急性胆管炎时肝组织ICAM—1与循环PMN表面CD11b,CD18的表？…

急性胆管炎时肝组织ICAM—1与循环PMN表面CD11b,CD18的表？… 急性胆管炎时肝组织ICAM—1与循环 PMN表面CD11b,CD18的表,… 5'2, 第21卷第6期 4241999年6月 第三 ACTAACADEMIAE - 7 侈行2 军医大学 MEDICINAEMILITARISTERTIAE Vo】.23.N0.6 Jun.1999 @ 急性胆管炎时肝组织ICAM一1与循环PMN表面CD11b,CD18的表达变化 黄显凯'韩本立"厶朱锡光(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通外科)重庆,400042 提要目的:观察急性咀管煲时大鼠肝组织1CAM一1与循环PMN表面CDIIb,CD]8的表达变化.方 法:应用原位分子杂交和斑点杂交技术观察胆道感染时ICAM一1mRNA在肝组织的定位及转录表达强度; 用流式细胞倥曩I定PMN表达CD1lb且CD18的阳性率.结果:ICAM一1mRNA原位杂交显示胆道感染3h 后肝窦内皮细胞,枯否细胞和肝小叶中央静脉内皮细胞阳性反应增强,12h阳性反应最强.斑点杂交显示胆 道感染后3h肝组织ICAM一1mRNA古量开始增高,12h达高峰.循环PMN表达 CD]1b和CD]8的阳性率 3h后明显增高.结论:胆道感染大鼠肝窦内皮细胞等表面ICAM?1与循环PMN表 面CD]lb,CD18的表 达显着增强. 美键词胆道感染dCAM一1~CDllb;CD18 中圈法分类号R392.11;R5757 ICAM一1与配体CD11b/CD18是非常重要的几 种粘附分子,在中性粒细胞(Polymorphonuclear, PMN)与微血管内皮细胞粘附,穿越内皮迁移,参与炎 症反应过程中发挥重要作用.本实验应用原位分子杂 交,斑点杂交,免疫组化和流式细胞仪 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 观察胆道感 染时这些粘附分子的表达变化,井探讨其在胆道感染 肝损害中的意义. 1材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1动物模型及分组 体重200,250g,自由进食进球. Wistar大鼠,雌雄不拘, 动物随机分为3组:?正常对照组;@假手术(s0)组:动物乙醚 吸人麻醉,无菌条件下开蝮,游离胆总管,然后关腹.@急性胆 管炎(AC)组:同样条件下开蝮分离胆总管结扎远端,近端注 入0.3mI大肠杆菌苗液(ECol[.O111B4北京生物制品鉴定 所),结扎近端胆总管,关蝮.各组分别于3,6,12,24h取材,每 个时相点6只动物 急性胆管安大鼠12h开始发生死亡,存括率仅为70, 24h存括率仅为45,S0组各时相点均无死亡.AC组3h始 出现梗阻近端胆管扩张,肝充血肿胀胆管中充满黄白色腺性 胆汁12h肝表面可见多发性粟粒样脓肿,24h融合成较大的 脓肿光镜下见AC组各时相肝小叶间胆管扩张肝细胞索排 列紊乱,肝窦扩张,肝细胞呈现细胞水肿肝细胞散在小片坏 死,24h肝细胞出现大片状坏死.电镜下见AC组6h后毛细 阻管明显扩张,檄绒毛减少,肝细胞线粒体肿胀嵴断裂,灶性 空化或基质浓缩.粗面内织同且侑面内织网扩张.急性胆管炎 大鼠肝功能发生明显损害,结果见表1. 表1惫性胆管炎血浆LDH和GPT含量变化(IU/L) Tab1Changeofplasma【|DHandGPTfollowingacutecholangitis(IU/L) 1.2取材 大鼠麻醉后,开胸,经左心室-主动脉插管灌注生理盐水曲 200ml,然后灌注4多聚甲醛150,200mI.30rain后取出肝 -黄显凯.男,43岁.副主任医师.副教授.博士 ??附属西南医院肝胆外科中心重庆,400038 组织,投入4多聚甲醛液置冰箱继续固定,24h后取出肝组 织,放人2O蔗糖溶液(4多聚甲醛配制)过夜.取出标本在 一 70?保存备用. 1.3原位分子杂交 将ICAM—ieDNA质粒转化到大肠杆菌(JM109)中井扩 氯仿抽提质粒并纯化,电泳鉴定.加入内切酶EcoRl, 增,用酚, 第6期黄显凯,等.急性胆管炎时肝组织ICAM一1与循环PMN表面CDllb,CD18 的表达变化425 即将ICAM一1酶切.制备线性DNA模扳.用地高辛标记 CAM一1cDNA探针.冰冻切片机将肝组织切30冰冻切片,参 照文献[1]方法进行原位井于杂交.原位杂交对照采用以下两 种方法:?杂交前将切片用2Oug/mlRNA酶预处理30rain; ?杂交液中不加核酸探针或加地高标记的顺义探针 1.4RNA提取及斑点杂交 用异硫氰酸胍提取肝组织RNA,进行斑点杂交-.显影 结果用计算机扫描仪扫^.测定各杂交点的光密度值.并作相 对定量. L5PMN表面CD1lb及cD18的阳性率测定 参照严鸣等[的方法分离大鼠PMN并调至5X10/m1.取 0.2m】加^到5m【试管(内含1×1O细胞),加^鼠抗大鼠 CD18或CD11b单抗10u】(意大利Rossi教授惠赠).室温孵育 30rain,再加^兔抗鼠荧光抗体(华美公司)10【宣温置30 min.加人1m【1多聚甲醛溶液.用PACSCAN流式细胞仪 测定. 2结果 2.1肝组织ICAM一1原位杂交 正常肝组织可见少许散在井布的阳性反应细胞,呈紫蓝色 颗粒,主要觅于肝窭内皮细胞,枯否细胞和肝小叶中央静脉内 皮细胞也呈阳性反应.胆道感染后阳性反应增强.表现阳性细 胞数量增多,细胞内阳性颗粒逐渐增多,蓝色变依,照遭感染后 12h阳性反应最强,24h阳性反应开始减弱.但仍较正常肝组 织阳性反应强. 2.2肝组织ICAM一1斑点杂交 胆道感染后3h肝脏ICAM—lmRNA含量开始增高(P< 0.01),且运渐增高,感染后12h达高峰,24h呈下降趋势,见 表2 表2急性胆管炎肝组织ICAM1mRNA台量变化(,g) Tab2ChangeofICAM?1mRNAcontentafhepatictissuefollowingacutecholangilis(pg/g) 2.3循环PMN表面CDllb,CD18表逮变化 正常大鼠循环PMN表达CD18的阳性率仅62,而胆道 感染大鼠循环PMN3hCD18阳性细胞增多(,<0O1),并逐 渐增高正常大鼠循环PMN表达CDllb的阳性率仅6.5,而 胆道感染大鼠各时相点循环PMNCDllb阳性细胞增多(P< O01),见表3 表3急性胆管炎循环血PMN表达CDllb,CD18阳性率变化() Tab3ChangeofpastiverateofPMNexpressCDllb,CD18followingacutecholangitis() Pfer?io Post0perat1OR 3h6h12h24h 3讨论 *:Pd0.01SO PMN在组织和脏器的大量聚集和过度活化可对 宿主产生破坏作用,造成组织损伤.在严重感染,组织 缺血,缺氧等情况下,PMN与微血管内皮细胞牯附性 增强,通过黄嘌呤脱氢酶一氧化酶系统,髓过氧化物酶 系统,NAKPH氧化酶系统等产生大量氧自由基,造成 血管内皮细胞损伤,并使微血管通透性增高.PMN在 趋化因子作用下穿越血管内皮细胞迁移到周围组织, 释放活性氧,水解蛋白酶及脂类代谢产物,造成脏器的 细胞损害.近年来研究发现PMN对组织细胞的损害 作用呈牯附依桢性,即依桢PMN与微血管内皮细胞 的粘附,而这种牯跗的分子基础是PMN和血管内皮 细胞表面细胞粘附分子的表达变化]. 426第三军医太学第21卷 PMN表面粘附分子CDllb,CD18和内皮细胞表 面牯附分子ICAM一1是PMN与微血管内皮细胞牯附 过程中非常重要的几种牯附分子.CDIlb和CD18储 存于PMN第二和第三级颗粒的储存池内,当PMN活 化时PMN的CD11b和CD18由细胞内颗粒向细胞表 面转位,以及颗粒膜与胞质膜融合,导致PMN表面 CDnb及CD18显着增高.CD1lb和CD18的配体 ICAM1是一种诱导性抗原,应答II,一1,TNF,IFN7或 IPS等细胞因子及炎症介质在内皮细胞等细胞上表 达.ICAM1广泛分布于内皮细胞等细胞上,合成的蛋 白储存于细胞颗粒内,当受到细胞因子等刺激耐转位 到细胞膜上,使细胞表面表达增加,研究表明CD11b/ CD18及配体ICAM一1在PMN后期与血管内皮细胞 牢固牯附和穿越内皮迁移中发挥关键性作用... PMN活化后CDIlb和CD18质和量发生改变,而 PMN的粘附和穿越内皮迁移与CDub和CDI8表达 量上调及构型改变有关Is].PMN与内皮细胞粘附后造 成内皮细胞损伤,血管内皮通透性增高,也为PMN穿 内皮迁移提供了有利条件. 全身感染时,TNF,II,1,IFN7及IPS等刺激下, PMN及各脏器微血管内皮细胞表面的相关粘附分子 表达增强,从而介导一系列炎症反应关于胆道感染时 肝组织粘附分子的表达变化及其在肝脏损害机制中的 作用还不清楚本实验结果显示胆道感染大鼠肝窦内 皮细胞等细胞表面ICAM一1与循环PMN表面 CD11b,CD18的表达显着增强,且其水平变化与肝损 害的组织学改变及肝功能损害相一致,表明胆道感染 初期这些牯附分子表达明显上调,为PMN与肝窦内 皮细胞牯附和迁移提供了分子基础,可能在胆道感染 肝脏损害等发生机制中具有重要意义. 参考文献 1蔡文琴,王伯拓主编.实用免疫细胞化学与棱酸分于杂交技 术,成都:四,If科学技术出版社,1994.4064434 2KobayashiH,NonamiT,KurokawaT,etd.Meehanism andpreventionofischemia—reperfusioninducedliverinjury inratsJSurgRes,1991,51(2):140 3严鸣,龚肖崎,张亚靠.大鼠中性粒细鹈的分离及糖皮质激 索受体阻断率的测定,第二军医大学,l994,15(1):85 4金伯泉主编.细胞和分子免疫学北京:世界图书出版公司, 1994.35,47 5RosenSD.BertozziCR.Theselectinsandtheir1igand CliftOpinCellBio1l994,6(5):663 6LeyKE,BullardD,ArbonesML,eta1.Settuentialcon— tributlonofL—andP—selectintoleukocyteroiling}i.. ExPMed,1995,181(8):669 7$chleiffenbaumB,FehrJ.Regulationandselectivityof [eukocyteemigration.JLabCLiaMedl996,l27(2):15l 8ChatilaTA,GehaRS.ArnaoHtMA.etalConstitutive andstimulus—inducedph0sphDrylat10nofCD11/CD18leuko— eyteadhesion,JC】Bio]t1989,169(6Pt2):3435 (收稿:1998—09—15;修圆{1999-01—22) (编辑汪勤俭) ChangesofICAM一1expressionintheliverandCDllbandCD18expres— sioninPMNsinseverecholangitisinrats HuangXiankai,HanBenli,ZhuXiguang(DepartmentofGeneralSurgery,DapigHospita1,T hirdMilitayMedica1Uni versit. v,Chongq[ng,40a042) AbstractObjective:TDstud>'ofICAM— iexpressionintheliverandCDIfbandCD18exPresNi0nin PMNsduringseverecholangitisinrats.Methods:Expressionof1CAM一 1mRNAinthelivefv4-&sdetermined withinsituh, vbrdizatonanddothybridizationandexpressionofCD1lbandCD18inPMNswithflDwcvtD m— etry.Results:ICAM一 1mRNAexpressedmain[yinthesinusoidalendothelia1cells.kupfferce11sandtheon- dothelialcellsofthecentralveinofahepatic[obule.Theexpressionandthere]atiequantitv0fI CAM一1nlR— NAbegantoincreaseinthe3rdhafterinfectionandreachedthepeakinthe12thhour.TheexDresi0nof CDIlbandCD18inPMNsalsobegantohepositiveinthe3rdhourafterinfectiDnandreachedthe口e8kinthe 12thhour.Conclusion:ExpressionofICAM一 1intheliverandCDI1bandCD18inPMNsaremarkedlyin— creaseinseverecholangitis. Keywordscho1angitis/acute;ICAM一1;CD11h:CD18:rat