16 黑素瘤细胞增殖的影 响 用 MT T 比色法测定不同浓度何首乌提取物 作用 B16黑素瘤细胞 48 h后对细胞增殖的影响, 从插页∃图1可见, 在0. 1~ 1. 0 mg/ mL 范围内, 何首乌提取物能浓度依赖性地促进细胞的增殖, 最佳激活浓度为1. 0 mg/ mL。 3. 2 � 何首乌提取物对 B16 黑素瘤细胞酪氨酸酶 活性和黑色素生成的影响 插页 ∃图 2 显示的是何首乌提取物对 B16 黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑色素生成的影响。 当何首乌提取物的浓度在 0. 1~ 1. 0 mg / mL 范围 时,随浓度增加酪氨酸酶活性逐渐增强。以不加 药的 B16黑素瘤细胞酪氨酸酶活性为参照标准, 何首乌提取物在1. 0 mg/ mL 时可以上调酪氨酸 酶活性达 2. 19倍( P< 0. 01)。另外,如插页∃图 2白色柱状图所示,在 0. 1~ 1. 0 mg / mL 范围内, 何首乌提取物对 B16黑素瘤细胞的黑素生成量 也有持续提高的作用, 该作用呈一定的剂量依赖 关系。 3. 3 � 何首乌提取物对酪氨酸酶、M ITF、T RP�1、 TRP�2 mRNA 及蛋白表达的影响 酪氨 酸酶 ( T yrosinase )、MIT F、T RP�1、 TRP�2 mRNA 的 RT�PCR产物在琼脂糖凝胶中 的电泳结果见插页 %图 3。各组 mRNA 的结果 比较显示: 3 种浓度的何首乌提取物作用于 B16 黑素瘤细胞 48 h后, 酪氨酸酶 mRNA 的表达随 着加药浓度的增大而逐渐增加; 3 种浓度的何首 乌提取物对 M IT F mRNA 的表达也有剂量依赖 性的促进作用, 而 TRP�1 和 T RP�2 mRNA 的表 达量在何首乌加入前后几乎没有变化。另一方 面, W estern blot t ing 检测发现: 3种浓度的何首 乌提取物具有浓度依赖性促进酪氨酸酶( T yrosi� nase)蛋白表达的作用; 同时 M ITF 蛋白的表达量 也随着何首乌提取物浓度的增大而持续增加, 但 何首乌提取物对 TRP�1、TRP�2 蛋白的表达影响 不大(插页 %图 3)。 4 � 讨论 在民间验方中, 何首乌多用于治疗须发早白、 脱发、斑秃等。已有研究发现何首乌在体外对酪 氨酸酶的激活及促进黑色素生成方面均有较强的 作用[ 4 - 5] ,但其作用机理尚不清楚, 本文旨在从细 ∀191∀姜泽群,等: 中药何首乌促进黑色素生成的作用机理研究 � 第 3 期 胞和分子水平上详细阐明何首乌促进黑色素生成 的 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 ,为其临床应用提供直接的理论和实验依 据。 在哺乳动物中,黑色素的生成是一个十分复 杂的过程,主要由酪氨酸酶基因家族调控,其中酪 氨酸酶是黑素合成过程中最为关键的一种酶, 其 表达和活性决定着黑素生成的速度和产量[ 6- 7]。 另外,酪氨酸酶基因家族蛋白受到小眼相关转录 因子( MIT F)的调节, 它作为黑素细胞的特异性 转录因子,可以直接结合并激活酪氨酸酶启动子, 在转录水平上上调酪氨酸酶基因的表达,从而促 进黑色素的生成 [ 8- 10]。 实验采用 B16黑素瘤细胞作为模型,研究了 何首乌对黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素含 量, 以及对黑素合成相关基因 ( TYR/ M IT F/ TRP1/ TRP2)表达的影响。结果发现: 在试验浓 度范围内( 0. 5~ 1. 0 mg/ mL) , 何首乌提取物对 B16黑素瘤细胞能以浓度依赖方式促进细胞的增 殖、激活酪氨酸酶的活性和诱导黑素的生成, 并能 显著增加酪氨酸酶和 M ITF 的基因表达和蛋白 合成。国外学者 Lee 等 [ 11] 曾报道过一种过氧化 物酶体增殖物激活受体 �( PPAR�)激动剂环庚比 妥( Ciglitazone)可在体外培养的细胞水平呈剂量 依赖方式提高 B16 黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活 性和黑素的生成, 同时还发现细胞内酪氨酸酶和 MIT F 基因的表达也有显著的上调。这种药物促 进黑色素生成的作用机理和本文所报道的研究结 果是基本一致的。 研究还发现, 何首乌提取物对 T RP�1 或 TRP�2的 mRNA 和蛋白表达并没有显著影响, 这可能是因为: TRP�1和 TRP�2虽与酪氨酸酶同 属酪氨酸酶基因家族,其结构和性质相似,但催化 的反应不同。酪氨酸酶催化酪氨酸转化生成黑色 素过程的前两步, 即羟化酪氨酸成多巴和氧化后 者成为多巴醌; 而 TRP�1和 T RP�2 则催化黑素 生化合成过程中的后续步骤。由于酪氨酸酶催化 的前两步是决定黑素生成的限速步骤, 所以何首 乌提取物如能上调酪氨酸酶基因的表达,就可有 效促进黑色素的生成, 不一定需要同时上调 TRP�1和 T RP�2的表达,也说明 TRP�1和 TRP� 2在何首乌促进黑色素生成的过程中并非主导因 子。 综上所述,本文详细阐明了何首乌提取物在 B16黑素瘤细胞中促进黑色素生成的作用机理: 即分别在在转录和翻译水平上上调酪氨酸酶和 MIT F 的基因表达和蛋白合成, 激活酪氨酸酶的 活性,从而共同促进黑色素的生成,这为下一步进 行何首乌乌发有效成分的开发以及白发的治疗奠 定了理论基础。 参考文献: [ 1]马慧军, 朱文元, 王大光, 等. 中药单体胡椒碱促进表 皮黑素瘤细胞黑素合成的实验研究[ J] .临床皮肤科杂志, 2005, 34( 1) : 14- 17. 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