第 21卷 第 5期
2002年 9月
无 锡 轻 工 大 学 学 报
Journal of W uxi University of Light Industry
V01.21 No.5
Sep 2002
文章编号 :1009—038X(2002)05—0460—04
地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成
及其高效电转化方法
唐雪 明, 邵蔚蓝, 王正祥, 方惠英, 诸 葛健
(江南大学 工业 生物技 术教 育部 重点实验室,江 苏 无锡 214036)
摘 要 :通过体外处理诱导地衣 芽抱杆菌产生感受态性能,同时调整参数,建立了感受态细胞对质
粒 pAPR的 高效 电转化 方法 .当质粒 DNA 为 1.5 g/mL、转化 时 电压 为1 750 V时,可得 到 261个
转化子,经 鉴定均 为阳性 克隆子 .此为 以 芽抱杆 菌为宿 主进 行 高效 电转 化及 为建立 适合 工 业应 用
的分泌型
表
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达载体提供 参 考.
关键词:地衣芽孢杆菌;感受态细胞;高效电转化
中图分类号 :Q 785 文献标识码:A
Formation of Competent Bacillus licheniformis Cell and
High Efficiency Electrotransform ation for Vectors
TANG Xue—ming, SHAO W ei—lan, WANG Zheng-xiang, Fang Hui—ying, ZHUGE Jian
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Southern Yangtze University,Wuxi 214036,China)
Abstract:Bacillus licheniformis was induced tO form competent cells in vitro,and by changing pa—
rameters,a method of high efficiency electrotransformation for plasmid pAPR was established
. W hen
DNA concentration was 1.5~tg/mI and the voltage was 1 750 V,261 transformants were obtained on
screen plates.By the identification,all of transformants were positive clones
. W ith ordinary electro—
transformation method,20 transformants were obtained on screen plates.The experiments provided a
model for high efficiency electrotransformation with Bacillus strains as host cells
, and constructed a
foundation for looking for adaptable secretory expression vectors in industry
.
Key words:Bacillus lichen iform is;competent cells;efficiency electrotransformation
研究转化首先要考虑宿主细胞感受态(compe—
tent)的形成能力 .对于 大肠杆 菌宿 主细胞,经 过
CaC12处理后可使大肠杆菌得到较好的感受态性能,
每微克质粒转化得到 10 个转化子.而对于革兰 氏
阳性菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌要使其经过特殊
处理得到较好的感受态性能并非易事 .因为革兰 氏
阴性菌和革兰氏阳性菌在感受态细胞形成和 DNA
转化的机制上有很大的不同,目前有关机理知道的
还很少,所以用于处理革兰 氏阴性菌的方法并不适
用于革兰 氏阳性菌[ .然而,在工业生物技术的研
收稿日期:2002—04—15; 修订 日期 :2002—07—10.
基金项 目:教育部高等学校骨干教师资助项 目课题 .
作者简介 :唐雪 明(1970一),男,湖南道县人,博士研究生,讲师
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第 5期 唐雪明等:地衣芽孢杆 菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法 461
究和应用中,十分 需要 以分 泌型 革兰 氏阳性 菌 为宿
主的菌株,这对产品的后提取和精制很有意义,特
别是在以基 因工 程手 段 进行 的新 菌 种 的构 建 过程
中更是十分必要 的 .目前 以分 泌型 革兰 氏 阳性 菌作
为表达宿主已经成为工业生物技术领域的研究热
点 .将 外源 DNA转 入 宿 主必 须 面对 宿 主 细胞 的 感
受态性能问题,以及需要寻找到高效转化的途径 .
有学者以枯草杆菌为宿主制备成感受态细胞,并成
功进行了转化,但转化效率很低,均在 10个转化子
以下_2 J.在 以地衣芽孢杆菌为宿主时,往往难 以寻
找到好的感受态细胞处理方法而选择原生质体融
合的方 法,但 成 功 的 情 况 并 不 多 ,且 过 程 较 为 烦
琐 [3 J.作者在研究构 建整 合型 碱性 蛋 白酶 工程菌 的
过程 中,以地 衣 芽孢 杆 菌 为宿 主 ,诱 导 培养 使其 形
成具有感受态性能的细胞,并通过摸索,建立了适
用于地衣芽孢杆菌的电转化条件,得到了较好的结
果 .
1 材 料 和 方法
1.1 材 料
1.1.1 菌株 和质 粒 Bacillus licheniformis 2709
突变侏由本实验室保存;质粒 pAPR为含有碱性蛋
白酶基因的整合型载体,并含有卡 那霉素抗性基
因,由作者构建 ,另文发表
1.1.2 试剂 5倍的微量盐溶液(1 000 mI ):10 g
(NH4)2SO4,74 g K2HPO4,27 g KH2PO4,9.5 g
MgSO4·7}{,O,pH 7.0;质量分数为 20%的葡萄糖
溶液,质量分数为 20%的酪氨酸溶液;所用试剂均
为分析纯 .
1.1.3 培 养基
I B液体培养基:常规方法配制,在液体培养基
中添加质量分数为 1.5%的琼脂即为 LB固体培养
基.I B固体培养基和液体培养基在需要时加入卡
那霉素至 30 g/mI .
芽孢杆菌基本培养基(100 mI ):20 mL 5倍的
微量盐溶液,2.5 mI 质量分数为 20%的葡萄糖,1
mI 质量分数为 20%的酪氨 酸溶液 .
芽孢杆 菌饥 饿 培 养 基 (诱 导 芽 孢 生成 培 养基 )
(100 mI ):20 mI 5倍的微量盐溶液,2.5 mI 质
量分数为 20%的葡萄糖.
酪素固体培养基(1 000 mI ):干酪素 8 g,酵母
臂 2 g,K2HPO4 14 g,KH2PO4 6 g,(NI-I4)2SO4 2 g,
琼脂 12 g,pH 7.2~7.4.
BY液体培养基(1 000 mI ):牛肉膏 5 g,酵母
膏 5 g,蛋白胨 10 g,NaC1 5 g,葡萄糖 5 g,pH 7.2~
7.4.
1.2 方 法
1.2.1 Bacill“s licheni r,,zis感 受 态细胞 的诱 导
形成 接种新鲜 Bacillus licheniformis 2709单菌落
至 10 mI 芽孢杆菌基本培养基中,37℃ 剧烈振荡
培养 16~18 h,250 r/min,培 养 至 OD6oo为 1.0时,
取 1.5 mI 培 养液 加入 到 10 mI 37℃ 水浴 预热的
40 mI 新鲜芽孢杆菌基本培养基 中.37℃剧烈振荡
培养 4 h,250 r/min.加入 10 mI 芽孢 杆菌饥 饿培
养基,37℃剧烈振荡培养 4 h,250 r/rain.将细菌在
冰水浴冷却 15 min,分装于 0.5 mI Eppendorf管
中,于 4℃ 10 000 g离心 10 min,沉淀物 用预 冷的
水轻轻溶解悬浮,可直接进行实验,也可于 一70℃
冻存 .
1.2.2 非诱 导型 Bacillus licheniformis转化 前 细
胞(对照)的制备 接种新鲜 BacilluS licheniformis
2709单菌落至 10 mI I B液体培养基中,37℃ 剧
烈振荡培养 16~18 h,250 r/min,培养至 OD6oo为
1.0时,取 1.5 mL该培 养液加入到 50 mI 37℃ 水
浴预热的新鲜 I B液体培养基中.37℃剧烈振荡培
养 4 h,250 r/min.将细菌在冰水浴冷却 15 min,分
装于 0.5 mI Eppendorf管 中,于 4℃ 下 10 000
r/min离 心 10 min,沉 淀物 用 预 冷的 水 轻轻 溶解 悬
浮 ,可直接进行实验 ,也 可于 一70℃ 冻存 .
1.2.3 电转化 将新鲜制备的转化前细胞 0.5 mI
在 4℃ 下 10 000 r/min离心 10 min,弃去上清液,
加入 0.5 mI 冰水悬浮,如此反复洗涤细胞 3次,轻
柔操作 .冰浴 10 min后分别加入不同质量浓度的质
粒 DNA,混匀,将溶液转移到预冷的无菌电转化池
中,吸干池表面水分,将 电转化池放入电转仪的样
品槽 中,在 不 同 的电场 强 度 下 电击转 化 .迅 速取 出
电转化池,加入 1 mL BY液体培养基 稀释细胞,
37℃ 水浴摇床培养 1.5 h,取 200 I,涂布于 I B固
体卡那霉素抗性平板上,37℃培养.
1.2.4 阳性转化子的筛选 将阳性转化子点种于
酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选,观察透明圈.
2 结 果
2.1 不同电压下诱导型感受态细胞的电转化
选择 1 g质粒 DNA在不 同的 电压下对诱导 型
感受态细胞进行 电转 化 (取平 均值,P<0.05,下
同),结果如图 1所示.在 1 000,1 250,1 500,1 750,
2 000,2 500 V电压下分别平均得到了 11,57,102,
235,46,6个转 化子 .以 1 750 V 电压 下的转 化效率
最高 . ‘
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<'
梓
500 l 000 l 5O0 2 000 2 5O0
电压/V
图 1 诱 导 型 感 受 态 细 胞 在 不 同 电 压 下 的 转 化
(1 pLg DNA)
Fig.1 The electrotransformation of induced com petent
cells with 1 Ixg DNA
2.2 不同电压下非诱导型转化前细胞的电转化
选择 1 g质粒 DNA在不同电压下对非诱导型
转化前细胞进行电转化,结果如图 2所示 .在1 000,
1 250,1 500,1 750,2 000,2 500 V 电压下分别平均
得到了 1,6,11,18,2,0个 转化 子 .以 1 750 V 电压
下的转化效率最高,但是转化效率远远低于应用诱
导型感受态细胞进行电转化的效率.
图 2 非诱导型感受态细胞在不同电压下的转化(1}Lg
DNA)
Fig.2 The electrotransform ation of non·induced compe·
tent cells with 1 Ixg plasm id DNA
2.3 不同 DNA质量浓度下诱导型感受态细胞的
电转化
选择不同质量浓度的质粒 DNA在 1 750 V电
压下对诱 导型感 受态 细胞 进 行 电转 化,结 果如 图 3
所示.在质粒 DNA质量浓度( g/mI )为 0.5,1.0,
1.5,2.0,2.5时分别平均得到 了 93,235,261,149.
71个转化子.以质粒 DNA质量浓度为 1.5 g/mI
的转化效率最高.
2.4 不同 DNA质量浓度下非诱导型转化前细胞
的电转化
选择不同质量浓度的质粒 DNA在 1 750 V电
压下对非诱导型转化前细胞进行电转化,结果如图
4所示.在质粒 DNA质 量浓度 ( g/mI )为 0.5,
1.0,1.5,2.0,2.5时分 别平均 得 到 了 7,18.20,11.
4个转化子,以质粒 DNA质量浓度 为 1.5/~g/mI
的转化效率 最高,但是 转化 效率 远远 低于应 用诱 导
型感受态细胞进行 电转化的效 率 .
DNA质 量浓度/(u g/mL)
图 3 不同质量浓度 DNA在 1 750 V电压下的电转化
Fig.3 The electrotransform ation of induced com petent
cells with different concentration of plasmid
DNA质量 浓度/(u g/mL)
图 4 不 同质量浓度 DNA在 1 750 V电压下的电转化
Fig.4 The electrotransformation of non·induced com pe·
tent cells with different concentration of plasmid
DNA at 1 750 voltage
2.5 阳性克隆子的筛选鉴定
将质量 浓 度 为 1.5 g/mL 的质粒 DNA 在
1 750 V下对诱 导型感受态 细胞 电转化转 化子进 行
挑选,点种转移至酪素固体卡那霉素抗性平板上筛
选,37℃培养 2 4 h,可以观察到这些转化子周围均
产生明显的透明圈,如图 5所示.这表明整合型质粒
pAPR成功转入宿主细胞,并将碱性蛋白酶基因插入
到宿主染色体中成功表达,转化子均为阳性克隆子、
图 5 阳性克隆子的鉴定
Fig.5 Identification of positive clones
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第 5期 唐 雪明等 :地衣 芽孢杆 菌感受态细胞 的诱 导形成及 其高效 电转化方法 463
3 讨 论
目前,细菌感受态产生的机制有两种假说:一
是局部原生质化假说.支持这种假说的现象是发芽
的芽孢杆菌相对 于营 养体 更加 容 易转 化 ,适 当的溶
菌酶处理可 以提高转化率 ;二是酶受体假说 .支持
这种 假说 的现 象是 枯 草 杆菌 、链球 菌 、肺 炎 双球 菌
中都分离到相对分子质量为 5 000~10 000的感受
态因子_4 J.最新对转化机制的研究认 为,革兰氏阳
性菌中首先产生感受态因子,双链 DNA吸附于细
胞壁后,单链 DNA进入细胞,细胞中特定的蛋白质
包裹住外源 DNA防止被降解,最后重组产生稳定
的分子 .而革兰氏阴性菌未发现感受态因子,且外
源 DNA是 以双链形式进 入细胞的 ,
在细菌中能够形成感受态的细胞是很少的,一
般认为 0、1%~1,0%,而且细菌处于感受态是短暂
的,肺炎双球菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等属于这
类菌,一般认为,感受态是在细菌生长到对数后期
产生的,有学者认为,芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿
状态下,细胞易产生感受态因子,处于生长芽孢时
期的芽孢杆菌更容易产生感受态_5 J,作者在实验中
正是利用芽孢杆菌极限营养培养基,使地衣芽孢杆
菌处于 产生 感 受态 因子状 态 ,结 合 电转 化 ,同时探
索了影响 电转化效率的有 关参数 .
参考文献 :
一 般影响 电转 化的 因素有 细 胞培 养的 时间 、电
压的选择、DNA质量浓度、转化液的离子强度等,作
者选取的电压和质粒 DNA质量浓度作为基本考察
对象 .处理后 的 转 化前 .细 胞 由于 经过 冰水 反 复洗
涤 ,溶液 中离子强 度 已经很 低 .对于 电转 化而 言,并
非 电场强 度 越 高转 化 率越 高,因 为 随着 电压升 高,
细胞在瞬 间高压下 死亡 率就 越高 .不 同的细 胞对 电
压耐受力有 一个 限度,在 本 实验 中,当 电压达到
2 500 v时.细胞 已经 大量 死 亡,转化率 极低 .但是 ,
所选 择 电压也不 能太 低,如果 细胞 表面 的动作 电位
处于不应期的时间较长,转 化率也将很低.另外,并
非质粒 DNA质 量 浓 度越 高 转 化率 就 越 高,对 于大
肠杆菌 常 规转 化 以及 其 他细 菌 的转 化 研 究中都 证
实 了这 一点 _6 J,本 实验 得 出的结 果 也是 如此 .有关
详细机制 目前 尚不 明确,是否高质量浓度的质粒
DNA影响了细胞表面的电位变化或是封闭了 DNA
进入的通道还有待进一步研究,
本实验得到的转化率远远低于常规大肠杆菌
为宿主转化所得到的转化率(这与革兰氏阴性和阳
性菌的生理 状 态 和 细胞 结 构 有很 大 关 系),但是 比
之常规方法处理的地衣芽孢杆菌的转化率提高 了
13倍,转化子经过鉴定均为阳性克隆子,很好地满
足了进一步实验的需要,本实验的结果为以芽孢杆
菌为宿主 进行 高 效 电转 化 以及 为建 立 适合 工业 应
用的分 泌型表达载体提供 了参考 ,
[1]李育阳.基因表达技术 [M].北京:科学 出版社,2001.
[2]MATI I,SADAIE Y,KADA T.DNA Repair in competent cell of bacillus subtilis,J Bacteriology,1983,155(2):933—936.
【3】SAMBROOK J,FRITSCH E F,MANIATIST,Molecular Cloning:A laboratory Manual[M].New York:Cold Spring Harbor
Laboratory Press,1989.
[4]盛小禹.基因工程实验技术教程[M].上海 :复旦大学出版社.1999.
【5]HARWOOD C R,CUTTING S M,Molecular Biological Methods for Bacillus[M].New York:John Wiley Press,1990.
【6]彭秀铃,袁汉英,谢毅 等.基因工程实验技术[M1.长沙:湖南科学技术出版社,1998.
(责任 编辑 :杨 勇)
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