【doc】精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系

【doc】精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系 精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片与 宫腔内人工授精妊娠率的关系 JournalofMathematicalMedicineVo1.23No.52010 文章编号:1004—4337(2010)05—0526—03中图分类号:R737.33文献标识码:A?临床科研分析? 精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片与. 宫腔内人工授精妊娠率的关系? . 曹晓敏苏园园何茜冬郑轶群一林仲秋 (中山大学附属第二医院妇产科广州510120) 摘要:目的:探讨精液DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系.方法:收集分析7O例不育不孕患者共88个IUI治疗周 期,精子染色质扩散(SCD)实验分析精子DNA碎片,苯胺蓝染色法评价精子核成熟度,并按妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组,比较 各组问精子DNA碎片比值,精子核成熟度和IUI妊娠率的关系.结果:非妊娠组SCD小光晕和无光晕精子(精子DNA碎片)比值 平均为(28.3?10.6),非妊娠组明显高于对照组(12.0?5.9)(P<O.05);而大光晕和中光晕精子比值非妊娠组明显低于对 照组(P<O.05);非妊娠组组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组.结论:非妊娠组患者核成熟度异常的精子,精子DNA碎片比例增 高. 关键词:复发性流产;精子;DNA损伤 doi:10.3969/J.issn.1004-4337.2010.05.010 宫腔内人工授精(intrauterineinsemination,IUI)是将洗 涤处理过的精子悬液通过导管直接注入子宫腔内,使精卵自 然结合达到妊娠生育目的的一种辅助生育技术,其适用人群 广泛.影响IUI成功的因素诸多,目前尚无定论.大部分研 究主要集中在女方年龄,不孕的年限,授精时机及次数,用药 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ,局部盆腔结构,子宫内膜厚度,输卵管壶腹部的直径,输 卵管伞端距宫角的距离,精子质量与IUI妊娠率的关系口]. 关于精子质量与IUI妊娠率的研究通常是在常规精液分析水 平上进行.其提供的信息不能很好评估精子的质量.在预测 妊娠结局方面的价值十分有限.本课题拟通过对精子DNA 完整性,精子核成熟度的检测来分析精子质量与IUI妊娠率 的关系l4],本研究对2008年8月,2009年12月来我院生殖 中心行IUI治疗的7O例男方精液进行分析,精子染色质扩散 (SCD)实验分析精子DNA碎片,苯胺蓝染色法评价精子核成 熟度,探讨上述指标与IUI妊娠率的关系. 1资料与方法 1 i.1一般资料 2008年8月~2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗 患者7O例共88个周期,治疗前需证实女方至少有一条输卵 管通畅及无排卵功能障碍,并排除盆腔炎症和女性生殖内分 泌异常等潜在的不孕因素的影响.我们将88个IUI周期根 据妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组. 1.2主要试剂与仪器 ISAS精子分析系统(西班牙);NIKONE-1000荧光显微 镜(日本);NIKONE-200普通光学显微镜(日本).主要试剂: 低熔点琼脂,标准琼脂,二硫苏糖醇(DTT),联咪二苯吲哚 (DAPI),均购自美国Sigma公司. 1.3标本采集 受检者应禁欲3,7d,用手淫或体外排精法收集精子,标 明采集的时问,置37?平板上液化后进行检测. 1.4SCD实验 根据文献_5],精液标本处理:精液标本用磷酸盐缓冲液 (pH6.8)调至10×10/ml1000rpm10min,弃精浆,精子沉 渣用磷酸盐缓冲液(pH6.8)调至1×10.,l0×10/m1.取0. 3ml处理好的精液与0.7ml1低熔点琼脂凝胶混匀,37~C 孵育;吸取50ul上述精子混合液滴在经过0.65正常熔点 琼脂预处理过的载玻片上,盖上22mmX22mm盖玻片4?放 置5min.精子变性及裂解:小心去除盖玻片,室温(22~C左右) 将标本载玻片浸入0.08tool/1的盐酸(HCL)内变性7min;然 后浸入精子裂解液内(pH7.3)20min;再移人缓冲液中3min, 脱水.将标本载玻片依次放人7O%,90%和100的乙醇中 脱水.所有操作过程均要求载玻片(标本)处于水平状态.空 气自然干燥后加入4,6一二脒基吲哚(DAPI)染色,荧光显微镜 下观察结果. 1.5精子核蛋白组型检测 精液液化并记数,洗涤调整精子密度至40×10/ml,取精 液lml,1000g离心3min,去上清液,重复3次,去除精浆加入 lml粘合液,取5ul涂片,空气干燥,加固定液固定90s,冲洗玻 片,脱色,封片.镜检:涂片经苯胺蓝染色后,显微镜下高含赖 收稿日期:2010—05—31通讯作者:林仲秋 作者简介:曹晓敏,女,在站博士后,2008年南方医科大学博士毕业.研究方向:生殖 内分泌. ?基金项目:中国博士后基金,编号:20090460816 *中山市人民医院妇产科**中山市人民医院泌尿外科 ? 526? 数理医药学杂志2010年第23卷第5期 氨酸的精子核呈蓝色,颜色分布基本均匀,一般在精子核后半 部分着色较深,顶体部分蓝色较浅,大部分精子不色,显蓝 色的为阳性,不显色的为阴性,每个标本计数200个精子. 2统计学处理 数据输入计算机SPSS(12.0版)软件,经t检验进行统计 处理.P<0.05认为有统计学差异. 3结果 3.1DNA完整性检测结果 SCD实验普通光学显微镜图片见图1.计数500个精子, 观察精子光晕大小.根据光晕与精子头部横径的比例,粗分 ,小和无光晕4个等级,大和中光晕 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示精子DNA完 为大,中 整无碎片,小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片.小光晕以 精子头直径?1/4为判断标准;中光晕精子头直径>1/4,而精 子头直径?2/3;大光晕精子头直径>2/3.精子SCD实验显 示大,中,小光晕和无光晕精子的比例,见表1.非妊娠组患者 SCD小光晕和尤光晕精子比值平均为28.3?10.6,对照组 (12.0?5.9),两组比较差异有统计学意义(P<0.05). 大光晕和中光晕精子比值在IUI妊娠组和对照组分别为(72. 6?5.3)和(60.7?12.5),两组比较筹异有统计学意义 (P<O.05) A为妊娠组:1,2为大光晕的精子,A3,5为中光晕的精子 B为非妊娠组:1,2为小光晕的精子,B3,5为无光晕的精子 图1SCD实验检测两组精子DNA碎片结果 表1两组SCD大,中,小光晕和无光晕精子的比例(,z一35) 注:与对照组比较,#P<O.05. 3.2精子核蛋白组型检测 对两组7O例标本进行苯胺蓝染色,非妊娠组苯胺蓝染色 阳性率明显高于对照组,两组差异具有统计学意义(P<0. 05),见表2. 表2两组苯胺兰染色阳性率平均值比较 4讨论 目前关于女方因素对IUI妊娠率影响的研究比较深入并 形成一些共识.而精子质量与IUI妊娠率的研究通常是在常 规精液分析水平上进行.虽然常规精液分析为我们了解精液 质量提供了一些重要信息,然而这些信息不能完全评估男性 的生育能力,临床上约有15的男性不育患者精液常规检查 是正常的,所以常规的精液分析对评价精子的质量存在缺陷 和不完善之处,埘预测妊娠结局方而的价值十分有限.因此 我们需要寻找新的,敏感的评估精液质量的指标,深入分析 IUI失败的原因,以便帮助临床医生进行诊断和制定治疗方 案,足当前急需解决的问题.本课题通过对两实验组患者精 子DNA碎片和精子核成熟度的检测,发现非妊娠组患者精子 DNA碎片比例增高.精子DNA损伤常常是多个因素作用的 结果,但其确切机制现在还不清楚,一般认为有如下3种:? 凋亡;?异常氧化应激;?精子染色质组装缺陷.在精子形成 过程中,正常情况下,赖氨酸丰富型组蛋白被鱼精蛋白替代, 这是随后发生去凝缩作用形成精原细胞的必要条件.精子核 成熟度直接影响精子的受精能力和受精后原核的形成及胚胎 的发育一-.精核蛋白分子中一般不含赖氨酸,而组蛋白和过 渡蛋白中则有众多赖氨酸.本研究利用苯胺蓝可与富含赖氨 ? 527? Journa1ofMathematicalMedicineVo1.23No.52010 酸的蛋白结合,呈蓝色,检测精子精子核的成熟度.我们发现 非妊娠组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组,说明非妊娠组 可能是由于精子核成熟度异常,精子核蛋白转换障,导致 DNA不稳定及受损,妊娠失败.据此可以对就诊的不孕夫妇 进行合理的筛查,使那些质量不佳通过IUI受孕机会较小的 病例,直接求助疗效更为可靠的其他辅助生殖技术,就可以避 免不必要的IUI治疗对患者身体,精神和经济上的损害.再 次对精子质量好适应于IUI治疗的患者,我们建议至少应进 行3,4次IUI治疗周期,避免使用体外受精一胚胎移植 (IVF-ET)和单精子显微注射(ICSI)等技术难度更大,费用更 高,侵袭性强的其他辅助生殖技术.另外通过本研究对IVF 前的常规精液分析结果正常但反复IVF失败的患者继续治疗 提供方向和理论指导.但是关于精子核成熟异常与DNA受 损与妊娠失败发生的机制,响因素及其治疗,还需大量深入详 细的研究. 参考文献 1卢伟英,刘西茹,等.718周期夫精官腔人工授精l临床因素分析.海 3 4 7 南医学院,2006,12(4):310~313. 茅琳,洪燕,等.夫精宫腔内人工授精l临床妊娠率影响因素的分 析.中国泌尿外科学杂志,2008,22(8):20~24. EsmailLzadehS,FaramarziM.Endometrialthickenssandpregnan— cyoutcomeafterintrauterineinseminateon.FertilSteril.2007,88: 432,437. VirroMR,Larson-CookKI,eta1.Spermchromatinstructureassay parametersarerelatedtofertilization,blastocystdevelopment,and ongoingpregnancyinvitrofertilizationandintracytoplasmiesperm unjectioncycles.FertilSteril,2004,81(5):1289~1259. 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TheRelationshipofSpermDNAFragmentationbyChromatinDispersionTest withPregnancyOutcomeafterintrauterineinsemination CaoXiaomin.etal (DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofZhongshanUniversity, Guangzhou510120) AbstractObjective:T.oexploretherelationshipbetweenthelevelsofspermDNAfragmentationand pregnancyrateofintrauterineinsemination.Methods:70infertilecouplesunderwent88cyclesofIUI.The levelofDNAfragmentationwasdeterminedbyspermchromatindispersion(SCD)test,Thedegreeofsperm nucleusmaturitywasdeterminedbyanilinebluetest.Accordingtowhetherhavingapregnancyornot,the couplesweredividedinto2groups:pregnancyornonpregnancy.MeanwhiletheparametersandIUIoutcome werecomparedamong2groups.Results:Sisty— ninecaseswithnonpregnancyshowedasignificantlyhigher smallhalosandwithouthalos[DNAfragmentation,meanaverage(28.3-+-10.69)9/6]intheirspermatozoa comparedtocontrols[-(12.0? 5.9)](P<0.05).TheSCDpatternsrevealedahigherpercentage(72.6 4-5.3)oflargesizehalosandmedium2sizehalosforcontrolgroupspermthanthoseobtainedinthenon— pregnancygroup[(60.7? 12.5)](P<0.05).Conclusion:ThelevelofspermfragmentedDNAbySCD hasanincreaseinnonpregnancygroup. Keywords ? 528? intrauterineinsemination;sperm;spermDNAdamagepregnancyrate