乳汁中结合珠蛋白作为奶牛隐性乳房炎诊断指标的试验

乳汁中结合珠蛋白作为奶牛隐性乳房炎诊断指标的试验 乳汁中结合珠蛋白作为奶牛隐性乳房炎诊 断指标的试验 44中国兽医杂志2010年(第46卷)第】0期 乳汁中结合珠蛋白作为奶牛隐性 乳房炎诊断指标的试验 曹随忠.,杨德英,杨永新.,姚学萍.,余树民.,刘宗平 (1.扬州大学兽医学院,江:扬州225009;2.四川农业入学动物医学院,四川雅安 625014 3.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031) 中图分类号:$859.2'2文献标识码:B文章编号:05296005(2010)10—0044—02 奶牛乳房炎是造成奶牛业经济损失最大的疾病 之一,它不仅影响奶牛产奶量,同时也影响牛奶品 质,危害人类健康,特别是隐性乳房炎影响更加严 重.因此,乳房炎的早期诊断对防治具有重要意义. 自十九世纪六十年代以来,乳汁体细胞数(sonlat— iccellcounts,SCC)广泛作为奶牛乳腺感染的诊断 指标,乳汁体细胞数可以比较精确地反映奶牛乳房 炎症程度,乳房炎症损伤越严重,则乳汁体细胞数越 高口].但是,乳汁体细胞计数需要在实验室操作,而 且仪器昂贵,无法在现场检测. 结合珠蛋白(haptoglobin,HP)是奶牛的一种 主要急性期蛋白(acutephaseprotein,APP),牛乳 中HP含量的变化能特异地反映乳腺炎症程度和评 价乳房炎治疗效果一.乳中的HP主要由肝脏合 成,此外也可由乳头,乳池和乳腺上皮细胞肝外合 成一;在奶牛乳房炎症急件期,血清中的HP含量可 迅速升高l000倍[.医学上,急性期蛋白(APP) 是疾病最重要的生物标记物,血清中APP也广泛用 于动物疾病的诊断及预后判断一. HP作为奶牛隐性乳房炎诊断指标的试验研究 国内外均有相关报道,但是目前国内外学者对临床 上患乳房炎奶牛乳汁中HP含量的检测和判定隐性 乳房炎的HP含量阈值的相关研究鲜见报道.本试 验通过分析健康奶牛和隐性乳房炎奶牛乳汁中HP 含量变化及其与SCC的相关性,进而探讨HP含量 用于诊断奶牛隐性乳房炎的有效阂值及评价HP能 否作为诊断隐性乳房炎的敏感指标. 1材料与方法 1.1乳样采集在四川新希望乳业示范奶牛场内 选择150头年龄和泌乳期相近,乳汁和乳房均无肉 眼可见临床变化的荷斯坦奶牛.早,中,晚挤奶时分 别采集乳汁lOmI,冰盒存放带回实验室,将3次采 收稿日期:2OlO—O2O4 基金项目:中国博士后科学基金(20090451250);扬州大学l尊土 后基金(2008);四川省教育厅青年基金项kl(09ZB054) 集的乳样混合后分成2份:1份全乳进行体细胞数 测定;另1份全乳4000r/min离心15min分离乳 清,一7O?冰箱保存,用于HP含量测定. 1.2乳汁体细胞数(SCC)测定全乳42?水浴15 rain,采用Fossmatic5000体细胞计数仪(FOSS公 司,丹麦)测定乳汁体细胞数. 1.3乳汁HP含量的测定HP含量采用双抗夹 心ELISA法(结合珠蛋白定量EIISA试剂盒,美国 ADL公司),Varioskan酶标仪(Thermo公司,美 国)450nm比色测定()D值,根据标准曲线求出HP 含量,最低检出限为3ng/mI. 1.4数据统计与处理根据乳汁体细胞数将150 份乳样分成5组(表1),SCC均用lgSCC表示.应 用Excel2003软件整理数据和相关性分析,应用 SPSS13.0软件对各组间平均数进行多重比较,结 果表示为X?SD.采用百分位数法选择HP的不 同含量阂值,应用A2×2矩阵分析HP诊断奶牛隐 性乳房炎的敏感性(sensitivity,SEN),特异性(spe cificity,SPE),阳性预测值(positivepredictiveVal— tie,PPV),阴性预测值(negativepredictivevaltie, NPV)和Jouden指数(ioudenindex)E8-9]. 2结果 2.1奶牛乳汁中HP含量及其与SCC(1gSCC)的 相关性检测结果(表1)示,当SCC<1O×10 mI..时(I组)未检测到HP,而在SCC>10×10 mI.的各组奶牛乳汁中HP含量变化差异显着 (P<0.05),其中V组HP含量是?组的l6.82倍, 表明HP含量在不同体细胞组问变化敏感.牛乳中 HP含量与体细胞数呈着正相关(r一0.909, PdO.05)(图1). 2.2乳汁急性期蛋白HP作为奶牛隐性乳房炎诊 断指标的分析选择HP含量>20ng/mL,>40 ng/mI,>90ng/mI>11ng/mL,>150ng/mL 和>2OOng/mI等6个有效阈值,分别分析诊断奶 牛乳房炎的SEN,SPE,PPV,NPV和Jouden指数. 结果(表2)显示,随着蛋白含量阈值的提高,HP诊 ChineseJournalofVeterinaryMedicine中园兽医杂志2010年(第46卷)第1O期45 注:I司行巾不同小写字母表示差异着(P<O.05) 1400 —1200 皇1000 800 血8600 托400 Z200 0 5.O06.O07.O08.O0 sccOgsco 图l牛乳中HP含量与SCC(1gSCC)的相关性 断奶牛乳房炎的敏感性(SEN)降低,而特异性 (SPE)和阳性预测值(PPV)升高;体现诊断价值的 Jouden指数(0.70)在HP含量阈值>110ng/mL 时最高,SEN和SPE分别是72.4和95.2,对应 的PPV是94.7,即该阈值HP含量用于诊断奶 牛乳房炎的价值最高. 3讨论 急性期蛋白(APP)是一种非特异的先天免疫成 分,APP可杀死感染病原微生物,修复受损组织和 保持机体健康状态,因此APP的含量变化可反映动 表2不同HP含量阈值诊断奶牛隐性乳房炎的敏感性,特异性,阳性预测值,阴性预 测值和Jouden指数 敏感性SEN(,/.) 特异性SPE() 阳性预测值PPV() 阴性预测值NPV() Joudcn指数 物健康状态和监控疾病的恢复情况[4.乳汁中 APP能提供乳区炎症阶段的特异信息],在奶牛乳腺感染早期,急性期蛋白可作为炎症的敏感指 t一'…1]杯... 牛乳中的HP不仅来源于肝脏,也可由乳头,乳 池和乳腺上皮细胞肝外合成].HsiangLI等] 通过RTPCR证明,在奶牛乳汁中SCC>50×10 个/m1时,体细胞中HPmRNA有较高表达;通过 Westernblot,免疫细胞化学,免疫荧光共聚焦和 HP释放试验证明,巾性粒细胞与乳巾HP的合成 和释放相关,并指出在体和离体培养的乳房炎乳腺 }二皮细胞巾HP含量显着升高(P<0.05),表明巾 性粒细胞和乳腺上皮细胞对HP含量的升高发挥重 要作用,即HP还来源于乳腺组织和乳腺内循环. KovacG等学者[研究表明,乳汁巾HP含量与 SCC显着相关,指f?HP不仅可作为奶牛乳房炎的 诊断指标,而且通过检测乳巾的HP含量的变化可 判断乳品质是否发生改变. 本试验结果示,乳巾HP含量与SCC(1g— SCC)呈着正相关(r===0.909,P<0.05).当乳 汁中SCC<10×10mL时HP含量低于检…限, 而SCC>10×10mI.时各组问HP含量差异显着 (P%0.05),其中SCC>1O0×10mI乳汁rrIHP 含量是10×10,25×10mL时的16.82倍,表明 HP含量在不同体细胞组间变化敏感.上述结果与 国内外学者的研究结果一致"].选择HP含量 >110ng/mI作为诊断乳房炎的阈值:Jouden指数 0.70,敏感性72.4,特异性95.2,阳性预测值 94.7,阴性预测值76.9,表明HP可作为诊断 奶牛隐性乳房炎的指标.但是,急性期蛋白的测定 存在费用高的缺陷,如何将HP的测定用于自动挤 奶系统中并降低检测成本,还有待进一步研究. 参考文献: 一 一?,一一一,,一,一一一一,,一一cKw盹Kn ,一一一一一一一一一一一一一,一 46中国兽医杂志2()l0年(第16卷)第l0其uChineseJournalofVeterinaryMedicine 母猪群发性晚产死胎病因分析 周玉龙,石忠鹏,耿晶,陈永松,吕其林,刘辉,张晓磊,吴凌,朴范泽 (1.黑龙汀7\-?农大学动物科技学院,黑龙江大庆163319; 2.黑龙江省嫩汀县九i分局山河农场兽医院,黑龙嫩.『[161421) ? 中图分类号:$857.22文献标识码:B文章编号:05296005(2010)10-0046—02 黑龙江省肇东市某猪场存栏生产母猪50头,于 2009年l0月,同期生产的15头母猪均出现产期滞 后2,3d,产死胎.母猪未见任何异常症状,而且死 亡的胎儿也未见木乃伊化以及畸形等病理变化,但 是剖检时发现流产胎儿心脏,脾脏,肾脏和膀胱黏膜 等器官有散在的出血点.为了确诊该猪群暴发流产 的病因,我们进行了常规的细菌学检验,而且应用 PeR方法对常见的能够引起母猪发生流产的猪瘟 病毒(CSFV),呼吸与繁殖障碍综合征病毒 (PRRSV),伪狂犬病病毒(PRV)和细小病毒(PPV) 进行了检测,结果确诊猪瘟病毒是引起本次发病的 主要原因,关于繁殖障碍型猪瘟引起猪群发生全部 以晚产为特征的病例报道极少,因此本研究对猪瘟 的临床诊断具有重要的借鉴意义,我们将有关试验 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下. 1材料 1.1主要试剂与培养基Trizol(Invitrogen), AMV反转录酶和(『DNA聚合酶(MBI),RNase Inhibitor,dNTP和DI,2000Marker(TaKaRa). 按常规方法制备l巾1'液营养琼脂培养基..]. 表1CSFV,PRRSV,PPV和PRV的PCR检测引物 1.2引物参照已有的研究报道合成特异性的 [6] [7] [9] [1O] 收稿日期:2010-0324 通讯作者:吴凌,E—mail:wuling8@l63.corn EckersallPD.Thetimeisrightforaetlt(,phaseproteinassays EJ.3.VeterinaryJournal,200,t,l68(1):3. 李强.如何止确开展临床诊断性研究医学沦义中渗断试验的 常见方法学错误J].巾同全科医学,2006,9(8):691692. 李强.如何开展诊断性研究?.界华人消化杂志.2000,8 (7):803—805. GronlundU,IIultenC,EekersallID.eta/.1Iaploglohinand seruYi]amyloidAinmilkandSt~rtll"I1duringacuIeandchronlc experimentallyinducedStaphyIoc{)CCUSaurezsmastilisLJ?.J DairyRes,2003.70(4):379386. JacohsenS,AndersenIH.Foelhoel1T."/.T)()sedepend encyandindividualvariabililyoftheHp.pf)lysac('harideinduced bovineaculephaseproteinrcs}jonc』J:.JI)airySci,2004,87 (10):33303339. [1]]()htsukaH,KudoK,MoriK CSFV,PRRSV,PPV和PRV寡核苷酸引物,由上 海生丁生物程技术服务有限公司合成. 1.3病料无菌采取发病母猪新流产的胎儿肝脏, 脾脏,肺脏和淋巴结,置一70~C备用. naturallyoccurringcoliformmastitis[J~.JVetMedSci,2001, 63(6):675678. 12]tlsiang1I,TsuoJH,I』uYI,eta1.Neutrophilsasone0f themajorhaptoglobinsourcesinmastitisaffectedmilk[J]. VetRes,2009,4()(3).1728. 】3j [14] 15] KovacG,PopelkovaM.TkacikovaI,el".InterreldtionshIp betweensonlaliccellcountandacutephaseproteininserurl! andmilkofdairyeows[J1.AetaVe*Brno,2007,76(1):5卜 57. AkerstedtM,WallerKP.SternesjOA.Haptoglobinandser— un1amyloidAinrelationtOthesomaticcellcountinquarter. COWcompositeandhulktankmilksamples[J].JDairyRes, 2007,74(2):198203, 出英,李庆章.奶lIJ羊隐性乳房炎模的建立及早期诊断指 标的研究J].巾囤预防兽医.2008,30(4):305—308.