神经末梢突触囊泡释放神经递质过程的调控蛋白

神经末梢突触囊泡释放神经递质过程的调控蛋白 ?综 述? 蔡 倩1 陆佩华1 ? 盛祖杭1 , 2 ? (1 上海第二医科大学神经生物学实验室 , 上海 200025 ; 2美国国家健康研究院突触功能研究室) 摘要 神经末梢突触囊泡释放神经递质是一个复杂且受到精细调控的过程 ,涉及多种蛋白质间的 ( synaptobrevin/ VAMP) ,与 相互作用 。位于突触囊泡膜上的突触囊泡蛋白/ 突触囊泡相关膜蛋白 位于突触前膜上的 syntaxin 和突触小体相关蛋白 SNA P225 ,三者聚合形成的可溶性 N2甲基马来 (NSF) 附着蛋白受体 ( SNARE) 核心复合物是突触囊泡胞吐过程中的核心成分 酰 胺敏感因子 。 本文 ,以及调节 SNARE 核心复合物的形成 ,解离及其功能的蛋白质 , 。 关键词 ; ; SNARE 蛋白 ; 调控蛋白 Q189 Proteins Regulating Neurotransmitter Release of Synaptic Vesicles at Nerve Terminals CAI Qian, L U Pei2Hua1 ? , SHEN G Zu2Hang1 , 2 ?(1 Department of Neurobiology , S hanghai Second Medical U2 niversity , Shanghai 200025 ; S ynaptic Function U nit , N ational Instit ute of Neurological Disorders 2 1 and S t roke , Bethesda , Maryland 20892 , USA) Abstract Neurotransmitter release of synaptic vesicle at nerve terminals is a complicated and elabo2 rately regulated process , involving a cascade of protein2p rotein interactions. The SNARE core complex consisting of synaptobrevin/ VAMP (a synaptic2terminal protein) , syntaxin and SNA P225 ( synaptic membrane2associated proteins) , acts as the membrane fusion machinery and plays essential roles in synaptic vesicle exocytosis. This review will discuss proteins with potential roles in synaptic vesicle ex2 ocytosis by regulating assembly , disassembly and the function of SNARE complex , and sum up the molecular model of vesicle exocytosis. Key words Neurotransmitter ; Exocytosis ; Synaptic vesicle ; SNARE ; Regulating protein 神经递质释放过程是神经系统信息传递的基本 过程 ,是生命活动的 基本事件之一 。因此 ,对神经递 质释放的分子 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 的研究已成为神经科 学领域的一 个热点 ,而突触囊泡胞吐过程又是神经递质释放机 制中的一 个核心问题 。自 20 世纪 90 年代在酵母上 发现了囊泡循环所必需的突 触同源蛋白以来 ,各种 膜转运的基本机制和分子模型不断提出 。由于突 触 囊泡释放神经递质是一个由多种蛋白质介导的复杂 过程 ,并在多个环 节受到精确调控 ,因此 ,越来越多 的研究集中于参与该过程的蛋白质及 其相互间的作 用 。本文结合最新研究进展 ,对参与该过程的调控 蛋白作如下综述 。 可 溶 性 NSF 附 着 蛋 白 膜 受 体 一 、NSF 和 ( SNARE) 复合物 目前认为 , SNARE 核心复合物是突触囊泡胞 吐过程中的核心成分 ,而且参与几乎所有分泌细胞 的胞吐过程 。它由三种蛋白质组成 : 位于突触前膜 的 t2SNARE (target2SNARE) ,包括 syntaxin 和突触 小体相关蛋白 ( synaptosome2associated protein of 25 kD , SNA P225 ) ; 位 于 突 触 囊 泡 膜 上 的 v2SNAR E (vesicle2SNARE) ,为突触囊泡蛋白/ 突触囊泡相关 膜蛋白 vesicle2associated membrane protein , VAMP/ synaptobrevin) 。SNARE 的命名源于它们最初是作 为 N2甲基马来酰胺敏感因子 ( N2et hyl2maleimide2 ( sol2 sensitive factor , NSF) 和可溶性 NSF 附着蛋白 uble NSF attachment proteins , SNAP) 的膜受体 ,即 SNAPs 蛋 白 受 体 ( SNAP receptors , SNARE ) 。 3 (39928001) 国家海外 、香港青年学者合作研究基金课题 ? 通讯作者 Syntaxin 和 VAMP 均通过羧基末端的跨膜区分别 锚定于突触前膜和突触囊泡膜上 ,而 SNA P225 无跨 膜区 ,它通过其中间区 4 个半胱氨酸 残基中的脂酰 基锚定于突触前膜 。目前已在哺乳动物细胞中发现 30 多种 SNARE 超家族成员 ,多数成员在分泌过程 中都有其特异的亚细胞定位 。生化研究结果显示 , 重组 α螺旋syntaxin ? SNA P225 和 VAMP 三者结构中的 (coiled2coil domain) 可形成一个稳定的 形成区 核心复(core complex) , 该核心复合物可抵抗 合物 SDS 的变性作用 ,蛋白酶的水解以及梭状芽孢杆菌 神经毒素的裂解作用 ,其热稳定性可达到约 90 ?。 SNARE 三聚体核心复合物的亲和力很高 ,复合物相互作用的解离常数尚未确定二 、1 在 核 物 之 前 , Munc 18/ nSec 1 与 syntaxin 结合 ,使其空间构型处于闭合状 (closed conformation) 。一旦胞吐过程启动 态 , Rab 蛋白促进 Munc 18/ nSec 1 与 syntaxin 的解离 , 使 syntaxin 闭合的空间构型打开 ,启动 SNARE 核心复 合物形成 。核心复合物中由 syntaxin 和 VAMP/ synaptobrevin 各提供一个α螺旋 , SNA P225 提供两 个α螺旋 ,形成核杆状四螺旋束 。核心复合物使突 触囊泡膜与突触前膜相互靠近 ,此时突触囊 (prefusion) 状态 泡处于 预融合 。Ca2 + 的大量内流 可诱导 SNARE 核心复合物中的螺旋束完全聚合 (zipping) , 促使突触囊泡膜与突触前膜融合 ,囊泡中的内容物 释放 。之后 ,稳定的 SNARE 核心复合 (cis2SNAR E) 。此时 物位于同一 侧质膜面上 ,胞质 中的α2SNA P 和 NSF 募集至此 ,与 SNARE 核心复合物结合 ,NSF 发挥 A TP 水解酶的作用 ,使 SNARE 核心复合物解 聚 ,结果 SNA P225 、VAM P 和 syntaxin 又呈游离状 态 ,经再循环到达合适位 (图 置并加入下一个突触囊泡 胞吐过程 1) 。 图 1 突触囊泡胞吐过程的分子模型 摘自 Chen 和 Scheller , Nature Reviews Molecular Cell Biology ,2001 , 2t98,106 尽管已有许多实验证实 SNARE 复合物介导神 经递质释放的膜融合过程 ,但在酵母液泡 (vacuolar) 融合系统中发现 ,裂解并以抗体阻断 SNARE 复合 物再聚合后并未影响液泡内容物的混合 。在海胆卵 2 + 融合系统中 ,Ca可使 SNARE 复合物解聚 ,而皮质 囊泡的同型融合过程并未受影响 。研究结果还发 现 ,在 VAMP2 (synaptobrevin) 缺陷或经神经毒素裂 [ 2 ] 解的酵母 、苍蝇和蚯蚓中 ,膜融合过程并未消失。 Peters 等发现 ,在适合的离子浓度和相应蛋白质存 在的条件下 ,脂质膜无需 SNARE 复合物的参与也 可融合[ 3 ] 。那么 , SNARE 复合物在突触囊泡分泌 过程究竟发挥什么作用 ? 尽管 SNARE 直接参与膜 融合过程的观点已广为接受 ,但目前尚不能排除另 一种可能性 ,即 SNARE 复合物并非膜融合过程所 必需 ,而是仅参与一个催化过程 ,该过程可以稳定膜 (fusion pore) 的过渡状态[ 2 ] 。 融合中间体或融合孔 进一步阐明融合孔性质的研究无疑将有助于揭示参 与该过程蛋白质间的复杂作用 。 三 、GTP 结合蛋白及其相关蛋白 位于突触末端的 GTP 结合蛋白 ,如 rab 等 ,含 有 GTP 酶的基序以及 GTP/ GDP 结合区域 。在突 触囊泡胞吐过程中 , GTP 结合蛋白通过结合 GTP 且发挥 GTP 酶的作用 ,水解 GTP ,与 SNARE 复合 物发生短暂的相互作用 ,调节 SNARE 核心复合物 的形成 ,可抑制突触囊泡胞吐 , 并调节神经递质释 放 。 GTP 结合蛋白 , , Rab ( targeting) 和 (tethering) 阶段发挥重要作用 捆绑 ,由此决定囊泡 (一) Rab in 与 SNA P225 或 synaptobrevin 结 合 , 最 终 抑 制 SNARE 复合物的形成 。在枪乌贼巨大突触上的功 能研究显示 , Munc218 可抑制神经递质释放 。但过 转运过程的特异性 。研究发现 , rab3 的同源蛋白 Ypt1p 序列可调节酵母中 SNARE 复合物的形成 。 Rab3A 是 Rab 家族中的主要蛋白 。在神经末梢 , rab3A 及其潜在的效应蛋白 rabphilin 3A 和 rim 通 过水解 GTP 参与神经递质的释放过程 。Rab3A 同 (L TP) 时对海马 CA3 区苔状纤维突触长时程增强 的形成至关重要[ 4 ] 。 (二) Rim Rim 是 rab3 的效应蛋白 ,特异地定 位于突触的活性区 (active zone) 。Sandhya 等的研 ( dock2 究结果显示 ,rim 蛋白不参与突触囊泡的搭靠 ing) 过程 , 但可能调节其与突触前膜融合的启动 (priming) 过程[ 5 ] 。目前认为 ,突触囊泡搭靠至活性 区后激活 rim 蛋白 ,后者再激活 Munc213 , Munc213 可促进 Munc218/ nSec21 从 syntaxin 上解离 ,并打开 syntaxin 闭合的空间构象 ,进而诱发 SNARE 复合物 形成 ,使突触囊泡进入预融合状态[ 6 ] 。 (三) Rabphilin 3A Rabphilin 3A 也是 rab3 的 效应蛋白 ,位于突触囊泡膜上 ,以 GTP 依赖性方式 与 rab3A 结合 。将重组的 rabphilin 3A 蛋白注入枪 乌贼巨大突触可抑制突触囊泡胞吐 ; 而对 rabphilin 基因敲除小鼠的研究发现 ,在神经递质释放过程中 , rab3A 发挥调节作用时可无需 四 、与 SNARE 作用的rabphilin 参与[ 7 ] 。其 功能有待进一步阐明 。 蛋白 (一) Munc 18/ nSec 1 Munc 18/ nSec 1 作为 伴侣分子 (chaperone) 与闭合构型的 syntaxin 结合 , 调节 SNARE 核心复合物的形成 。体外结合实验显 示 Munc218 可与 syntaxin 相互作用 ,并抑制 syntax2 度 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 Munc218 的 PC12 细胞 ,其分泌功能并未受 到 影 响 。Voets 等 的 最 新 研 究 结 果 显 示 , 缺 乏 Munc1821 的小鼠嗜铬细胞 ,其 Ca2 + 依赖性大囊泡 (LDCV) 的分泌功能以及搭靠活性区的大囊泡数量 下降至对照组的 10 % ,但其它与释放相关的动力学 特征与对照无差异 。在牛嗜铬细胞中过度表达 Munc1821 则可提高可释放囊泡的数量 ,且囊泡的供 应也加快 ,故推测 Munc1821 不仅 在 SNARE 复合物 形成过程的上游发挥作用 ,还可加速大囊泡的搭靠 活性区[ 8 ] 。该结果提示 ,对于不同类型的神经内分 泌细胞 ,Munc218/ nSec 1 在神经递质释放过程中的 调节作用存在明显差异 。 (二) α2SNA P 和 NSF 二者最初是在高尔基体 转运实验中被发现 , NSF 具有 A TP 酶活性 , 与α2 SNAP 在突触膜融合后解离 SNARE 复合物 , 是调 控神经递质释放的另一个分子伴侣系统 。Littleton 等用果蝇 (Drosophila) 的 syntaxin 和 NSF 突变体研 究发现 , 膜融合后 , NSF 可解离位于突触前膜的 SNARE 复合物 (cis2SNAR E) 。NSF 不参与膜融合 事件 ,作用于突触囊泡分泌和内吞过程的中间阶段 , 分解 SNARE 复合物 ,促进它的再循环[ 9 ] 。α2SNA P 和 NSF 的作用是使 SNARE 复合物始终处于解离 和聚合的动态平衡中 。 (三) Snapin Snapin 是本文作者实验室最近 克隆的一个调控蛋白 ,位于突触囊泡膜上 。通过与 SNA P225 的直接作用而与 SNARE 复合物发生联 2 + 系 ,进而促进 SNARE 核心复合物与 Ca信号蛋白 synaptotagmin 的相互作用 。在 snapin 羧基端有一 个螺旋区 ,向颈神经节注入含有该区域的外源性肽 段可抑制突触分泌[ 10 ] 。进一步研究还发现 , snapin 磷酸化后与 SNA P225 的结合能力显著增强 ,同时也 可增强 SNARE 复合物与 synaptotagmin 的相互作 [ 11 ] 用 ,最终促进突触囊泡胞吐。因此 , snapin 不仅 是神经递质释放过程 中的一个调控因子 ,并可作为 P KA 的作用底物 ,参与第二信号系统对突触释放的 调节 。 (四) Syntaphilin Syntaphilin 是位于突触前膜 的一个调控蛋白 ,也由本文作者实验室所克隆 ,可与 SNA P225 竞争与 syntaxin21 的结合 ,通过与 syntax2 in21 结合进而抑制 SNARE 复合物的形成 。在培养 的海马神经元中过度表达 syntaphilin 可显著减少神 经递质释放 。将含有其螺旋区的肽段注入颈神经节 突触前神经元可明显抑制神经递质释放 。此外 ,对 syntaphilin 氨基酸序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 发现 ,它含有许多蛋白 质磷酸化位点 ,推测它可能通过第二信使系统的磷 酸化 ,发挥“分子钳”的作用 ,控制形成 SNARE 复合 物所需的游离 syntaxin ,从而有效地调节突触囊泡 的膜融合及神经递质释放的过程[ 12 ] 。 (五) Complexin Complexin 能与α2SNA P 竞争 与 SNARE 复合物的结合 ,并调节其功能 。通过在 Aplysia 口腔神经节的功能研究证实 , complexin II 可抑制神经递质释放 。Takahashi 等研究了 com2 plexin II 基因缺陷小鼠 , , 受 损[ 13 ] 析与 SNARE ,动力学以及 热力学改变 ,得出结论 : complexin 对突触囊泡胞吐 的调 控 作 用 发 生 在 SNARE 核 心 复 合 物 形 成 之 后[ 14 ] 。因此 ,complexin II 可能对神经递质释放具 有多重调节功能 ,并调节 SNARE 复合物的形成 。 (六) SNA P229 尽管 SNA P229 是 SNARE 超 家族中的一个普通成分 ,但本文作者实验室最新发 现它也具有调控神经递质释放的作用 。免疫共沉淀 证实 SNA P229 可与 syntaxin21 相互作用 ; 竞争结合 实验发现 ,SNA P229 可与 a2SNAP 竞争结合 SNARE 核心复合物 ,从而抑制 SNARE 核心复合物的解离 ; 将 SNA P229 注入颈神经节可显著抑制突触传递 ,且 该抑制作用呈现活性依赖性 。因此推测 , SNA P229 可能对 而调节膜融合后 SNARE 复合SNARE 核心复合物的解离起调控作用 ,进 物的再循环过程[ 15 ] 。 2 + 五 、Ca结合蛋白 Synaptotagmin 是一种位于突触囊泡膜的蛋白 (isoforms) 。Synaptotagmin 质 。已发现 12 种同形物 I 和 synaptotagmin II 可直接与 syntaxin 作用 ,该作 用受 Ca2 + 浓度的调控 。Ca2 + 可诱导 synaptotagmin I 插入突触前膜或作用于融合孔 ,因此是神经递质 释放过程的阳性调控蛋白 。另一方面 , synaptotag2 min 还可充当兴奋2分泌偶联过程的“融 合钳”, 与 SNARE 复合物结合并抑制其完全聚合和膜融合 , 直至 Ca2 + 内流诱导快速胞吐[ 16 ] 。Wang 等则认为 , synaptotagmin 更象一个“阀门”,通过稳定融合孔处 的脂质和/ 或膜蛋白核心复合物 ,调节融合孔的直径 和开放时间[ 17 ] 。Voet 等的研究发现 , 在 synapto2 tagmin 缺陷的细胞 ,快速的钙依赖性膜融合事件并 未完 全 消 失[ 18 ] 。因 此 , 目 前 另 一 种 观 点 认 为 , synaptotagmin 的主要作用是通过改变其与 SNARE 复合物相互作用的状态 ,从而控制膜融合过程的频 2 + 率 。SNARE 复合物中的 VAMP2 则可能是 Ca的 感受蛋白 ,参与有效的膜融合过程 。因此 ,进一步的 结论仍需更多的研究来 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 。 六 、钙通道 (1996 、1997) 发现 本文作者 N 型和 P/ Q 型钙通 道能通过 synprint 位点与 SNARE 核心复合物作 用 ,诱导外周和中枢神经系统的递质释放 ,此作用呈 2 + Ca依赖性 。引入 N 型钙通道上 syntaxin 结合区 肽段 ,阻断其与 SNARE 复合物的作用 ,可改变非洲 ( Xenopus) 神经肌肉接头处的递质释放 爪蟾 ,并推测 钙通道具有使神经递质释放过程同步化的作用 。此 外 ,N 型钙通道还可发挥电压感受器的作用 ,通过与 SNARE 复合物作用 ,增加突触囊泡的搭靠和/ 或胞 吐 ,其机制可能是捆绑 SNARE 复合物至钙通道周 围 ,使融合构件分子靠近 Ca2 + 内流部位 ,从而引发 突触传递 。 七 、蛋白激酶依赖性底物 (一) Synapsin Synapsin 家族至少由五种蛋白 组成 ,在突触囊泡膜表面形成同源二聚体或异二聚 体 ,是突触囊泡中含量最丰富的蛋白质 。最初研究 发现的 synapsin ,是作为 P KA 在脑中富含的一种底 物 ,后来发现 , synapsin 还是包裹突触囊泡的膜蛋 白 。synap sin 蛋白均含有 A 区 、B 区和一个大且保 守的中央 C 区 。所有 synapsin 蛋白中的 A 区均含 有唯 一 保 守 的 磷 酸 化 位 点 。在 非 磷 酸 化 状 态 , synapsin 可能通过与 A 区相关的磷脂结合活性以二 聚体的形式与突触囊泡结合 。A 区的磷酸化可抑制 其与磷脂结合 ,导致 synapsin 从突触囊泡解离 。因 此 ,synapsin 依赖蛋白激酶的作用 ,在突触囊泡与细 胞质之间循环 。来自 synapsin I 和 II 基因敲除小鼠 的电生理研究结果显示 ,其短时程突触可塑性选择 性受损 ,结果提示 ,synapsin 可能以磷酸化方式在调 节递质 释放中发挥作用[ 19 ] 。 (二) Munc213 Munc213 具有与佛波醇脂和甘 油二脂的结合位点 ,可与 Munc2182syntaxin 复合物 相互作用 。在非洲爪蟾神经肌肉接头过度表达 Munc213 ,可增强佛波醇脂促进神经递质释放的作 用 ,提示 ,它可能通过甘油二酯第二信使途径发挥作 用 。 另外 , P KC 或周期素依赖性激酶 5 可使 Munc2 18 磷酸化 ,磷酸化后的 Munc218 可提高 v2SNAR E 和 syntaxin 相互作用的水平 ,以及细胞的分泌 ,从而 调控突触传递的效率 。此外还发现 , SNA P225 的磷 酸化可抑制 SNARE 复合物的形 成 。α2SNA P 经 P KA 磷酸化后与 SNARE 复合物的结合能力下降 至正常的 1/ 10 。上述结果提示 , SNARE 复合物及 其相关蛋白的磷酸化可抑制突触传递 。此外 ,研究 还发现 SNARE 复合物在体外可被多种激酶磷酸 化 ,如 VAMP2 可被 Ca2 + 和钙调素依赖的蛋白激酶 II 以及酪蛋白激酶 II 磷酸化 ; syntaxin 1 可被酪蛋 白激酶 I 和 II 磷酸化 ,磷酸化位点分别位于 Thr21 和 Ser14[ 20 ] ; 而 SNA P225 可被 P KC 和 P KA 磷酸 化 ,但对体内控制 SNARE 复合物磷酸化的动因及 ,仍 另外 , ,、tomosyn 、Doc 2 等 , 但它们在膜转运过程中的确切功能尚不清楚 。 八 、结语 由于实验技术的不断发展 ,使人们对神经递质 释放过程的认识已有了质的飞跃 ,已发现了许多参 与神经递质释放过程的蛋白质 。然而 ,许多蛋白质 在膜转运过程中的确切功能仍不得而知 。尽管功能 研究促进了对神经递质释放机制的理解 ,但裂解一 个特异性分子依旧非常困难 ; 尽管基因敲除实验可 提供许多信息 ,但我们不得不排除基因表现型的因 素 ;另一个面临的困难是感兴趣的分子往往处于短 暂表达状态 。幸好膜 融合过程在所有真核细胞中保 守 ,因此可采用不同的技术在多种系统中 进行研究 。 将来 ,通过在不同系统中获得的结果 ,我们不仅可以 了解神 经递质释放过程的共性 ,还可探索针对某种 特定转运过程的个性特征 。 role for active zone protein Rim. 2001 , 4t997,1005. 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