河蚌作为水体人类肠道病毒污染指示物的研究

河蚌作为水体人类肠道病毒污染指示物的研究 华中科技大学 硕士学位论文 河蚌作为水体人类肠道病毒污染指示物的研究 姓名:梅婧 申请 关于撤销行政处分的申请关于工程延期监理费的申请报告关于减免管理费的申请关于减租申请书的范文关于解除警告处分的申请 学位级别:硕士 专业:流行病与卫生统计学 指导教师:曹玉广 2011-01 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 河蚌作为水体人类肠道病毒污染 指示物的研究 研究生:梅 婧 导 师:曹玉广 教授 摘要 目的 利用荧光实时定量 PCR 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 水环境中贝类组织中的人类肠道病毒含 量,初 步探索该病毒量与水体中病毒含量的关系。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 利用 PEG(聚乙二醇)沉淀法沉降贝类组织中的人类肠道病毒,沉淀物 接 种至 Vero 细胞中观察是否出现 CPE 反应。沉淀病毒之前的洗脱法分为甘 氨酸洗脱法 (传统的)和甘氨酸-苏氨酸洗脱法(新提出的),空斑法检测两种洗脱-沉淀方法的回 收率。同期所采的水样(滤膜法)经牛肉膏洗脱再经 PEG 沉淀。贝类样品及水样均 用 TRIzol法和试剂盒法提取肠道病毒 RNA,根据 OD260/280 值以及吸光度全面扫描 的测定结果分析两种提取方法所提 RNA 的质量差别。PCR 反应中使用人类肠道病毒 通用引物,提取 RNA 后进行普通 RT-PCR 反应。在对贝类样品及水样进行绝对定量 之前,需制备用来制作 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的荧光定量质粒标准品。本实验中质粒菌为实验室利 用 T-A 克隆法自行制备(含有肠道病毒 PCR 产物目的片段)。通过菌液 PCR 和质粒 PCR 反应对质粒菌进行筛选并提取出纯度符合要求的质粒,检测 DNA 浓度换算出拷 贝数进行荧光定量 PCR 反应。根据熔解曲线判断四组引物浓度(a 组:300 nM /300 nM ,b组:200 nM /200 nM,c组:100 nM /100 nM,d组:50 nM /50 nM)的引物 二聚体的形成情况,选择合适的引物浓度。对标准品进行 10 倍系列稀释, 通过观察 扩增曲线等选择合适的质粒标准品的稀释度范围制备标准曲线。进行荧光定量 PCR 反应,检测贝类组织样品及水样中的肠道病毒含量。 结果 贝类组织的沉淀物接种至 Vero细胞, 出现明显的 CPE反应。两种洗脱方法, 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 甘氨酸洗脱法(全贝)的回收率为 19.6%,甘氨酸-苏氨酸洗脱法(贝类肠道)的回收 率为 13.1%,选择甘氨酸洗脱法进行后续实验。TRIzol 法和试剂盒法提取 RNA 的 OD 值 260/280 比较结果差异有统计学意义(t 值8.53,P值0.05) ,全面扫描显示 TRIzol 法中残留的小分子盐类物质(OD230 nm)较多,而试剂盒法的波峰集中于核酸吸收 峰处(OD260 nm),试剂盒法提取 RNA 纯度较好。贝类组织及水样经过普通 PCR 反应,凝胶电泳均显示明显的目的条带片段,用 PEG 法提取肠道病毒较成功。菌液 PCR 和质粒 PCR 反应均显示明显的目的条带,OD 值 260/280 均大于 1.8,提取的质 3 7 粒 DNA较纯。优化后的引物浓度为 100 nM /100 nM,选择稀释度范围为 10 ~10 的质 粒标准品制作标准曲线进行实时定量 PCR 反应,贝类样品中检测出的肠道病毒拷贝 3 2 量昀高为 1.12×10 同期所采的水样中检测出的病毒拷贝量为 2.35×10 ,换算为原始水 4 样体积(原始体积 136L)则贝类样品相当于浓缩了水环境中肠道病毒达 3.1×10 倍。 结论 利用 PEG沉淀法沉降贝类组织中的人类肠道病毒效果较好,回收率符合检 测要求。质粒标准品纯度高稳定性较好,适用于实时定量 PCR 反应,绝对定量结果 显示贝类可以浓缩水环境中的肠道病毒,能够反应水体病毒情况。 关键词 河蚌;肠道病毒;聚乙二醇;荧光实时定量 PCR2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 The research about using mussel as the indicator of water pollution by human enterovirus Master candidate: Mei JingSupervisor:Prof. Cao Yuguang ABSTRACT Objective: Detect the human enterovirus in shellfish with real-time quantitative polymerase chain reaction, explore the relationship of viral load between mussel and the waterMethod: Concentrate the enterovirus in shellfish with PEG precipitation, inoculate sediment to Vero cells, observe if there is CPE. There are two methods to elution the virus,traditional and new, which are glycine elution and glycine-threonine elution, we detect the recovery of them with plaque assay. The water samples collected in the same period filter method through the beef extract elution, and then PEG precipitationShellfish and water samples are used TRIzol extraction method and RNA extraction kit for enterovirus RNA, according to OD260/280 value and the absorbance scan results, analyze the quality of RNA about both of the extraction methods. We design the human enterovirus universal primers in the PCR. We use T-A cloning to make the Specific plasmidcontain the fragment of enterovirus PCR products for the standard curve in real-time quantitative PCRScreening and extract pure plasmid with the Bacterium PCR and plasmid PCR, detect DNA concentration for calculate the number of the copies. Observe melting curve , According to the formation of primer-dimers, choose the appropriate concentration of primers a group: 300 nM / 300 nM, b group: 200 nM / 200 nM, c group: 100 nM / 100 nM, d group: 50 nM / 50 nM. After the 10-fold serial dilution, observe the amplification curve of the plasmid3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 to select the appropriate dilution range. Once there are all ready, begin the real-time quantitative PCR for detect the enterovirus in shellfish and water samplesResults: The vero cells inoculated sediment, observed CPE response. Comparison of two methods for the elution, The recovery of glycine elution full shell is 19.6%, and the result of glycine-threonine elution shellfish gut is 13.1%, consistent with the reported recovery. Choose Glycine elution for subsequent selection experiment. The difference of OD260/280 value between TRIzol extraction method and RNA extraction kit is significantly t 8.53, P0.05, full scan showed a small Miscellaneousl absorption peak in TRIzol method, which might be molecular salts OD 230nm, while the RNA extraction kit have an only nucleic acid absorption peak OD 260nm, the RNA purity of the kit is better. Shellfish and water samples by ordinary PCR reaction, whose gel electrophoresis show clear target band fragment, indicate the PEG precipitation of enteroviruses is successful. The Bacterium PCR and plasmid PCR are both show obvious target band, and OD 260/280 value is greater than 1.8, the plasmid DNA extracted is pure. Optimized primer 3 7 concentration of 100 nM / 100 nM, select the dilution range of the plasmid about 10 to 10 for standard curve in real-time quantitative PCR. The result of real-time quantitative PCR 3 shows that, the amount of enterovirus copies about shellfish samples is 1.12 × 10 , while 2 the water samples collected over the same period is 2.35 × 10we convert it into the original water sample volume original volume of 136L, then we find shellfish 4 concentrated enterovirus in water environment up to 3.1 × 10 timesConclusion: The PEG precipitation of enteroviruses in shellfish is successful, virus recovery compared with the report is better. High purity plasmid is stable, which is suitable for real-time quantitative PCR. shellfish can concentrate enteroviruses in water environment, through the real-time quantitative PCR about shellfish, we can preliminarily estimate enteroviruses in water Keywords: mussel; enterovirus; PEG; real-time quantitative PCR4 独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何 其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用 授权书 网站备案授权书下载肖像授权书文档下载肖像授权书下载歌曲授权书模板下载销售授权书免费下载 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅 和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前言 水是人类赖以生存的重要环境介质,人类健康往往与水有着密切关系。已发现的 介水传播病毒已经超过 700多种,其中肠道病毒是危害人类健康的常见病原体,可引 起腹泻、病毒性心肌炎、肝炎等多种病症。近年来因肠道病毒 71 型、埃可病毒 29 型 [1,2] 等引起的病毒性脑炎、手足口病等儿童疾病发病增加,甚至出现死亡病例 。随着检 测该病毒的分子生物学方法的进展,作为水体中的重要病毒之一,曾被提出作为水体 受病毒污染的指示病毒。目前美国在饮用水水质标准中明确了在水处理中对肠道病毒 的灭活标准。2006年,我国昀新颁布的《生活饮用水卫生标准》中,各项目的确定参 考了多个国家的饮用水标准,标准限值的划分则主要来自世界卫生组织发布的《饮水 水质准则》。在新标准中,微生物指标更加全面,由原来的 2 项增至 6 项,增加的项目 有大肠埃希菌0 /100 mL 、耐热大肠菌群 0 /100 mL 、贾第鞭毛虫和隐孢子虫 1 [3] /10 L ;总大肠菌群由原来的 3个/100mL修订为不得检出 。虽然我国的饮用水标准 已经逐渐靠近发达国家水平,对水体质量的要求也更加严格,但由于缺乏灵敏适用的水 体病毒检测技术,该标准中并未对水体病毒做出规定。但随着饮用水标准的不断完善, 适合的水体指示病毒将成为其中的补充指标。 [4] 肠道病毒(enterovirus)是一组无包膜单链RNA 微小核糖核酸病毒 。肠道病毒体 呈20面体立体对称,外壳32~42个壳微粒组成,直径17~28nm,内核直径为6~20nm, [5] 含20~30%单链RNA 。人类肠道病毒包括:1.脊髓灰质炎病毒:1、2、3三型;2.柯 萨奇病毒:A、B两组,A组含有1~22,24型;B组含有1~6型;3.埃可病毒:1~9, 11~27,29~33型。4. 新肠道病毒: 68,69,70,71,72型(该型即为甲型肝炎病 毒)。 水体的肠道病毒检测方法较多,传统方法主要为细胞培养法,发展到现代则逐步 发展为各种分子生物学方法,主要为荧光定量 PCR。 荧光实时定量 PCR 是在 1996 年由美国应用生物系统公司 (AppliedBiosystems) 发明并迅速推广。随着该方法的应用领域不断扩展,其优势也明确显现。荧光实时定 量 PCR是建立于普通 PCR反应之上的,所以它既保持了普通 PCR的灵敏度高、节省 5 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 时间的特点,同时又解决了该技术中普遍存在的假阳性易污染以及无法进行准确定量 的问题,另外也免去了普通 PCR 反应后必须进行电泳来观察结果的这一步骤,避免 了电泳时的染色剂 EB 或者用于标记的放射性同位素对环境的污染以及对研究人员健 康的影响。另外实时定量 PCR 技术还有重复性好、操作方便易程序化、同时检测样 本量多等优点。它与普通 PCR 的基本原理是相同的。 PCR即聚合酶链反应polymerase chain reaction 是体外模拟生物的 DNA 复制过 程。实验时需要的原料有:DNA 模板,高效率的 DNA 聚合酶,能够特异地结合在 靶序列两端的引物,作为复制反应原料的脱氧核苷酸 dNTPs 包括有 dATP, dCTP, dGTP,dTTP,以及合适的缓冲体系。PCR的主要过程分为三个阶段:变性、退火、延 伸。1 模板的变性,当模板 DNA 的温度加热到 94?时,DNA双链之间的氢键受热断 裂,双股螺旋逐渐解链变成两条单链。2 退火反应,当 DNA 解链为单链后,若温度 降至一定程度时,由于在体系中引物浓度相对较高,引物更易于结合至模板 DNA 单 链上。3 引物的延伸,DNA 聚合酶可以催化 DNA 的合成,结合于 DNA 模板上的引 物在 DNA 聚合酶的催化下,利用体系中加入的 dNTP 为原料,遵循碱基互补配对和 半保留复制的原则,合成一条与模板 DNA链互补的链。随着变性-退火-延伸过程不断 地重复循环,每一循环所产生的半保留复制链都可以作为下次循环的模板链。 实时荧光定量 PCR 反应是在普通 PCR 反应的基础上加入荧光化学物质,实时检 测每一个循环中的 DNA 产物所发出的荧光信号,通过对荧光信号的分析对起始模板 进行定量的计算。进行定量的理论基础是:在 PCR 扩增反应进程中模板是以指数方 式进行扩增,扩增至一定周期后扩增产物的总数量可表示为:YnX?(1+E)n,X为 [6] 起始模板的数量,n为周期数,E表示扩增效率(0 ?E ?1) 。在荧光扩增曲线的四个 阶段(荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段,线性增长期和平台期)中,指数 扩增阶段的 PCR 产物量的对数值与起始模板量具有线性关系,并且可以依据此线性 [7] 关系对 PCR产物进行实时定量 。 本研究中所采用的荧光染料物质为 SYBR Green I,对所有 DNA 双螺旋小沟区域 均有结合性,是具有绿色激发波长的一种染料。这种结合性的特点在于 SYBR Green I 只有和双链 DNA结合才能发出荧光,当 DNA变性双链分开时则没有荧光。荧光定量 6 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PCR 反应定量检测一般在每个循环的延伸阶段结束时采集荧光信号,实时监测 PCR [8] 扩增产物的量 。 由于 SYBR Green I 能和任何双链 DNA结合,其对检测 PCR产物的特异性没有 使用荧光探针的效果好,容易与非特异的双链 DNA 如引物二聚体结合,影响定量的 [9] 准确性。但可以根据熔解曲线来判断 PCR产物的特异性 。熔解曲线分析通常在 PCR 反应结束后逐渐升高 PCR 反应系统的温度,DNA 双链因温度上升而渐渐打开,嵌入 DNA双链中的 SYBR Green I 数量也随之减少,荧光信号的强度降低。双链 DNA解 链一半时的温度即 Tm值 熔解温度。 Tm值与 PCR扩增产物自身的核苷酸序列有关, 每一种 PCR扩增产物具有特定的 Tm值。通常利用负一次微分曲线进行熔解曲线分析, 理想的熔解曲线中只有明显的单一峰型,如果出现两个以上的峰型,则说明有引物二 聚体或其他物质的非特异性扩增,根据非特异性扩增的具体情况来优化实验条件消除 非特异性影响,或者直接重新设计引物。 图 1 实时荧光定量 PCR扩增图 Rn:荧光报告集团的荧光发射强度与染料的荧光发射强度的比值 ?Rn: 一个反应管经 n 次热循环结束后测得的荧光强度(即 Rn 扣除基线值后 的结果) 域值:荧光(Rn)超过本底达到可检测水平时的临界数值 Ct:临界循环数,域值线与扩增曲线相交,交点处所对应的循环数 基线:背景值曲线7 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 荧光实时定量 PCR 反应的定量方式分为绝对定量和相对定量。绝对定量测定未 知样品的绝对量拷贝数;相对定量则是同时测定目的基因和参比基因的量,求出参 比基因与目的基因的相对量后进行这两种样品间的比较,不能检测出样本的拷贝数。 绝对定量通常需要制备含有待测样品核苷酸序列的标准品,利用该标准品制作成 [10] 标准曲线,即可对待测样品进行绝对量拷贝数的测定 。因此绝对定量结果的准确 与否与标准品的制备关系密切。常用来制备的标准品有质粒 DNA和体外转入的 RNA, 根据其在 260nm 波长的吸光度值来计算标准品的拷贝数。进行荧光定量 PCR 反应制 作标准曲线时一般对标准品做 5~6个梯度的稀释,反应后得到各个稀释度的 Ct 值, 根据 PCR 产物量的对数值与起始模板量之间的线性关系即可得出标准曲线。再根据 标准曲线以待测样本的 Ct 值来换算该样品的拷贝数。绝对定量常应用于病毒病原菌 [11] [12] [13] 定量检测 、转基因拷贝数分析 、GMO定量分析 等。 水体检测的难点之一在于其水体浓缩富集病毒的技术,各方面的研究较多,主要 有 1、吸附-洗脱法:利用吸附剂吸附病毒再利用洗脱剂洗脱病毒 2、滤膜过滤法:通 常利用特殊滤膜的筛分作用或吸附作用来截留病毒 3化学沉淀法:利用化学物质絮凝 作用沉淀病毒。但各项技术都存在病毒浓度低、水样体积大,操作复杂。且水体环境 中所含物质复杂,极易影响检测结果。水体中病毒的检测方法越来越多,从另一角度 可以从生物利用方面进行新的探索。 [14] 1894 年美国即记载食用贝类可引起传染病流行 ,随着医学检测技术的进 步, 人们发现贝类在病原体尤其是病毒传播疾病方面起了很大的作用。例如 1982 年末发 生的上海地区因食用毛蚶而引起的甲肝爆发事件。另一方面,人们也认识到贝类具有 富集病原体的特性,由于这个特性也导致大量的贝类食物中毒事件。贝类尤其是双壳 [15] 贝类,多为滤食性动物,大量滤过水的同时也富集了水环境中的病原微生物 。很多 贝类能够迅速的在 12~24小时内即开始浓集大量病毒,只要周围水中有足够病毒,贝 [16] 类中所含的病毒水平就能维持 。由于人类肠道病毒不能在贝类体内繁殖,故从贝类 检测到的肠道病毒即为水体环境的肠道病毒。国外对于肠道病毒的报告中除了污水、 [17] 地表水等水体外也包含天然生长的双壳贝类的检出肠道病毒报道 ,Mcleod 等人则 [18] 更进一步研究肠道病毒在贝类体内的富集方式及富集部位 。目前检测贝类 体内病毒 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 是为调查贝类作为食物受污染的程度,或证实是否为相关传染病的传染源。鲜有直接 作为肠道病毒水体污染程度检测指标的报道。本研究拟通过比较贝类样品与水样的病毒提取方法以及两样品实时定量 PCR 检 测肠道病毒的情况,探索贝类肠道病毒含量与水样中肠道病毒含量的关系,探讨通过 检测贝类中的肠道病毒反映水体肠道病毒的情况。9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 材料1.1 病毒、大肠杆菌及细胞 脊髓灰质炎病毒?型(Sabin 株)、大肠杆菌 f2 噬菌体、大肠杆菌 285:均由本 院环境医学研究所提供。 非洲绿猴肾细胞(Vero细胞):受赠于武汉市疾病预防控制中心。 1.2 河蚌 背角无齿蚌,学名 Anodonta woodiana,又称河蚌(Mussel) ,无脊椎动物,软体 动物门,瓣鳃纲,蚌目。多栖息于水流缓慢和静水的水域,分布于江河、湖泊、水库 和池塘内。本实验中的河蚌样品采自天门鱼塘,采样时间为 2010年 10月 3日。贝类 样品 30份,去壳后组织重量为 20~150g,置于冰箱-80?保存 1.3 试剂及设备 1.3.1试剂: 胰蛋白酶:美国 Amresco,武汉天源生物技术有限公司 胎牛血清:杭州四季青生物制品有限公司 MEM 培养基:美国InvitrogenDMSO(二甲基亚砜):美国 Applichem,武汉飞 羿科技有限公司 Trizol 裂解液: 美国 Invitrogen,武汉亦新生物技术有限公司 DEPC焦碳酸二已脂:美国 Amresco 病毒 RNA 提取试剂盒:瑞士 Roche,武汉古泰生物技术有限公司 质粒快速提取试剂盒:美国 Axygen,武汉古泰生物技术有限公司 逆转录试剂盒:美国 Fenmentas 普通 PCR 试剂盒(包括 Taq 酶、dNTP等):TaKaRa 大连宝生物 实时定量 PCR试剂盒:美国 Applied Biosystem公司 SYBR Green PCR MasterMix,上海欧比特仪器有限公司 牛肉膏、蛋白胨:北京奥博星生物技术有限公司 胰蛋白胨、酵母抽提物:英国 OXOID10 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Trisbase、硼酸、氨苄青霉素:武汉亦新生物技术有限公司 聚乙二醇polyethylene glycol,PEG:武汉古泰生物技术有限公司 NaCl、KCl、Na HPO ?12H O、KH PO 、NaHCO 、EDTA、异丙醇、无水乙醇、 2 4 2 2 4 3 氯仿均为国产分析纯试剂 1.3.2主要仪器 常温高速离心机湖南飞鸽;低温高速离心机(德国 Biofuge);微型离心机(日 本 TOMY);多用途旋窝混匀器(美国 Scientific Industries) ;电子分析天平北京赛多 利斯天平有限公司;PCR 仪(美国 MJ Research);实时荧光定量 PCR仪(美国ABIPRISM 7900HT 型);电泳仪(北京 六一仪器厂);凝胶成像系统(中国 基因有限 公司);双功能水浴恒温振荡器(金坛市岸头国瑞实验仪器厂);数显恒温三用水箱金 坛市岸头国瑞实验仪器厂;恒温摇床;高压蒸气灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司); 倒置显微镜日本 OLYMPUS;超净工作台苏州净化设备有限公司;-80?冰箱美国 New Brunswick scientific; 二氧化碳培养箱;野外病毒采集器(苏州微纳过滤设备有 限公司)。 1.4 实验所需溶液 1.4.1 病毒洗脱富集液 甘氨酸缓冲液 配制浓度:甘氨酸 0.10mol/L,NaCl 0.30mol/L 称取甘氨酸 7.51g,NaC117.55g,加入 1L 蒸馏水至烧杯中充分搅拌,溶解后 用 15%NaOH 及 5%HCl 溶液调 pH9.5 甘氨酸缓冲液 配制浓度:甘氨酸 0.05 mol/L,NaCl 0.15mol/L 称取甘氨酸 1.88g,NaC1 4.38g,加入 500mL 蒸馏水至烧杯中充分搅拌,溶解后 用 15%NaOH及 5%HCl 溶液调 pH7.5 苏氨酸缓冲液 配制浓度:苏氨酸 0.50 mol/L,NaCl 0.15mol/L 称取苏氨酸 29.78g,NaC1 4.09g,加入 500mL 蒸馏水,充分溶解后用 15%NaOH 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 溶液及 5%HCl 调 pH7.5 16%PEG(聚乙二醇) 配制浓度:16%PEG,NaCl 0.525mol/L 称取 PEG 190.48g,NaC1 30.66g,加入 500mL蒸馏水,搅拌至充分溶解 3%牛肉膏 称取牛肉膏浸粉 30g,加入蒸馏水 1000ml至烧杯中充分搅拌,溶解后用 15%NaOH 及 5%HCl 溶液调 pH9.5,121?高压蒸汽灭菌 20min后置于 4? 保存 蛋白胨盐溶液 称取蛋白胨1.0g ,NaCl 8.5g,加入蒸馏水1000ml,搅拌至充分溶解,121?高 压 蒸汽灭菌20min后置于4?保存 磷酸盐缓冲液(PBS) 称取 NaCl 8.00g,KCl 0.20g,Na HPO ?12H O 3.58g,KH PO 0.24g,加入三蒸 2 4 2 2 4 水 1L至烧杯中充分搅拌,溶解后用 15%NaOH溶液及 5%HCl 调 pH9.0 1.4.2 Vero 细胞相关培养液 磷酸盐缓冲液(PBS) 称取 NaCl 8.00g,KCl 0.20g,Na HPO ?12H O 3.58g,KH PO 0.24g,加入三蒸 2 4 2 2 4 水 1L 至烧杯中充分搅拌,溶解后用 7.5%NaHCO 溶液调 pH7.2~7.4,121? 高压蒸 3 汽灭菌 20min后,置于冰箱 4?保存备用。 细胞消化液 配制浓度:胰蛋白酶 0.25%,EDTA0.02% 称取胰蛋白酶 0.25 g,EDTA 0.02 g,加入磷酸盐缓冲液 100 ml 于烧杯中均 匀搅 拌充分溶解后,经 0.22μm滤膜过滤除菌,置于 4?冰箱保存备用。 胎牛血清 灭活:56?水浴 30min,灭活后分装 50ml/瓶,4?冰箱保存备用。 细胞生长液 配制浓度:10%胎牛血清的 MEM 培养基 加入灭活胎牛血清 10 ml,MEM 培养基 90ml,轻柔混匀后,4?冰箱备用。12 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 细胞冻存液 配制浓度:DMSO5%,胎牛血清 20%,MEM75% 加入 DMSO 5 ml,灭活胎牛血清 20 ml 以及 MEM 培养基 75 ml,动作轻柔,充 分混匀,保存于 4?冰箱备用。 细胞维持液 配制浓度:2%胎牛血清的 MEM 培养基 加入灭活胎牛血清 2 ml,MEM 培养基 98 ml 混匀后保存于 4?冰箱备用。 1.4.3 噬菌体相关培养液 营养肉汤培养基 称取牛肉膏 5 g,蛋白胨 10g,NaCl5g,加入 1000ml 蒸馏水搅拌至充分溶解且溶 液变为清亮,用 15%NaOH 及 5%HCl 溶液调 pH7.2~7.4,分装 10ml 于三角小烧瓶 中,121?高压蒸汽灭菌 20 min。 半固体营养琼脂培养基称取牛肉膏 5 g,蛋白胨 10g,NaCl5g,加入 1000ml 蒸馏水搅拌至溶解且溶液变 为清亮,用 15%NaOH溶液调 pH7.2~7.4,再加入琼脂 10g,置于电炉上加热 至琼脂 沸腾溶解,分装(5 ml/管)后 121?高压蒸汽灭菌 20 min。 固体营养琼脂培养基称取牛肉膏 5 g,蛋白胨 10g,NaCl5g,加入 1000ml 蒸馏水溶解至溶液变为清亮, 转移入于三角烧瓶中,用 15%NaOH 溶液调 pH 7.2~7.4,再加入琼脂粉 20 g,121 ?高压蒸汽灭菌 20 min。 1.4.4 实时定量 PCR 相关试剂 LB 培养基称取胰蛋白胨 10g,酵母抽提物 5g,NaCl5g,加入 1 L三蒸水充分搅拌至完全溶 解后用 15%NaOH及 5%HCl 调节 pH 7.0。 氨苄青霉素 配制浓度:100mg/ml 称取氨苄青霉素0.5g溶于5ml无菌双蒸水,溶解后用注射器取溶液并经0.22μm孔 13 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 径滤膜过滤除菌,分装2ml/管,-20?保存。 含氨苄的LB平板 称取琼脂粉15 g,加入1LLB 培养基后经121?高压蒸汽灭菌20 min。当培养基温 度降至50?时,加入氨苄至终浓度100μg/ml。85mm直径的培养皿约需30ml 培养基。 待培养基完全凝结后重新置于平皿筒中密闭置于冰箱内4?贮存。5 TBE保 存液 称取Trisbase 54g,硼酸 27.5g,加入20 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),定容到 1L。 电泳时现配稀释为0.5 TBE。14 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 方法 技术路线 贝类样品 水 样 采集后去壳称重, 利用病毒采集 解剖,-20?保存 器滤水收集 3%牛肉膏溶液 取全贝样品,甘氨 取贝肠道样品甘 pH9.5洗脱两次 酸缓冲液 pH9.5 氨酸 -苏氨酸洗脱 pH7.5洗脱 氯仿抽提,PEG沉淀 PEG沉淀,高速离心 RNA提取 逆转录反应 普通 PCR 及荧光实时定量 PCR 实验数据输入 Excel, 使用 SPSS17.0 软件进行统计处理, 比较贝类样品与水样的病毒提取方法,比较贝类样品的两种洗 脱方法的回收率,探索贝类重量与组织中肠道病毒含量的关系, 以及贝类肠道病毒含量与水样中肠道病毒含量的关系。 2.1 PEG 法沉降肠道病毒 2.1.1 甘氨酸洗脱 (1) 样品称重,根据重量加入其 7 倍体积的甘氨酸缓冲液pH9.5,匀浆器高速运转 档,充分破碎 2min间隔 1min,重复三次。 (2) 取 40ml 匀浆液于离心管中,标记,室温震荡 15min。 (3) 4?离心,5000g,30 min。收集上清 20ml,用 5%HCl 调节 pH7.0,加入等体积 15 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 的 16%PEG8000,使其终浓度达到 8%,置于冰浴沉降病毒过夜。 (4) 4?离心,8000g,30 min。弃上清,加入 15mlPBSpH9.0缓冲液吹吸,重新悬浮 沉淀,加入等体积氯仿,迅速剧烈混匀。 (5) 4?离心,5000g,30 min。样品溶液分层,小心吸取上清 12.5ml,注意不要碰到 蛋白层分界面中的物质,用 5%HCl 调节 pH7.0,加入等体积的 16%PEG8000,再 次沉降浓缩病毒,置于冰浴沉降病毒过夜。 (6) 4?离心,8000g,30 min。弃去上清,沉淀置于冰箱-20?保存。 2.1.2 甘氨酸-苏氨酸洗脱 (1) 从-80?冰箱中取出贝类样品,待其融化后解剖出贝类肠道(图1) 。取1.5g贝类肠 道样本,加入15mL甘氨酸缓冲液pH7.5,匀浆器中充分破碎2min间隔1min,重 复三次,室温震荡15min。 (2) 4?离心,5000 g,离心30 min。取上清于一新的离心管中,向沉淀中加入15 ml 苏氨酸缓冲液pH7.5,5000 g,离心30 min。合并2次上清,用5%HCl调节pH7.0, 加入等体积的16%PEG8000,使其终浓度达到8%,置于冰浴沉降病毒过夜。 (3) 4?离心,8000g,30 min。弃上清,加入15ml PBSpH9.0缓冲液吹吸,重新悬浮 沉淀,加入等体积氯仿,迅速混匀。 (4) 4?离心,5000g,30 min。样品溶液分层,小心吸取上清12.5ml,注意不要碰到 分界面上物质,用5%HCl调节pH7.0,加入等体积的16%PEG8000,再次沉降浓缩 病毒,置于冰浴沉降病毒过夜。 (5) 4?离心,8000g,30 min。弃去上清,沉淀存于-20?。 图 1 河蚌解剖图(浙江大学生物实验教学中心 2007年)16 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.2 细胞培养2.2.1 细胞复苏取出保存于-80?的 Vero 细胞,置于 37?水浴中迅速融化。以下步骤在超净工作 台中完成:用玻璃吸管将细胞悬液从冻存管中转移至 15ml 离心管,加入 MEM 培养 液 5ml, 1000rpm,离心 5min,弃上清,加入 MEM 培养液 4.5ml、灭活胎牛血清 0.5ml。 充分混匀悬液后转移至 50ml 细胞培养瓶,瓶盖旋松置于 37?、5% CO 培养箱中培 2 养。 2.2.2细胞换液 细胞复苏后第二天即换液。弃去细胞培养瓶中的培养液,加入 5ml PBS溶液冲洗 瓶壁 2~3次以去除死细胞,然后向培养瓶中加入 MEM 培养液 4.5ml,胎牛血清 0.5ml, 混匀后将瓶盖旋松置于 37?、5% CO 培养箱中培养。 2 2.2.3 细胞传代 显微镜下观察细胞生长情况,当细胞长满整个细胞培养瓶壁时进行传代。弃去细 胞培养瓶中的培养液,用 PBS溶液冲洗瓶壁 2~3次后加入细胞消化液 0.5ml。置于 37 ? CO 培养箱中 1~2min,显微镜下观察细胞形态,当细胞变圆散开时,加入 1ml 胎 2 牛血清至培养瓶中终止胰酶的消化作用,再加入 MEM 培养液 9ml,充分混匀吹打重 悬,使细胞从瓶壁脱落且分散均匀从中吸取 5ml 转移至另一个 50ml 细胞培养瓶。将 瓶盖旋松置于 37?、5% CO 培养箱中继续培养,并注意观察细胞生长状态。 2 2.2.4细胞冻存 显微镜下观察细胞生长情况,当细胞处于对数生长期时可进行冻存,冻存前一天 需换液。弃细胞培养瓶内培养液,用 PBS溶液冲洗瓶壁 2~3次,加细胞消化液 0.5ml 进行消化,置于 37? CO 培养箱中 1~2min,显微镜观察细胞变圆、散开时加 MEM 2 溶液 10ml 进行吹打,收集于离心管并计数,离心 1000rpm,5min。弃去上清,加入 6 细胞冻存液,使细胞的昀终密度为( 5~10)×10 个/ml。吹打混匀细胞悬液,分装入 无菌冻存管,1.5ml/管,封口胶封口,4?冰箱冻存 30min,-20?冰箱冻存 60min,然 后移至-80?冰箱长期冻存。 2.2.5 致细胞病变反应(CPE):17 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 (1) 消化并重悬Vero细胞,将细胞悬液接种于细胞培养板,每孔100μl,置于37?、5% CO 培养箱中培养,次日接种病毒。 2 (2) 加入细胞维持液溶解并混匀PEG法沉降肠道病毒所得沉淀,将此悬液加入细胞培 养板中,每孔100μl,加5孔,每孔设置正常细胞对照,对照加入细胞维持液,每孔100μl。 (3) 置于37?、5% CO 培养箱中培养,显微镜下逐日观察细胞病变。 2 2.3 脊髓灰质炎?型增殖 取出-80?低温冻存的脊髓灰质炎?型(Sabin株),37?水浴融化,接种于已铺满 单层Vero细胞的培养瓶内,1ml/瓶。加入细胞维持液9ml,混匀后旋松瓶盖置于37? 、 5% CO 培养箱中培养,显微镜下逐日观察,接种PV-I后Vero细胞的病变达到3/4时收获 2 病毒。将细胞培养瓶置于冰箱中并反复冻融3次破碎Vero细胞释放病毒。将含有病毒 的培养液转移至15ml离心管中,6000rpm,离心15min后,吸取病毒上清液分装于高压 灭菌过的EP管中,1ml/管,保存于-20?冰箱,用于阳性对照。 2.4 空斑法测定PEG沉降肠道病毒回收率 2.4.1增殖并筛选大肠杆菌 285 (1) 于 20ml 已灭菌营养肉汤中接种 2个大肠杆菌 285菌落, 37?恒温摇床培育 10h, 观察到肉汤菌液浑浊,备用。 (2) 将装有半固体琼脂培养基的试管制备成斜面,凝固后存于 4?备用。 (3) 将固体琼脂培养基 121?高压蒸汽灭菌 20min 后,待温度降到 50?左右时,将 其迅速倒入平皿,20ml-30 ml/皿,待其凝固,密闭置于平皿筒中 4?备用。 (4) 用接种环沾取少许大肠杆菌 285菌液,以分区平板划线接种于平皿中,置于 37 ? 5% CO 培养箱中培养 24h。挑选单个菌落,接种于灭菌营养肉汤中,37?恒 2 温摇床培养 10h,再接种转移至半固体琼脂培养基中,置于 37? 5% CO 培养 2 箱中培养 24h后转移至 4?冰箱保存。 2.4.2 大肠杆菌 f2噬菌体的增殖 (1) 室温融化大肠杆菌 f2 噬菌体保存液。取 20 ml 经 0.22μm孔径滤膜过滤除菌后收 集大肠杆菌 f2噬菌体原液。18 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 (2) 准备 50ml 的营养肉汤培养基高压蒸汽灭菌 20min后,接种大肠杆菌 285 宿主 菌悬液 2ml,经 37?恒温摇床培养 4h 左右,当观察到肉汤浑浊时加入 f2 噬菌 体原液 1ml,37?恒温摇床培养 24h。观察溶菌现象,待肉汤由浑浊变为清亮时 就可收集含 f2噬菌体的肉汤培养液。 (3) 将此培养液反复冻融三次以破碎残余细菌,将冻融后的 f2 噬菌体悬液分装于 15ml 离心管中,10ml/管,5000rpm,离心 30 min。取上清 0.22μm孔径滤膜过滤 除菌,分装于已灭菌离心管中,置于-20?保存。 2.4.3 大肠杆菌 f2噬菌体的效价测定 (1) 宿主菌的增殖培养:取出大肠杆菌 285半固体斜面,从中挑选 2个独立的菌落 接种至已灭菌营养肉汤液体培养基(20ml)中,于 37?恒温摇床中培养 10h, 待肉汤浑浊时即可使用。 (2) 取出保存于-20?的 f2噬菌体, 37?水浴融化后加入无菌蒸馏水作 10倍系列稀 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 释,稀释度为:10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 。 (3) 半固体营养琼脂培养基经 121?高压蒸汽灭菌 20min后置于 45?水浴中保温备 用。 (4) 将固体琼脂培养基 121?高压蒸汽灭菌 20min后,待温度降到 50?左右时,将 其迅速倒入平皿,20ml-30 ml/皿,待其凝固,密闭置于平皿筒中 4?备用。 (5) 分别取大肠杆菌 285 悬液 0.2ml、不同稀释度 f2 噬菌体稀释液 1ml 以及约 45 ?的半固体营养琼脂 5ml,震荡器混匀,倒入制备好的平皿中,平放于操作台 上待其冷却后,倒置于 37?CO 培养箱中。培养 20h后,观察平皿中的透明空 2 斑并计数,根据以下公式计算大肠杆菌 f2噬菌体的 PFU值。稀释倍数? p1p2 / 2 PFU v PFU: 空斑形成单位 P: 某稀释度平皿中空斑数的计数值v: 试管中接种 f2 噬菌体的体积,即 1ml 19 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2.4.4 贝类样品回收率的测定 在对贝类进行处理后的匀浆液中,每份样品分为A组、B组,A组加入1ml f2噬菌 体原液(已测定其PFU值) , B组不加。经过甘氨酸缓冲液或甘氨酸-苏氨酸缓冲液洗脱、 PEG沉淀等步骤之后,将沉淀溶于1ml PBS pH7.0中,测定该沉淀的PFU值,实验方 法同2.4.3,并计算回收率。 回收率公式: A组沉淀PFU值 - B组沉淀PFU值 回收率 f2噬菌体原液PFU值 2.5 水样的现场采集及富集 2.5.1 水样采集 现场检测水温为 24?,水样浊度平均值为 61.6,pH值: