川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元Bcl-XL 基因表达的影响.doc

川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元Bcl-XL 基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响.doc 川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元Bcl-XL 基因表达的影响 【摘要】 目的:通过免疫组织化学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 来探讨川芎嗪(TMP)对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Bcl-XL基因表达的影响。方法: 使用青霉素致痫大鼠模型, 采用BL-410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层痫样放电, 待癫痫样放电稳定后, 腹腔注射不同剂量的TMP, 待其抑制作用最明显时, 取大脑切片,采用免疫组织化学方法观察大脑神经元内Bcl-XL基因表达的变化，利用计算机图像分析技术测量不同时期血管瘤组织和正常皮肤组织Bcl-XL 基因表达的平均光密度和平均阳性面积。结果: A组(手术对照组)与B组(青霉素致痫组)、C 组(TMP10mg?kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P,0.01)，A 组(手术对照组)与D组(TMP20mg?kg-1治疗组)、E组(TMP40mg?kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P,0.05)，B 组(青霉素致痫组)与C组(TMP10mg?kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P,0.05)，D组(TMP20mg?kg-1治疗组)与E组(TMP40mg?kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P,0.05)。结论: TMP可抑制青霉素致痫大鼠大脑神经元的凋亡，从而对神经元起了重要的保护作用。 【关键词】 川芎嗪 癫痫放电 神经元 青霉素 Bcl-XL基因 细胞凋亡(apoptosis) 是正常器官发育和组织稳态过程中一种固有的细胞死亡形式,也可由多种因素包括糖皮质激素、高温、一定的化疗药物和电离辐射等诱导产生。细胞凋亡同细胞的增殖与分化一样, 离不开基因的表达与调控, 目前发现许多基因参与细胞凋亡的调控, 在哺乳动物细胞大致分为三类:一类为促进凋亡; 另一类为抑制凋亡; 还有一类为双向调控, 如c-myc、Bcl-x,Bcl-x 可翻译出两种蛋白Bcl-XL 和Bcl-XS, 前者抑制凋亡,后者促进凋亡。原癌基因和抑癌基因是参与细胞维持自稳平衡(homeostosis)的正负调控信号, 共同调节细胞增殖、分化和凋亡,1~3,。 川芎为伞形科蒿本属植物, 它具有活血化淤、疏风止痛、理气的作用,4,。川芎嗪(ligustrazine)是中药川芎的有效成分之一,属酰胺类生物碱,化学结构为四甲基吡嗪, 化学结构为四甲基吡嗪( tetramethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海马神经元的放电活动, TMP可明显抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及体重下降,5，6,,大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或保护作用。TMP已被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病的治疗。 本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Bcl-XL基因表达的平均光密度及阳性面积率的变化影响, 并进一步探讨其作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 SD大鼠(由武汉大学医学院实验动物中心提供) , 雌雄不拘, 体重200, 250g。 1.1.2 实验药品及试剂 盐酸川芎嗪注射液( 批号0107001 ) , 常州制药厂生产;注射用青霉素钠( 批号00109306) , 华北制药股份有限公司生产。 1.1.3 实验仪器 BL-410 生物机能实验系统, 成都泰盟电子有限公司生产;江湾I-C型立体定向器, 第二军医大学器材处生产。 1.2 方法 1.2.1 癫痫动物模型 实验选用健康SD 大鼠, 用10% 乌拉坦以10m l?kg-1体重腹腔注射( ip ) 麻醉, 将动物固定在江湾I-2C 型立体定向器上,于大脑左、右两侧前卤后3mm , 矢状缝旁开3mm 行开颅手术, 暴露大脑皮层记录区域(2mm ×2mm),将银球电极置于左、右两侧的记录部位,信号输入置BL-410 生物机能实验系统, 进行左、右两侧脑电记录。用浸有青霉素溶液的明胶海绵(200u/mm3)置于左侧大脑皮层表面, 诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电, 待癫痫放电稳定后, 移去明胶海绵, 用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。 1.2.2 试验分组及取材 将实验大鼠随机分为5组, 每组8只: ?A 组(手术对照组) , 麻醉开颅手术1h后取大脑; ?B组(青霉素致痫组),青霉素诱发癫痫1h后取大脑; ?C组(TMP10mg?kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射 (TMP10mg?kg-1),待抑制作用最明显时取大脑; ?D组(TMP20mg?kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后, 再腹腔注射(TMP20mg?kg-1),待抑制作用最明显时取大脑;?E组(TMP40mg?kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射(TMP40mg?kg-1),待抑制作用最明显时取大脑。 1.2.3 HE染色 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚约4μm)及HE染色。1.2.4 免疫组织化学S-P法检测Bcl-XL相关抗原 主要步骤: ? 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗; ? 3%过氧化氢，37?孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活 性，PBS洗4×5min; ? Bcl-XL采用微波抗原修复(3档，10 min)，PBS洗4×5min; ? 正常羊血清37?孵育10 min以减少非特异性反应; ? 一抗37?孵育1 h，PBS洗4×5min; ? 生物素标记的二抗，37?孵育10 min，PBS洗4×5min; ? 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37?孵育10 min，PBS洗4×5min; ? DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应; ? 苏木精复染，脱水，透明，封片。 用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为Bcl-XL的阳性对照组。 1.3 免疫组织化学结果判断 Bcl-XL相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Bcl-XL的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率,单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100,)。 1.4 统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。 2 结果 Bcl-XL基因的表达 A 组(手术对照组) : 大脑皮层神经元胞浆内可见一些棕黄色颗粒，Bcl-XL基因表达较强;B 组(青霉素致痫组) : 大脑皮层神经元胞浆内可见极少量的棕黄色颗粒，Bcl-XL基因表达弱;C 组(TMP10mg?kg-1治疗组) :大脑皮层神经元胞浆内可见少量的棕黄色颗粒沉积，Bcl-XL基因呈弱阳性表达;D组(TMP20mg?kg-1治疗组) :大脑皮层神经元胞浆内可见一些棕黄色颗粒，Bcl-XL基因表达较强; E组(TMP40mg?kg-1治疗组) :大脑皮层神经元胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Bcl-XL基因表达呈阳性。图像分析结果显示:A 组(手术对照组) Bcl-XL基因表达的平均光密度为0.2506?0.0159;B 组(青霉素致痫组) Bcl-XL基因表达的平均光密度为0.0753?0.0261;C 组(TM P 10mg?kg-1治疗组) Bcl-XL 基因表达的平均光密度为0.0945?0.0248;D组(TMP20mg?kg-1治疗组) Bcl- XL基因表达的平均光密度为0.1938?0.0194;E组(TMP40mg?kg-1治疗组) Bcl-XL 基因表达的平均光密度为0.2631?0.0210。A 组(手术对照组) Bcl-XL基因表达的阳性面积率为0.2437?0.0213;B 组(青霉素致痫组) Bcl-XL 基因表达的阳性面积率为0.0873?0.0286;C 组(TMP10mg?kg-1治疗组) Bcl-XL 基因表达的阳性面积率为0.0896?0.0259;D组(TMP20mg?kg-1治疗组) Bcl-XL基因表达的阳性面积率为0.2042?0.0264;E组(TMP40mg?kg-1治疗组) Bcl-XL基因表达的阳性面积率为0.2687?0.0186。经单因素方差分析，组间有显著性差异(P,0.01)。经q检验，A组(手术对照组)与B组(青霉素致痫组)、C 组(TMP10mg?kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P,0.01)，A 组(手术对照组)与D组(TMP20mg?kg-1治疗组)、E组(TMP40mg?kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P,0.05)，B 组(青霉素致痫组)与C组(TMP10mg?kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P,0.05)，D组(TMP20mg?kg-1治疗组)与E组(TM P40mg?kg-1治疗组)之间Bcl-XL基因平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P,0.05)。见表1。表1 各组Bcl-XL基因表达的平均光密度和阳性面积率(略)注:* A组与B组、C 组比较，(P,0.01);** A组与D组、E组比较，(P,0.05);? B组与C组比较 ，(P,0.05); 3 讨论 青霉素致大鼠癫痫模型是一种极为有效的、操作简便的实验动物癫痫模型, 其癫痫放电持久稳定, 可以用作抗癫痫药物疗效及癫痫发病机制的研究,7,。青霉素诱发的癫痫电活动是阻断了GABAa受体导致抑制神经网络功能失调而产生癫痫状态的,8,。细胞凋亡(apoptosis)是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程，它是细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，引起内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的自然死亡。细胞凋亡的过程不导致溶酶体及胞膜的破裂，没有细胞内涵物外泄，所以不引起炎症反应。 细胞凋亡受许多基因调节, 其中包括多种癌基因和抑癌基因如c-myc、bcl-2 、p53 、fas 等。 其中bcl-2 是与细胞凋亡关系最为密切, 被研究得最深入者之一 。 Bcl-2 的表达产物位于线粒体内膜、核膜及内质网膜, 在人体多种肿瘤中高表达, 可抑制多种因素诱导的细胞凋亡,9,。 进一步研究发现:bcl-2 是一个多基因家族, 包括多个成员. Bcl-x 是近年发现的bcl-2 家族成员之一。1993 年Boise,10,以鼠bcl-2cDNA为探针, 在鸡淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个克隆, 命名为bcl-x. 经DNA 印迹等一系列实验证实其为一与bcl-2 显著不同的新基因， 随后用 鸡bcl-xcDNA作探针, 筛选到人bcl-x cDNA。 由于不同的剪接产生两种大小不同的mRNAs: bcl-xL(long form) 和bcl-xs (short form)。bcl-xL 类似于bcl-2 , 能抑制细胞凋亡, 奇怪的是, bcl-xs 却能促进细胞凋亡。 本实验结果显示, 青霉素致痫后大脑皮层神经元胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Bcl-XL基因表达较弱。而D组腹腔注射不同剂量的TMP后,大脑皮层神经元胞浆内可见较多的棕黄色颗粒，Bcl-XL 基因表达较强。特别是腹腔注射TMP40mg?kg-1, 大脑皮层神经元胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒，Bcl-XL基因表达非常强。实验结果表明，Bcl-XL很可能根据不同的诱因以不同的方式参与调节细胞的生存或死亡, TMP抑制大鼠癫痫样放电的机制可通过抑制大脑皮层神经元的凋亡而使大脑皮层神经元结构和功能恢复正常，对神经元起着重要的保护作用。TMP在体内吸收后,能有效地透过血脑屏障,并广泛分布于大脑皮层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位。TMP在体内有广泛的抑制效应, 具有抑制缺血、抗再灌注所致心律失常的作用, 并有抑制心肌耗氧量的作用。TMP在大脑皮层缺血所致海马神经元凋亡的过程中起着重要的保护作用。 【