猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBRGreen_荧光定量RT_PCR方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBRGreen_荧光定量RT_PCR方法的建立 江 西 农 业 大 学 学 报 第 31 卷第 6期 Vo l. 31 , No. 6 2009 年 12 月A c ta A gricu ltu rae U n ive rsita tis J iangxien sis D ec. , 2009 ( ) 文章编号 : 1000 - 2286 200906 - 1074 - 05 猪繁殖与呼吸综合征病毒 SY BR Green ? 荧光定量 RT - PCR方法的建立 王守山 ,李玉保 ,孟喜龙 ,马 飞 ()聊城大学 农学院 ,山东 聊城 252359 摘要 :根据文献合成 1 对针对 PRR SV 毒株 O R F6 基因高度保守序列 的 引 物 , 建 立 用 于 检 测 PRR SV 的 SYBR Green ?荧光定量 R T - PCR 诊断方法 。提取 PRR SV - LC 病毒 RNA ,经所建立的荧光定量 R T - PCR 方法扩 ( ) ( ) ( )增 ,可获得特异的扩增曲线 ,而日本乙型脑炎病毒 J EV 、猪伪狂犬病毒 PRV 、猪细小病毒 PPV 和猪圆环病 ( )毒 PCV 进行同条件检测 ,结果为阴性 ;方法可检测到 1 TC IDPRR SV ,比琼脂糖凝胶电泳敏感度高 10 ,100 50 倍 。结果表明 ,所建立的 PRR SV 荧光定量 R T - PCR 诊断方法特异性好 、敏感性高 ,可进一步应用于猪繁殖与 呼吸综合征的临床诊断和科学研究 。 关键词 :猪繁殖与呼吸综合征病毒 ;荧光定量 R T - PCR; 检测 中图分类号 : S852. 65 文献标识码 : A D evelopm en t of SY BR Green ? Fluorescence Quan tita tive RT - PCR A ssay for D etection of Porc ine Reproductive and Resp ira tory Syndrom e V irus WAN G Shou - shan, L I Yu - bao, M EN G X i - long, MA Fe i ( )Co llege of A gricu ltu re, L iaocheng U n ive rsity, L iaocheng 252359 , Ch ina A b stra c t:A cco rd ing to the refe rence, a p a ir of p rim e rs ba sed on h igh ly con se rva tive OR F6 gene sequence of PRR SV we re syn the sized. The quan tita tive SYBR Green ?R T - PCR m e thod fo r de tec ting PRR SV wa s e s2 ( ) tab lished. PRR SV RNA wa s extrac ted and then amp lified u sing the F luo re scence Q uan tita tive FQ R T - PCR. Sp ec ific amp lifica tion cu rve wa s ob ta ined a s exp ec ted. U nde r the sam e cond ition s, howeve r, the re su lts of the de tec tion of J EV , PRV , PPV and PCV by the FQ R T - PCR we re a ll nega tive. The FQ R T - PCR cou ld de tec t the lea st 1 TC IDviru s, and the sen sitivity wa s 10,100 tim e s h ighe r than tha t of A ga ro se Ge l E lec tro2 50 p ho re sis. The re su lts ind ica te tha t the FQ R T - PCR m e thod in th is re sea rch ha s h igh sen sitivity and sp ec ific i2 ty, and cou ld be fu rthe r app lied to PRR SV c lin ica l d iagno sis and re sea rch. ( ) Key word s: po rc ine rep roduc tive and re sp ira to ry synd rom e viru s PRR SV ; fluo re scence quan tita tive R T ( ) - PCR FQ R T - PCR ; de tec tion ( )猪繁殖与呼吸综合征 Po rc ine rep roduc tive and re sp ira to ry synd rom e, PRR S是目前影响全球养猪业 [ 1 ] [ 2 ] 的最重要疾病之一 ,可引发妊娠母猪晚期流产 、早产和产死胎 ,以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病 。 收稿日期 : 2009 - 07 - 26 修回日期 : 2009 - 09 - 26 ( )( )基金项目 :山东省自然科学基金项目 Y2007D78 和聊城大学博士科研启动基金项目 31805 ( ) 作者简介 :王守山 1968 - ,男 ,讲师 ,硕士 ,主要从事动物分子病理学研究 。 ( ) ( ) 检测 PRR SV 常规的方法包括病毒分离和鉴定 、间接免疫荧光抗体试验 IFA 、血清中和试验 SN 、反 [ 2 ] ( ) ( 转录 - 聚合酶链反应 R T - PCR 以及序列测定等 。荧光 定量 PCR F luo re scence quan tita tive R T - )PCR , FQ R T - PCR 是近几年发展起来的病原分子检测技术 ,与常规 R T - PCR 比较 ,具有重复性好 、灵 [ 3 , 4 ] 敏度高 、定量准确 、工作效率高等优点 ,并可避免扩增产物污染所导致的假阳性发生 ,且不必使用对 人体有害的染色剂 。 SYBR Green I模式的荧光定量 PCR 是利用荧光染料 SYBR Green I与 DNA 双链结 合后释放荧光的特点而建立的一种应用较广的荧光定量 PCR 技术 ,它具有成本低 、不需设计探针 ,且适 [ 5 ] 合于高度变异的基因检测等优点 。 本研究旨在建立 PRR SV SYBR Green ?荧光定量 R T - PCR 技术 ,为兽医临床诊断 PRR S提供一种 快速 、准确的方法 ,并为开展大规模的 PRRS流行病学调查 、疫情监测和进一步的科学研究提供技术依据 。 1 材料与方法 1. 1 毒株及主要试剂 [ 6 , 7 ] ( ) PRR SV LC毒株为聊城大学预防兽医研究室分离并保存 。猪乙型脑炎病毒 JEV 、猪伪狂犬病 ( ) ( ) ( )毒 PRV 、猪细小病毒 PPV 、猪圆环病毒 PCV 均为蒋文明博士惠赠 ; Trizo l、AMV、H S - Taq、RNA 酶 ()抑制剂 、DNA M a rke r均购自宝生物工程 大连 有限公司 ; SYBR Green?染料购自上海开放科技有限公 () ( ) 司 ; p GEM - T载体系统试剂盒 A3610 、体外转录系统试剂盒 P1440 购自美国 P rom ega 公司产品 ; 胶 ()回收 小量 试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司 ; iCyc le r iQ TM 荧光实时多波长 PCR 检测系统为美 国 B io - R ad公司产品 。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 引物设计与合成 根据文献 [ 8 ]合成引物 ,引物由上海生物工程有限公司合成 。上游 P1: 5 ’- TTTGGGGA GTGTACTCGGCCA TA GA - 3 ’;下游 P2: 5 ’- GGCA TA TTTGACAA GGTTTACCACT - 3 ’。 μ1. 2. 2 病毒 RNA 的提取 用 RNA 提取试剂盒按其操作说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 提取病毒培养物的总 RNA ,溶于 30 L D EPC处理水 , 20 g / kg琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的质量 , - 70 ?保存备用 。 1. 2. 3 一步法 FQ R T - PCR 及扩增片段的亚克隆 以提取的总 RNA 作为模板 , PCR 扩增 PRR SV 目的 μμμμ片段 。反应体系为 25 L ,模板 5 L ,依次加入 10 ×PCR B uffe r 2. 5 L , RNA 酶抑制剂 1 L , 10 mmo l / L μμμμμdN TP混合液 1 L , AMV 反转录酶 1 L , H s - Taq聚合酶 0. 5 L , 25 mo l /L 的上下游引物各 1 L , μ 1 % D EPC水 12 L。反应条件 : 42 ?反转录 45 m in, 95 ?预变性 3 m in; 94 ? 30 s, 63 ? 30 s, 72 ?30 s, 30个循环 ; 72 ?延伸 8 m in。 R T - PCR 产物作 15 g / kg琼脂糖凝胶电泳分析 。在紫外灯下用刀片 割取特异性条带 ,用胶回收试剂盒纯化 PCR 产物 ,连接到 p GEM - T 载体 。取连接产物转化 E. co li JM 109感受态细胞 ,轻轻混合均匀 ,冰浴 30 m in, 42 ?水浴热休克 90 s,快速取出转移至冰浴 3 m in,加入 μμ800 L SOC培养基 , 37 ?, 150 r /m in振荡培养 3 h,使抗性复苏 。取 200 L 培养液涂布 LB 固体培养 (μμμ) 基平板 含 100 g /mL 氨苄青霉素 , 100 g /mL IPTG和 50 g /mL X - Ga l, 37 ?温箱中倒置培养过夜 , 进行蓝白斑筛选 。 (μ)挑选白斑单克隆菌落在 LB 液体培养基 含 100 g /mL 氨苄青霉素 中 37 ?振荡培养过夜 ,采用碱 裂解法进行小量质粒的提取 , 10 g / kg琼脂糖凝胶电泳检测 。重组质粒进行 PCR 鉴定 ,阳性质粒送上海 博亚生物技术有限公司测序 。选出阳性重组质粒用于体外转录制备 RNA 探针 ,阳性重组质粒保存于 - 20 ?备用 。 1. 2. 4 FQ R T - PCR 条件优化 将制备的 RNA 样品作为标准品 ,对影响 PCR 的各成分浓度和参数 2 + ()引物浓度 、M g浓度 、退火温度及循环次数 进行优化组合 。 1. 2. 5 体外转录标准品和标准曲线的制备 阳性重组质粒根据体外转录系统试剂盒说明书进行线性 化 ,并经碱性苯酚 、氯仿的抽提纯化 。按体外转录系统试剂盒说明书进行体外转录 。 15 g / kg琼脂糖凝 胶电泳鉴定体外转录 RNA 的质量 。即为 RNA 标准品 ,分装后 - 80 ?保存备用 。 用核酸测定仪测定 RNA 标准品的浓度 ,进一步换算成拷贝数 。对标准品进行一步法 R T - PCR 鉴 - 3 - 6定 。将鉴定好的标准品进行 10 ,10 系列梯度稀释 ,进行一步法 FQ R T - PCR 反应 ,以模板起始拷贝 第 31卷 ?1076? 江 西 农 业 大 学 学 报 ( )数的对数为横坐标 ,以对应样品临界循环数 Thresho ld cyc le, C t为纵坐标制作标准曲线 ,得到标准方程 。 1. 2. 6 特异性试验 应用上述优化的荧光定量 PCR 条件 ,同条件下检测 PRR SV LC、J EV、PRV、PPV、 PCV ,利用 PCR 产物制作溶解曲线 ,且进行 10 g / kg琼脂糖凝胶电泳 ,进行特异性试验 。 6 6 1. 2. 7 敏感性试验 将测定毒价为 10TC ID 的 PRR SV LC作 10倍梯度稀释 ,为 10TC ID ,1 TC ID50 50 50 μ 共 7 个梯度 ,应用上述优化的荧光定量 R T - PCR 方法对稀释的病毒进行检测 ,反应结束后 ,取 5 L 扩增产物进行 10 g / kg琼脂糖凝胶电泳 ,比较建立的荧光定量 R T - PCR 方法与琼脂糖凝胶电泳之间的敏 感性差异 。 2 结果分析 2. 1 优化的 FQ R T - PCR 条件 2 + μ对引物浓度 、M g浓度 、退火温度及循环次数等条件进行优化 ,反应体系 : 模板 5 L ,依次加入 10 μμμμ ×PCR 缓冲液 2. 5 L , 25 mmo l /L M gC l1 L , RNA 酶抑制剂 1 L , 10 mmo l /L dN TP 混合液 1 L , 252 μμμμμ ×SYBR 染料 1 L , AMV 反转录酶 1 L , H s - Taq 聚合酶 0. 5 L , 25 mo l /L 的上下游引物各 1 L , μμ1 % D EPC水 10 L ,体系为 25 L。在 iCyc le r iQ TM 型实时荧光 PCR 仪上进行扩增 。反应条件 : 42 ? 反转录 45 m in, 95 ?预变性 1 m in, 94 ?变性 30 s, 63 ?退火 30 s, 72 ?延伸 30 s, 80 ?收集荧光 8 s, 共 40 个循环 。 R T - PCR 反应结束 后 , 进 行熔解 曲 线分 析 : 95 ? 10 s, 65 ? 10 s, 然后 每 个 循 环 温 度 增 加 0. 5 ?, 60 个 循 环 ,整个过程收集荧光 。 2. 2 FQ R T - PCR 标准曲线 FQ R T - PCR 扩增标准曲线为 : Y = - ( ) 3. 297X + 43. 028 r = 0. 998 。其 中 Y 代 表 C t值 , X 代表模板量的对数值 。标准曲 线的斜率接近理想值 - 3. 322 ,相关系数也 - 3 - 6 - 3 - 6 图 1 体外转录 RNA 模板 10 ,10 系列稀释制作标准曲线 接近 1. 000 , 在 10 ,10 的稀释范围内 - 3 - 6 Fig. 1 Standard curve of 10,10serial dilution of vitro transcrip t RNA () 有良好的线性关系 图 1 。 2. 3 FQ R T - PCR 方法的特异性 FQ R T - PCR 同条件下扩增 PRR SV LC、J EV、PRV、PPV、PCV 的扩增曲线 、PCR 产物的溶解曲线 ,以 及 PCR 产物的 10 g / kg琼脂糖凝胶电泳结果 。 以所提取的 PRR SV LC、J EV、PRV、PPV、PCV 各 RNA 为模板进行 FQ R T - PCR 扩增 。只有 PRR SV LC能够扩增出特异的曲线 ,同样溶解曲线只有 PRR SV LC样品显示一个峰以及琼脂糖电泳只有 PRR SV LC样品见 1 条 266 bp 左右的条带 ,表示本研究建立的 PRR SV 荧光定量 R T - PCR 的特异性较好 ,扩增 () 体系较为理想 图 2、图 3 。 ()()图 2 PRR SV LC、J EV、PRV、PPV、PCV 为模板的 FQ R T - PCR 扩增曲线 A 和溶解曲线 B () () F ig. 2 Amp lifica tion A and m e lt B cu rve of PRR SV LC、J EV、PRV、PPV、PCV 2. 4 FQ R T - PCR 方法的敏感性 6 10TC ID ,1 TC ID PRR SV LC作为模50 50 板进行荧光定量 R T - PCR 检测 。结果发现 6 10TC ID ,1 TC ID PRR SV LC都可以得到50 50 扩增曲线 ,但是由于循环数定为 40 个 ,所以 1 TC IDPRR SV LC 的 反 应 管 并 没 有 完 成 50 “S”型扩增曲线 , 不过从熔解曲线可以判定 , 扩增产物是特异的 。将 PCR 产物进行 10 g / kg 琼脂糖电泳 ,可见特异性条带 ,但是在 1 TC ID 50 PRRSV LC的模板 , PCR 产物电泳未见特异性 图 3 荧光 R T - PCR 产物的电泳结果 结果 ,可见 FQ RT - PCR 方法比普通琼脂糖电 F ig. 3 A ga ro se ge l e lec trop ho re sis of FQ R T - PCR () 泳方法敏感度高 10,100倍 图 4、图 5。注 : 1. DNA M arker; 2. PRRSV LC; 3. JEV; 4. PRV; 5. PPV; 6. PCV 6 图 4 10TC ID ,1 TC ID PRR SV LC模板扩增曲线及溶解曲线50 50 6 () () F ig. 4 Amp lifica tion A and m e lt B cu rve of 10TC ID ,1 TC ID PRR SV LC50 50 3 讨 论 因为 PRR SV 侵害免疫系统 ,并能够形成 持续性感染 ,免疫预防比较困难 ,因此该病已 [ 1 , 9 ] 成为危害养猪业的重要传染病 。我国目 前检测 PRR SV 常规的方法包括病毒分离和 ( ) 鉴定 、间接免疫荧光抗体试验 IFA 、血清中 ( ) 和试验 SN 、原位杂交 、免疫组化 、反转录 - [ 2 , 10 , 11 ] ( )聚合酶链反应 R T - PCR 等 。比较而 言前几种检测方法耗时长 、操作繁琐 ,而 R T - PCR 具有简单快捷 、准确等优点 。 FQ R T - PCR 作为一种核酸定量检测技术 ,是在常 6 规 PCR 基础上加入荧光物质 ,可对目的基因 图 5 10TC ID ,1 TC ID PRR SV LC模板 R T - PCR 电泳结果50 50 [ 12 ] 6 的起始水平进行准确定量检测 ,与其他定 F ig. 5 R T - PCR re su lts of 10TC ID ,1 TC ID50 PRR SV LC50 6 (量 PCR 技术 如有限稀释法 、内对照 PCR、竞 注 : 1,7: 10TC ID ,1 TC ID PRR SV LC模板 ; 8: DNA M a rke r50 50 ) 争性 PCR 相比 ,具有重复性好 、灵敏度高 、定量准确 、工作效率高等优点 ,并可避免扩增产物污染所导 [ 3 ] 致的假阳性发生 ,且不必使用对人体有害的染色剂 。本试验应用一步法 R T - PCR 方法进行实时荧光定量 。该方法不需构建 cDNA 文库 ,即 cDNA 合成与 PCR 反应在同一 B uffe r及酶中进行 ,快速 、简便 、 敏感 ,减少污染机会 ,减少 RNA 二级结构 ,同时聚合酶具有校正活性 ,减少 PCR 反应的错配率 。标准曲 线的制作采用了 PCR 产物克隆到 p GEM - T载体中 ,进行体外转录 RNA ,以 RNA 梯度稀释作为标准品 进行一步法 R T - PCR 实时荧光定量检测 ,这种制作方法可以同步 、准确反映反应体系中反转录和扩增 第 31卷 ?1078? 江 西 农 业 大 学 学 报 [ 13 ] 过程的效率 ,使结果更为可信 ,未知样品通过与标准曲线比较即可得到定性及定量结果 。 PRR SV 的基因型有两种 , 欧洲型和美洲型 , 在这两种基因型之间 , PR F6 基 因片 段具 有 高度保 守 [ 8 ] 性 。因此 ,本研究选用苏晓鸥等报道的针对 PRR SV O R F6 基因高度保守区域的一对引物 ,该引物既 [ 8 ] 可以用来检测欧洲型的 PRR SV 也可以检测美洲型的 PRR SV 。 ( ) ( ) 此外 ,利用所建立的 FQ R T - PCR 方法对猪日本乙型脑炎病毒 J EV 、猪伪狂犬病毒 PRV ,猪细 ( ) ( )小病毒 PPV ,猪圆环病毒 PCV 进行同条件检测 ,结果均为阴性 ,表明本研究建立的 R T - PCR 检测方 法具有良好的特异性 。本研究方法能够检测 1 T ICD 50的 PRR SV ,与韦天超等所建立的 PRR SV Taq M an [ 2 ] - M GB 荧光定量 R T - PCR 方法的敏感性相当 ,但本研究方法不用设计探针 ,成本更低 。由标准曲线 的斜率 、相关系数以及熔解曲线结果显示 ,笔者所建立的 FQ - PCR 技术平台是理想的 ,试验结果准确地 反映每一反应管中的模板量 ,可以应用于 PRR S的临床诊断及流行病学调查 ,且可以用于研究 PRR SV 在猪体内分布规律 ,探讨 PRR S的发病机理 。 参考文献 : [ 1 ]蔡宝祥 . 家畜传染病学 [M ]. 4版 . 北京 :中国农业出版社 , 2001: 211 - 213. 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