大鼠视皮层脑片锥体神经元树突膜片钳技术.doc
基于大鼠视皮层脑片锥体神经元树突的膜片钳实验
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
1、实验说明
膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳(current clamp)。膜片钳技术可用来观察神经元的电生理性质以及功能特征和树突离子通道。大部分神经元采用膜片钳
方法
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记录时都是在神经元胞体进行, 因为这是单个神经元中最易接触到的较大区域。而神经元树突则是接受大部分突触信息输入的主要区域, 由于树突部位不易被钳制, 常常处于被忽视的地位。目前, 视皮层离体脑片的膜片钳全细胞记录技术已成为国外视觉系统电生理研究的主要技术之一。虽然在我国也已广泛开展, 但是树突膜片钳技术仅有极少数
实验室
17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划
能采用。本实验是在大鼠视皮层离体脑片锥体神经元近端树突部位进行实验, 并对神经元树突部位的膜电生理性质进行记录和描述，基本操作技术类似于在神经元胞体部位的膜片钳技术。
2、实验材料与试验方法
2.1标本制备:选取生后2~ 3周龄健康大鼠
2.2 电极制备:择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃(如苏打玻璃、电石玻璃)或硬质玻璃(如硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃)。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃应导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。膜片微电极是将玻璃毛细管用拉管仪拉制而成的，制作分三步进行:
使用前，第一步是分两次拉制，第一次拉长7,10 mm，直径小于200um，在此基础上进行第二次拉制，最终使尖端的直径为1,2μm，两步拉制的目的主要是使电极前端的锥度变大，狭窄部长度缩短，因此可降低电极的串联电阻，也可减少全细胞记录时的电极液透析时间。由于膜片微电极最忌粘染灰尘和脏物，更忌触碰尖端附近部位。
第二步是在电极前端涂以硅酮树酯(Sylgard)，其目的是为了降低电极与灌流液之间的电容，并形成一个亲水界面。
第三步是抛光，将电极固定于显微镜工作台上，在镜下将尖端靠近加热丝，当通电加热时，可见电极尖端微微回缩，此时电极变得光滑，且尖端的杂质烧去，得到较干净的
表
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面。(注:本实验可不进行这一步，前两步足以)电极在实验前要灌注电极液，由于电极尖端较细，因此在充灌前，电极内液要用0.2μm的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细管作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为2,5MΩ，而全细胞记录则最好在2,3 MΩ。
2.3 膜片钳系统:700B 膜片钳放大器(美国Axon 公司)、VT1000S 振动切片机( 美国 Leica公司)、P?97 电极拉制仪(美国Sutter 公司)、FN-S2N 红外微分干涉相差显微镜( 日本N ikon 公司)、C oo l SNAP HQ2 摄像机( 美国Photom etrics公司)、温控仪(美国哈佛仪器公司)、蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)。(注:以上实验器材是以满足本实验而设想)
2.4:溶液配制:ACSF的配制具体操作如下: 将N aC l7. 36 g、KC l0. 18 g、MgSO4 ?
7H2O 0. 49 g、NaH2 PO4 ? 2H2O 0. 20 g、N a2HPO4 ?12H2O 0. 45 g、G lucose 1. 98 g、NaHCO3 2. 18 g加入到500mL去离子水中, 磁力搅拌器搅拌10 m in。在上述溶液中缓慢加入CaC l2 0. 22 g, 搅拌10 m in。使用容量瓶以去离子水定容至1 000 mL, 摇匀。室温下在上
述溶液中通以体积分数95% O2 和体积分数5% CO2 混合气10m in使其达到饱和, 用pH 计测量溶液pH值调整至7. 4~ 7. 5。用渗透压仪测量溶液渗透压, 调整渗透压至300mo l? L- 1。电极内液的配制过程如下: 在8 mL去离子水中加入K?g luconate 0. 327 8 mg、KC l 0. 014 9 mg、EGTA0. 001 9 mg、HEPES 0. 023 9 mg、ATP 0. 011 0 mg、GTP 0. 001 3 mg, 室温下置于振荡机中振荡30 s。加去离子水至10 mL, 测pH 值, 用KOH 调整pH 值至7. 3左右; 测渗透压, 调整至295 mo l? L- 1。用一次性无菌针头滤器( 0. 2 ?m ) 将配好的细胞内液过滤 并分装到1 mL 的离心管中, 放置在0 ? 冰箱内保存。
2.5脑片准备及孵育过程:取规定天数的W istar:大鼠, 乙醚气体麻醉后以大体解剖剪迅速断头取脑,并置于0~ 4 ? 的通氧混合气(体积分数95% O2 和体积分数5% CO2 混合气) ACSF中冷却, 以利于脑组织变硬有益切片及降低脑组织耗氧量。在取得视皮层脑片组织后，浸入ACSF溶液中。
2.6 显微镜观察:利用红外微分干涉相差显微镜观察，找到视皮层，并进一步定位分层，利用可视法膜片钳全细胞记录技术, 根据细胞形态及电生理特点确定视皮层内锥体神经元[ 3?4] 。观察神经元形态, 调整显微镜使其成像在树突形态完整清晰的最佳层面。
2.7 封接记录:选定目标神经元后, 应用700B膜片钳放大器进行树突封接记录。( 1)电极内充灌适量的电极内液。( 2)测试方波电脉冲来判断电极和细胞位置关系。
3 数据采集、记录结果与数据分析
在神经元树突部位, 记录电极在电流钳模式下记录到的膜电位。全细胞记录模式下, 将膜电位钳制在不同水平时所记录到的神经元树突部位自发放电。将记录模式转换至电压钳模式, 在gap-free模式下进行连续数据采集和记录。将刺激电极置于白质, 给予白质刺激后在树突部位记录诱发反应。电压钳模式下, 将膜电位分别钳制于0 mV、- 50 mV、- 70 mV, 由M aster?8?vp程控电刺激仪控制视皮层白质双极电极电刺激产生单脉冲刺激, 膜片钳记录电极钳制神经元近端树突,并进行所钳制神经元突触后诱发反应的记录。然后进行数据分析。
至此，本实验设计完毕。
参考文献:大鼠视皮层脑片锥体神经元树突膜片钳技术 李 瑶 史学锋 等编著
浙公网安备 33021202002483