尿液中囊泡的提取和鉴定

尿液中囊泡的提取和鉴定 尿液中exosome的提取和鉴定 一、 exosome的提取 (一) 实验准备 1. 试剂:Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水 耗材:超速离心管50mL，15mL 2. 配制Isolation solution 50 mL 1. 10 mM Triethanolamine(三乙醇胺)(MW 185.7) 0.093 g 2. 250 mM Sucrose(蔗糖)(MW 342.3) 4.28 g 3. 加去离子水 至 45 mL 4. 1 M NaOH 调pH至7.6 ~220 μL 5. 加去离子水 至 50mL 6. 加protease inhibitors day of isolation 3. 3. 5×SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL 1. SDS 3.75g 2. Glycerol 15 mL 3. 1 M Tris-HCl， pH 6.8 2.5 mL 4. Bromophenol溴酚蓝 dab 5. DTT 60 mg/mL 6. 去离子水至 50 mL (二) 实验步骤(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010) 1. 将,80?冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。 2.从-20?中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。 3.每50mL尿液中加入625 μL溶解后的蛋白酶抑制剂(12.5 μL/mL Urine)。 4.于4?，17000 × g 离心15 min。(新鲜尿液25?离心) (超速离心机型号Hitachi CP 80MX) 5.取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL， 4? 200 000 × g离心1 h。(同上新鲜尿液25?) 6.离心后弃上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。 7.弃上清，3管中各加50μL isolation solution，涡旋混匀30 s，转移到一个1.5 mL Eppendrof离心管中。 8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95?孵育2 min。 9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速离心10min。 10.弃上清，加50 μL isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 离心15 min。 取上清做1D SDS/PAGE. 11. Bradford 法测蛋白总浓度。 12.按1:4体积比加入5×SDS-Laemmli 缓冲液(含60 mg/mL DTT)，涡旋混匀。 13.60?加热10 min，-80?保存。(for western blot) 朱墨桃师姐提取exosome 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 (Zhu, Li et al. 2012) 1.2,000 g for 10 min at 4 ?C ，除去死细胞; 2.取上清，4 ?C 10,000 g 离心30 min，除去细胞碎片; 3.取上清，4 ?C 110,000 g离心70 min，弃上清; 4.PBS清洗并重新分散，-80 ?C保存。 5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。 二、 负染电镜分析 (一)实验准备 4% paraformaldehyde 多聚甲醛(in PBS，pH 7.4)，1 % Uranyl acetate乙酸双氧铀in dd-HO，2石蜡膜，200 目镍网 (二)实验步骤 1. 将20μL exosomes 小体悬样与4% 多聚甲醛(in PBS，pH 7.4)1:1混匀。 2. 取10μL混合物滴于石蜡膜上，将200目镍网置于液滴中悬浮10min。 3. 用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 4. 在20μL PBS液滴中悬浮5min，重复。 5. 在20μL 去离子水液滴中悬浮5min，重复。 6. 1% 乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 7. 将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥15min。 8. 样品准备完毕，进行EM分析。 三、 1D SDS-PAGE (一)实验准备 , 储存液配制: HCl (1)2 M Tris- (2)100 g/L SDS 溶液 (3)75%(v/v)甘油 (4)10 g/L 溴酚蓝溶液 , 电泳工作液配制: (1)Acr-Bis液 (2)4×分离胶缓冲液 (3)100 g/L 过硫酸铵溶液 (4)TEMED 成品液 (5)5×样品缓冲液 (6)10×电泳缓冲液 , 12% 电泳胶的配制 , 考马斯亮蓝染色液和脱色液 (二)实验步骤 1.制胶 装好灌胶器，在分别在两个洁净小烧杯(离心管也可)内配制分离胶和浓缩胶混 -PAGE溶液配制及具体 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 》。以枪头搅合液(注意灌胶时再加AP和TEMED)，配方见《SDS 拌约10-20 sec，灌胶分离胶。在胶面上小心地铺上几毫米厚的水层，然后常温凝固30 min(胶面与水层间界面清晰说明胶已凝好)。此时倒出水层，浓缩胶混合液加入AP和TEMED，枪头搅拌均匀，加入灌胶器，上覆水层，然后插入梳子，凝固2h。 2.上样跑胶 打开固定玻璃板的塑料夹，取出梳子，取下胶板装入电泳槽，在电泳槽中加入电泳缓冲液，上槽灌满，下槽电泳缓冲液的量根据电泳胶数目参照电泳槽上的刻度线确定。根据蛋白定量结果，每条泳道上样量在15 μg左右。2×样品缓冲液与样品1:1混合，上样体积一般为15-20μL，插入上样梳上样。电泳条件:step 1: 80V 5min,step 2: 150V 2h, 注意观察溴酚蓝的位置，一般半小时左右完成。 3.染色及脱色 关闭电源，取出电泳后的胶板，用刮胶板小心撬开玻璃板将胶取下(不可用蛮力，用二次水润湿比较容易取下来)，置于带盖的玻璃皿中，加入染色液(以刚没过凝胶即可)，于微波炉加热约40-70 sec至染色液微沸(注意盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸喷溅)，然后于脱色摇床上继续染色约10 min。染色液请倒入专用的回收容器内。淋洗凝胶冲去剩余染料，然后倒入适量的脱色液，微波加热至微沸后于摇床上脱色约10 min，重新换上脱色液室温摇床脱色至完全去除背景色。 .扫描及后处理 脱色后的凝胶置于扫描仪上扫描凝胶图像并保存，不立即酶解的凝胶在4 二次水中4?冰箱保存。(尽快处理，防止蛋白扩散和变质) 四、 1D SDS-PAGE蛋白质条带胶内酶解 (一)实验准备 脱色及脱水 1. 25 mM NHHCO 100 mg NHHCO，50 mL dd HO 43432 2. 25 mM NHHCO/50 % ACN 100 mg NHHCO，25 mL ACN，25 mL dd HO 434323. Stock Solution:1 %甲酸 990 μL dd HO，10 μL甲酸 2 4. 0.1 %甲酸 100 μL Stock solution，900 μL dd HO 2 还原和烷基化 5. 10 mM DTT 1.5 mg DTT/25 mM NHHCO 43 6. 55 mM 碘乙酰胺 10 mg碘乙酰胺/ 25 mM NHHCO 43 胰酶消化 7. Trypsin(Promega V5113) 12.5 ng trypsin/25 mM NHHCO 43 提取肽段 8. 50 % ACN/0.5 甲酸 500 μL stock solution，500 μL ACN 质谱准备 9. Millipore ZipTip C18 Pipette Tips ?? 10. Stock solution:1% 甲酸 11. Equilibration and washing:0.1 % 甲酸 12. Wetting and elution:50 % ACN/0.1 % 甲酸 100 μL stock solution，500 μL ACN, 400 μL dd HO 2 (二)实验步骤 31. 将胶条用手术刀片或保险刀片按顺序切下，每条带约1.5 mm大小，7 cm 胶条约切 12 ~ 15条; 22. 将胶条切成1-2 mm的小块，置于1.5 mL EP管中，记录条带号及相应的位置; 3. 用200 μL MilliQ超纯水振荡清洗5 min，重复一次; 4. 脱色 (1) 加入100 μL 25 mM NHHCO/50 % ACN，涡旋并孵育10 min,吸干上清; 43 (2) 重复(1)至蓝色褪去，胶粒萎缩变白; (3) 真空干燥胶粒至全干(~20min)。 5. 还原烷基化 (1) 向干胶粒中加入50 μL 10 mM DTT/25 mM NHHCO，涡旋。56?还原反43 应1 h，冷至室温; (2) 弃掉上清，立即加入50 μL 55 mM碘乙酰胺，涡旋后避光室温反应45 min; (3) 弃掉上清，加入100 μL 25 mM NHHCO 涡旋并孵育10 min清洗胶粒; 43 (4) 弃掉上清，100 μL 25 mM NHHCO/50 % ACN涡旋并孵育10 min以脱去43 胶粒中的水分，重复1 次; (5) 真空干燥胶粒至全干(~20min)。 6. 胶内酶解 (1) 加入3倍于胶粒的酶解液冰浴30 min(或放4?冰箱)，使胶粒复水; (2) 除去过量的Trypsin溶液后，用50 μL 25 mM NHHCO清洗胶粒几次，43 最后用50 μL 25 mM NHHCO覆盖胶粒; 43 (3) 涡旋，37?反应过夜。 7. 提取肽段 (1) 将酶解后上清液转移至1.5 mL离心管中; (2) 向胶粒中加入30 μL 50 % 乙腈/0.1 %甲酸，涡旋孵育30min，并超声5 min; (3) 吸取上清与第一次的上清合并; (4) 重复步骤(2)(3); (5) 涡旋后冷冻浓缩至5-10 μL(~30min)。加入0.1 %甲酸 15 μL，涡旋。 五、 质谱鉴定 1. ZipTip Protocol ,, (1) 将50 μL样品加入到96孔板，每个样品一个孔; (2) 将20 μL elution solution加入到干净的离心管中，每个样品一个; (3) Wetting ZipTip:吸10 μL wetting solution入针尖，打出，重复操作; (4) Equilibrate ZipTip:吸10 μL 平衡液 ，打出，重复操作; (5) Binding:来回吸、打样品10次; (6) Washing:吸washing solution，打掉;重复2次; 2. Elution:将离心管中20 μL elution solution吸打10次，不要引入空气; 3. 将样品浓缩至5 μL加入15 μL 0.1 % 甲酸，混匀后进样; 4. 根据质谱结果搜库。 六、 IEF/SDS-PAGE双向电泳 (一)第一向等电聚焦(7cm胶条，pH 3-10) 1. 从冰箱中取-20?冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT，不含Bio-Lyte)一小管(1mL/管)，置室温溶解。 2. 在小管中加入0.01g DTT， Bio-Lyte 4/6、5/7各2.5μL，充分混匀。 3. 从小管中取出200μL水化上样缓冲液，加入50μL样品，充分混匀。 4. 从冰箱取-20?冷冻保存的IPG预制胶条(7cm pH 3-10)，于室温放置10分钟。 5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品(7cm胶条一般加125-250μL，10-100μg)。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。 8. 在每根胶条上覆盖1.5 mL矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 , 7cm胶条 水化 12小时(18?) 主动水化(50V)或被动水化 , S0 50V rapid 12h 水化(若被动水化，此步省却) , S1 250V linear 30min 除盐 , S2 500V rapid 30min 除盐 , S3 4000V linear 3h 升压 , S4 4000V rapid 20,000Vhr 聚焦 , S5 500V rapid 99h 保持 10.聚焦结束的胶条应立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20?冰箱保存。 (二)第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12mL凝胶溶液，每块凝胶6mL，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶 与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水，用MilliQ水冲洗。 3. 从-20?冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 4. 配制胶条平衡缓冲液I。 5(在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入2.5mL胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 7. 配制胶条平衡缓冲液II。 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。 13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。 20.进行染色(按照伯乐染色试剂盒上的操作步骤) Bradford法测蛋白总浓度 检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测。该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等 ?Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100mL浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4?至少6个月保持稳定. ?标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常 在20μg -150μg/100μL之间绘制标准曲线. ?将待测样本溶于100μL缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS) ?按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去. ?每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色, 在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟. ?根据标准曲线计算待测样品的浓度. 1.Gonzales, P. A., H. Zhou, et al. (2010). "Isolation and Purification of Exosomes in Urine." 641: 89-99. Pisitkun, T. (2004). "Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine." Proceedings of the National Academy of Sciences 101(36): 13368-13373. Zhu, M., Y. Li, et al. (2012). "Exosomes as Extrapulmonary Signaling Conveyors for Nanoparticle-Induced Systemic Immune Activation." Small 8(3): 404-412.