[中学]n乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用

[中学]n乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用 n乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用 n乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用 本文来源:论文 作者:张秋贵 韩敏 张秀秀 李光玲 张秋贵 【摘要】 目的 通过建立大鼠耳毒性损伤模型，观察n?乙酰半胱氨酸(nac)对庆大霉素所致耳蜗损伤的保护作用。方法 健康wistar大鼠60只，随机分为正常组、对照组、庆大霉素组、nac干预?1组、nac干预?2组。对照组腹腔注射生理盐水120 mg/(kg?d),共14 d;庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素120 mg/(kg?d),共14 d; nac干预?1组在上述剂量腹腔注射庆大霉素前1 h腹腔注射100 g/l的nac 350 mg/(kg?d),共14 d; nac干预?2组注射庆大霉素(同庆大霉素组)14 d后再腹腔注射nac 3 350 mg/(kg?d),共14 d。所有动物在实验前作听性脑干反应(abr)阈值测定,除正常组外其他组动物分别在全部用药结束后24 h作abr阈值测定，处死后取听泡，苏木精?伊红染色法观察耳蜗各部的组织学改变;免疫组织化学法检测耳蜗中核因子?κb (nf?κb)及肿瘤坏死因子?α (tnf?α)的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。结果 用药结束后，庆大霉素组abr阈值与其他组比较差异均有显著性(f=74.77，q=3.28,5.29,p<0.05)，nac干预?2组与其他组比较差异均有显著性(q=2.24,3.28,p<0.05)。庆大霉素组和nac干预?2组血管纹、螺旋神经节和corti 器毛细胞nf?κb、tnf?α表达增强，与其他组比较差异均有显著性(f=27.47,48.81，q=1.34,4.31,p<0.05)。结论 nf?κb和tnf?α可能共同参与了耳蜗药物性损伤过程，nac可能对庆大霉素所致的耳蜗损伤具有保护作用。 【关键词】 耳蜗;庆大霉素;药物毒性;n?乙酰半胱氨酸;大鼠,wistar ,abstract, objective to investigate the protection of n?acetylcysteine (nac) against the damage of cochlea caused by gentamicin by creating a rat model of ototoxicity. methods sixty healthy wistar rats were randomized to five groups: the normal, control, gentamicin ototoxicity (go), nac intervention?1 (naci?1) and nac intervention?2 (naci?2) groups. to the control, peritoneal injection (pi) of normal saline 120 mg/(kg?d) was given; to the go, pi of gentamicin 120 mg/(kg?d) was offered; to the naci?1, pi of nac 350 mg/(kg?d) was done one hour before pi of the same dosage of gentamicin was gi?ven as the former two groups. the course was 14 days for the above three groups. to the naci?2, 14 days after pi of gentamicin, same as the go, and then pi of nac 350 mg/(kg?d) was carried out for another 14 days. all the rats underwent abr leak?point detection before experiment and 24 hours after ending of medication, except those in the normal group. the rats were killed and the otic vesicles collected, which were stained with hematoxylin?eosin, the histomorphology of cochlea was observed. the expression of nf?κb and tnf?α was studied immunohistochemically. results upon completion of medication, the difference of abr between the go and the other four groups (f=74.77;q=3.28-5.29;p<0.05), and that of abr between the naci?2 and the other four groups were significant (q=2.24-3.28,p<0.05). the expression of nf?κb and tnf?α in psalterial cord, spiral ganglion and corti hair cell in the go and naci?2 was stronger than that in the other four groups (f=27.47-48.81;q=1.34-4.31;p<0.05). conclusion nf?κb and tnf?α may involve in the course of pharmacologic damage of the cochlea caused by gentamycin, on which nac probably shows its protection. ,key words, cochlea; gentamicin; drug toxicity; n?acetylcysteine; rat, wistar 耳毒性药物损伤是当前临床治疗的一大难题，众多学者围绕其发病机制及治疗展开了深入的研究，以期为临床治疗耳毒性药物损伤提供更好的思路和方法。 关于药物性损伤的机制，目前多认为与自由基损伤、钙离子超载等有关1?2，但其损伤机制尚不明确。 近年来，药物性损伤中核因子?κb (nf?κb)和肿瘤坏死因子?α(tnf?α)所起作用引起人们的广泛关注。本研究在建立耳蜗耳毒性药物损伤动物模型的基础上，通过检测n?乙酰半胱氨酸(nac)干预下耳蜗组织形态学及nf?κb和tnf?α表达的变化，以期探讨nac对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用。现将结果 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下。 1 材料与方法 1.1 材料来源 选用耳廓反射灵敏的健康wistar大鼠60只，雌雄不拘，体质量 150,200 g。nac粉剂由北京拜尔迪生物有限公司提供，鼠抗鼠nf?κb及兔抗鼠tnf?α单克隆抗体分别由北京中杉生物有限公司和武汉博士德生物有限公司提供。 1.2 分组及处理 将健康wistar大鼠随机分为正常组、对照组、庆大霉素组、nac干预?1组、nac干预?2组，各12只。对照组腹腔注射生理盐水120 mg/(kg?d),共14 d。庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素120 mg/(kg?d),共14 d; nac干预?1组上述剂量腹腔注射庆大霉素前1 h注射100 g/l的nac 350 mg/(kg?d),共14 d; nac干预?2组注射庆大霉素(同庆大霉素组) 14 d后再腹腔注射nac 3 350 mg/(kg? d), 共14 d。 1.3 听性脑干反应(abr)测试 动物在实验前及用药结束后24 h行abr阈值测定。动物经腹腔注射体积分数0.10的水合氯醛(150 mg/kg)麻醉， 测试采用 nicoletspirit诱发电位仪， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 电极置颅顶硬膜下,参考电极置同侧耳廓,对侧耳廓接地。耳机紧贴刺激耳，声刺激选短音(升降时间各为1 ms),刺激频率为8、4、2、1 khz。带通滤波150,1 500 hz。记录双耳abr之?波反应阈值。 1.4 免疫组织化学染色及观察 停药并测试完abr后迅速处死大鼠，断头后取出听泡，剪开听泡暴露耳蜗，浸入25 g/l的戊二醛固定液中。在解剖显微镜下开放卵圆窗和圆窗,在蜗顶钻孔缓慢注入25 g/l的戊二醛固定液,将标本于4 ?下置于固定液中固定24 h以上,经pbs冲洗后放入edta中进行脱钙，每隔1 d换液1次，约10 d后脱钙完成，按石蜡标本制作程序制作切片，片厚6 μm，行免疫组织化学染色。 组织切片常规脱腊至水，tnf?α组无需热修复，nf?κb组需热修复;常温下正常血清封闭20 min，甩干后加一抗(nf?κb 1?50， tnf?α 1?50)，常温下放置2 h，滴加生物素化二抗液，室温孵育 20 min。苏木精复染，显微镜下观察。 1.5 结果判断 光镜下tnf?α及nf?κb表达阳性的细胞呈棕黄色，阴性对照不着色。 1.6 nf?κb和tnf?α平均灰度值的测定 采用 moticimage advance 图像分析仪，分别测量各组大鼠耳蜗组织不同部位nf?κb和tnf?α平均灰度值。 1.7 统计学分析 实验数据以?s表示,采用spss 11.0及ppms 1.53统计软件进行统计学分析,多个样本均数差异的显著性检验应用方差分析。 2 结果 2.1 abr测试 正常组abr阈值和对照组用药后比较差异无显著性 (p>0.05);用药后庆大霉素组abr阈值与其他组比较差异均有显著性(f=74.77，q=3.28,5.29,p<0.05);nac干预?2组abr阈值与其他组比较差异均有显著意义(q=2.24,3.28,p<0.05)。见表1。表1 各组abr测试结果(略) 2.2 组织学观察 正常组、对照组大鼠耳蜗corti 器毛细胞无损伤，血管纹清晰。庆大霉素组、nac干预?1、2组大鼠耳蜗corti 器毛细胞变形，崩解破坏，散在缺失，螺旋神经节神经元数目减少，血管纹变薄，其中以庆大霉素组损伤最严重;nac干预?1组毛细胞轻微损伤，血管纹尚清晰;nac干预?2组见毛细胞变形、破坏、血管纹变薄。 2.3 各组大鼠耳蜗各部位nf?κb和tnf?α表达 正常组血管纹、螺旋神经节、corti 器nf?κb、tnf?α表达与对照组比较，差异无显著意义(p>0.05);庆大霉素组和nac干预?2组血管纹、螺旋神经节和corti 器nf?κb、tnf?α表达与其他组比较差异均有显著性(f=27.47,48.81，q=1.34,4.31,p<0.05);nac干预?1组与正常组和对照组比较差异无显著性(p>0.05)。见表2、3。表2 各组大鼠耳蜗各部位nf?κb表达灰度值及其比较、 表3 各组大鼠耳蜗各部位tnf?α表达灰度值及其比较(略)。 3 讨论 在长期应用氨基糖甙类抗生素(aman)的治疗过程中,耳毒性发生率可高达80%。aman的耳毒性靶细胞主要是耳蜗和前庭毛细胞,其损伤可引起不可逆的听力丧失和前庭功能障碍。本实验结果显示，庆大霉素组的abr阈值与正常组比较有显著性差异。 nf?κb 主要分布在螺旋韧带的??型纤维细胞和根细胞的胞浆内,螺旋缘的齿状细胞和螺旋器的支持细胞也有一定的表达。wang等4研究结果表明,作为内耳免疫应答主要部位的内淋巴囊及其周围组织是nf?κb 表达的另一重要区域，可以推测螺旋韧带和内淋巴囊是调控内耳炎性反应的主要部位，有助于阐明nf?κb在内耳炎性损伤中的作用。本研究结果显示，正常组、对照组大鼠耳蜗corti 器毛细胞无损伤，血管纹清晰。庆大霉素组、nac干预?1、2组大鼠耳蜗见 corti 器外毛细胞变形，崩解破坏，散在缺失，螺旋神经节神经元数目减少，血管纹变薄，其中以庆大霉素组损伤最严重;nac干预?1组毛细胞轻微损伤，血管纹尚清晰;nac干预?2组见毛细胞变形、破坏、血管纹变薄。这与以往的研究结果基本吻合。提示nac干预可能对庆大霉素引起的耳毒性损伤具有保护作用。本文的研究结果还显示，庆大霉素组tnf?α的表达与其余组比较差异有显著性，提示tnf?α可能参与耳毒后耳蜗组织损伤。 研究表明，nac为抗氧化剂,是还原型谷胱甘肽(gsh)的前体,具有阻断氧自由基介导的许多刺激因子激活nf?κb 的活化过程，从而减轻内耳组织的炎症反应和细胞损伤，改善大鼠的听阈5。usami等5已发现抗氧化剂如谷胱甘肽存在于血管纹、纤维细胞、毛细血管内皮细胞、螺旋韧带及前庭等部位。另外,ohinata等7报道，低蛋白饮食的动物,由于内生性谷胱甘肽水平很低,故对耳毒性药物有更强的敏感性,同时也发现内生性谷胱甘肽可使耳毒性药物敏感性减低。本实验中，用药后abr阈值，庆大霉素组与nac干预1组、nac干预2组比较差异有显著性(p<0.05), nac干预1组与nac干预2组差异有显著性(p<0.05),表明nac能干预庆大霉素引起的听力损害，并且在应用庆大霉素之前预先给予nac，其听力保护效果明显优于在庆大霉素造成耳损伤后给药。nac减轻庆大霉素耳损伤的可能机制为:?nac促进还原型谷胱甘肽(gsh)的合成，与胞内酯类过氧化物反应，从而达到清除酯类过氧化物的目的。此外，gsh 对稳定细胞膜及细胞器膜，稳定细胞内酶和蛋白质的功能具有重要作用;?nac可阻止耳毒性损伤后耳蜗组织中性粒细胞氧自由基的瞬间爆发。同 时，nac可直接作用于过氧化氢(h2o2)生成h2o和o2，还可清除超氧 阴离子、羟自由基8。nac可能通过其细胞保护和抗氧化作用，阻断 导致nf?κb磷酸化的上游信号而抑制nf?κb，从而减轻内耳组织的 炎症反应和细胞损伤9;?nac可直接或者间接地影响胞内ca2+的平 衡，减少ca2+内聚，降低胞内ca2+超载，防止因细胞内钙的上升而 导致的毛细胞凋亡，从而起到保护内耳损伤的作用。 本实验中正常组及对照组 corti 器毛细胞无损伤，血管纹清晰; 药物性损伤各组均可见内外毛细胞变形，corti 器内外毛细胞缺损， 血管纹变薄。nac干预组较相对应的庆大霉素组细胞变形、缺损均减 轻，血管纹厚度略增加。表明nac干预能明显抑制nf?κb和tnf?α 在血管纹、螺旋神经节和corti 器的上调表达，从而对内耳功能起 到保护作用，并且在应用耳毒性药物之前使用nac其效果明显优于耳 毒性损伤之后用药，因此在临床应用中也体现了预防用药的重要性。 【参考文献】 1i keda k, sunose h, takasaka t. effects of free radicals on the intracellular calcium concentration in the isolated outer hair cell of the guinea pig cochlearj. acta otolaryngol, 1993,113:137?141. 2tian y, jiang x j. synergetic protective effects of l 2ng 2n itroarg in ine methylester and leupeptin on damaged cochlear hair cell caused by gentaminj. progress of anatomical sciences, 2006,12(2):109?112. 3周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件ppms 1.5的组成和应 用特点j. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):29?32. 4wang c y, ji c y, wang y n. expressions of il?2, tnf?α mrna in the experimental labyrinthitis of guinea pigj. j preclin med coll shandonguniv, 2005,19(3):142?145. 5staal f j, roederer m, herzenberg l a. intracellular thiols regulate activation of nuclear facto r?kappa b and transcription of human immunodeficiency virusj. proc natl acad sci usa, 1990,87(24):9943?9947. 6usami s, hjelle o p, ottersen o p. differential cellular distribution of glutathione――an endogenous antioxidant in the guinea pig inner earj. brain res, 1996,743(1/2):337?340. 7ohinata y, yamasoba t, schacht j, et al. glutathione limits noise?induced hearing lossj. hear res, 2000,146(1/2):28?34. 8azevedo m a k, lortz s, lenzen s, et al. improvement of the mitochondrial antioxidant defense status prevents cytokine?induced nuclear factor?kappa b activation in insulin?producing cellsj. diabetes, 2003,52:93?101. 9li j, quan n, bray t m. supplementation of n?acetylcysteine normalizes lipopolysaccharide?induced nuclear factor kappa b activation and proinflammatory cytokine production during early rehabilitation of protein malnourished micej. j nutr, 2002,132:3286?3292. 中国论文网