蟾酥缓释注射液的制备及其局部麻醉作用研究

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月 ·891· 蟾酥缓释注射液的制备及其局部麻醉作用研究 吴帅成，宋 舟，张 翠，秦倩倩，付本懂，申海清，韦旭斌* 吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062 摘 要：目的 以泊洛沙姆 407 作为载体材料制备蟾酥缓释注射液，并评价其在体内局部麻醉作用效果。方法 采用冷溶法 制备蟾酥缓释注射液，以胶凝温度为指标筛选蟾酥缓释注射液最佳处方，采用豚鼠皮丘模型比较蟾酥缓释注射液和蟾酥溶液 局部麻醉作用时间。结果 蟾酥缓释注射液的最佳处方是泊洛沙姆 407 15.5%、乙醇 10%、蟾酥提取物 0.5%，胶凝温度在 33 ℃，体内局部麻醉作用时间可达 6～7 h，而蟾酥溶液麻醉作用时间仅为 2～3 h。结论 蟾酥缓释注射液是一种长效制剂。 关键词：蟾酥缓释注射液；泊洛沙姆 407；局部麻醉；冷溶法；豚鼠皮丘模型；缓释 中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)05 - 0891 - 04 Preparation of sustained-release injection of Venenum Bufonis and its local anesthetic activity WU Shuai-cheng, SONG Zhou, ZHANG Cui, QIN Qian-qian, FU Ben-dong, SHEN Hai-qing, WEI Xu-bin College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China Abstract: Objective To prepare the sustained-release injection of Venenum Bufonis using Poloxamer 407 as the carrier material and evaluate its local anesthetic activity in vivo. Methods The sustained-release injection of Venenum Bufonis was prepared through cold-dissolving and the optimal prescription was screened by determining gelation temperature. With the guinea-pig cutaneous wheal model, the local anesthetic time of the sustained-release injection was compared with the solution of Venenum Bufonis. Results The optimal prescription was composed of 15.5% Poloxamer 407, 10% alcohol, and 0.5% Venenum Bufonis extracts at the gelation temperature of 33 ℃. In vivo study, the local anesthetic effect of the sustained-release injection of Venenum Dufonis lasted for 6—7 h whereas the solution of Venenum Bufonis only lasted for 2—3 h. Conclusion The sustained-release injection of Venenum Bufonis is proved to be a prolonged action preparation. Key words: sustained-release injection of Venenum Bufonis; Poloxamer 407; local anaesthesia; cold-dissolving method; guinea-pig cutaneous wheal model; sustained-release 蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍 Bufo bufo gargarizans Cantor 或黑眶蟾蜍 B. melanostictus Schneider 的耳后腺及皮肤所分泌的白色浆液，经收 集加工而成的干燥品，具有解毒消肿、止痛开窍之 功效。药理学实验研究证明，蟾酥具有局部麻醉、 抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[1-2]，临床证实其对关 节炎、癌症疼痛等疗效显著，但因关节炎和癌症疼 痛为慢性疼痛，需要多次注射给药，病人依从性差。 为了提高治疗效果和病人顺从性，有必要研究蟾酥 提取物的长效缓释制剂。温度敏感原位凝胶是一种 新型的药物传递系统，在给药前为液态，注射后可 填充于组织间隙，并迅速变成半固体凝胶，具有制 备简单、使用方便和控制释药性能好等优点，是目 前药剂学领域的热点。其中泊洛沙姆 407 是一种非 离子表面活性剂，具有表面活性而无免疫原性，低 毒，易代谢，是抗生素、麻醉药、抗炎药、抗肿瘤 和蛋白质大分子多肽类药物的理想控缓释载体，也 是目前研究最深入的制备温度敏感原位凝胶的高分 子辅料[3]。本研究采用泊洛沙姆 407 为载体制备蟾 酥缓释注射液，并采用豚鼠皮丘模型研究蟾酥缓释 注射液作用效果，为进一步开发蟾酥穴位缓释注射 剂提供理论依据。 收稿日期：2011-10-06 作者简介：吴帅成（1986—），男，山东聊城人，硕士生，从事中兽药新型制剂的研究。E-mail: wushuaicheng10@163.com *通讯作者 韦旭斌 E-mail: weixub@163.com 网络出版时间：2012-04-09 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120409.0859.004.html 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月 ·892· 1 仪器与材料 85—2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）， DL2120A 型超声波清洗器（上海之信仪器有限公 司），BSA124S 型电子分析天平（德国 Sartorius 公 司），LSC—218C 型陈列柜（中国星星集团有限 公司）。 豚鼠，雄雌各半，250～300 g，购于吉林大学 实验动物中心，许可证号 SCAK-（吉）2003-0001。 蟾酥提取物（自制，经 95%乙醇连续 3 次冷浸 提取 48 h 后干燥制得，其主要成分为蟾毒灵 7.1%、 华蟾酥毒基 9.13%、酯蟾毒配基 11.7%）；泊洛沙姆 407（批号 20100201）购于 BASF 公司；乙醇（批 号 20100311）为 95%医用酒精，购于天津市八一制 药厂；水为注射用水，购于吉林大学五星药厂；其 他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 蟾酥缓释注射液的制备 2.1.1 基质的筛选 泊洛沙姆 407 具有受热反向胶 凝的性质，在较低温度时为澄清溶液，黏度小，具 有良好的流动性，可方便注射；但升高到一定温度 后，黏度可迅速增加，流动性迅速降低，很快转变 成半固体透明凝胶，从而发挥缓释作用。因此确定 以泊洛沙姆 407 为基质。 2.1.2 胶凝温度的测定 参照文献方法[4]，在西林 瓶中放入待测溶液和磁力搅拌子，插入温度计。将 西林瓶放入冰水浴中，开启电磁搅拌器，使水浴温 度持续缓慢升高。磁力搅拌子完全停止转动的温度 即为胶凝温度，平行测定 3 次，取平均值。 2.1.3 处方设计 （1）助溶剂的选择：乙醇有助于蟾酥提取物的 溶解，提高注射液澄明度，而乙醇体积分数超过 10% 时，肌肉注射有疼痛感。因此确定乙醇的体积分数 为 10%，作为助溶剂。 （2）药物质量分数的确定：采用冷溶法[5]，以 注射用水为介质，加入泊洛沙姆 407 15%和乙醇 10%，加入不同量的蟾酥提取物，搅拌使其分散均 匀，置于 4 ℃冰箱中保存直至完全溶解，经 0.22 μm 滤膜滤过除菌，从而得到药物质量分数分别为 0.1%、0.5%、1.0%的含药凝胶，放置于 4 ℃冰箱保 存 7 d，观察凝胶性状，结果见表 1。1.0%含药凝胶 在 4 ℃保存 7 d 后，凝胶中有药物析出，而 0.1%、 0.5%含药凝胶未见药物析出，凝胶性状良好。此外， 注射剂高载药量，有助于减少给药剂量，提高患者 表 1 药物质量分数对凝胶形状的影响 Table 1 Effect of drug contents on gel properties 药物质量分数 色泽 澄明度 不溶性颗粒 0.1% 浅黄 澄清 未见 0.5% 淡黄 澄清 未见 1.0% 深黄 浑浊 可见 顺应性。因此确定药物质量分数为 0.5%。 （3）处方各成分对温度敏感凝胶温度的影响： 采用冷溶法[5]，以注射用水为介质，加入不同量的 泊洛沙姆搅拌使其分散均匀，置于 4 ℃冰箱中保存 直至完全溶解，经 0.22 μm 滤膜滤过除菌，从而得 到不同质量浓度泊洛沙姆 407 的空白凝胶。在凝胶 处方中，加入 10%乙醇，或再加入 0.5%药物后，即 可得到含有 10%乙醇的空白凝胶或含药凝胶。按 “2.1.2”项的方法，测定空白凝胶以及含有 10%乙 醇的空白凝胶和含药凝胶的胶凝温度，结果见表 2。空白凝胶的胶凝温度随着泊洛沙姆 407 质量分 数的升高，胶凝温度逐渐降低。处方中加入 10% 乙醇后，胶凝温度明显升高，而再加入 0.5%药物 后，胶凝温度有所降低，但对温度敏感凝胶的整体 变化趋势不变。 表 2 处方各成分对温度敏感凝胶胶凝温度的影响 (n＝3) Table 2 Effects of each composition in prescription on gelation temperature of thermosensitive gel (n＝3) 凝胶种类 胶凝温度 / ℃ 泊洛沙姆 407 15% 35.7±0.4 16% 28.4±0.2 17% 21.5±0.3 乙醇 10%＋泊洛沙姆 407 15% 37.2.±0.2 16% 29.4±0.3 17% 22.7±0.2 药物 0.5%＋乙醇 10%＋泊洛沙姆 407 15% 36.6±0.3 16% 29.2±0.4 17% 22.8±0.3 （4）泊洛沙姆 407 质量分数的确定：采用冷溶 法[5]，以注射用水为介质，加入 10%乙醇和 0.5%蟾 酥提取物，分别加入不同质量分数的泊洛沙姆 407， 搅拌使其分散均匀，置于 4 ℃冰箱中保存直至完全 溶解，经 0.22 μm 滤膜滤过除菌，从而得到不同质 量浓度泊洛沙姆 407 的含药凝胶，测定其胶凝温度。 结果表明，蟾酥缓释注射液的胶凝温度具有泊洛沙 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月 ·893· 姆 407 质量浓度依赖性，随着泊洛沙姆 407 质量浓 度增加，胶凝温度下降。泊洛沙姆 407 质量分数为 15%、16%、17%、18%，在 37 ℃条件下能形成凝 胶。适宜的胶凝温度对于温度敏感制剂的应用具有 很重要的意义。调节胶凝温度要从使用方便和载体 胶凝能力综合考虑。一方面温敏凝胶制剂在体外必 须具有良好的流动性，可以方便注射；另一方面温 度敏感凝胶要在体温作用下可以迅速形成凝胶，胶 凝温度一定要低于体温，但是若胶凝温度过低，则 注射不便，另外低温对组织会产生刺激，造成顺应 性不佳。鉴于人体正常温度在 36～37 ℃，理想的 胶凝温度在 33 ℃左右，因此蟾酥缓释注射液的泊 洛沙姆 407 质量分数在 15%～16%，见表 3。 表 3 泊洛沙姆 407 质量分数对胶凝温度的影响 Table 3 Effect of Poloxamer 407 contents on gelation temperature 泊洛沙姆 407 胶凝温度 / ℃ 泊洛沙姆 407 胶凝温度 / ℃ 15% 36.8±0.3 17% 27.0±0.3 16% 29.1±0.4 18% 22.6±0.2 （5）蟾酥缓释注射液处方的优化：以注射用水 为介质，加入乙醇和蟾酥提取物，分别加入不同质 量分数泊洛沙姆 407，搅拌使其分散均匀，置于 4 ℃ 冰箱中保存直至完全溶解，从而得到泊洛沙姆 407 质量浓度分别为 15.00%、15.25%、15.50%、15.75%、 16.00%，10%乙醇，0.5%药物的含药凝胶液，测定 其胶凝温度，结果见表 4。泊洛沙姆 407 质量分数 在 15.5%时，胶凝温度为 33 ℃。因此蟾酥缓释注 射液的最终处方确定为 15.5%泊洛沙姆 407、10%乙 醇、0.5%蟾酥提取物。 表 4 蟾酥缓释注射液处方的优化 Table 4 Prescription optimization of sustained-release injection of Venenum Bufonis 泊洛沙姆 407 胶凝温度 / ℃ 泊洛沙姆 407 胶凝温度 / ℃ 15.00% 36.7±0.3 15.75% 30.6±0.3 15.25% 34.5±0.4 16.00% 29.1±0.2 15.50% 33.1±0.3 2.2 体内局部麻醉作用研究 取体质量 250～300 g 的健康豚鼠 10 只，雄雌 各半。在每只豚鼠背部选择两个皮丘点，分别注射 蟾酥缓释注射液和蟾酥溶液（为 0.5%蟾酥提取物、 10%乙醇、10%泊洛沙姆 407 的溶液）0.1 mL，标 记皮丘大小。用自制的测试针按左、中、右、上、 中、下顺序刺激 6 次皮丘范围内皮肤，两下针刺时 间间隔 3～5 s，皮肤出现收缩反应为阳性， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 注 药后 10、20、30、60、120、180、240、300、360、 420、480 min 的阳性反应次数，当 6 下针刺中有 3 次产生反应，可得出麻醉时间[6-7]。记录每种药物 10 个皮丘在各时间点的阳性反应次数，将其作为纵 坐标，以时间为横坐标，绘制效应-时间曲线，结果 见图 1。蟾酥缓释注射液组和蟾酥注射液组均在 10 min 内起效，蟾酥溶液对照组局部麻醉持续时间 2～ 3 h，而蟾酥缓释注射液组局部麻醉持续时间可达 6～7 h，作用时间明显高于蟾酥溶液对照组。 图 1 蟾酥缓释注射液和蟾酥溶液局部麻醉作用 效应-时间曲线 (n＝10) Fig. 1 Effect-time curves of local anesthetic effects by sustained-release injection of Venenum Bufonis and solution of Venenum Bufonis (n＝10) 3 讨论 本实验研究筛选了蟾酥缓释注射液最佳处方， 其中制剂组成成分泊洛沙姆 407 是一种非离子表面 活性剂，具有载药量大、毒性低、易代谢、生物相 容性好的特点，已广泛应用于药学的各个领域。泊 洛沙姆407是由聚氧乙烯与聚丙乙烯以7∶3的比例 构成的 ABA 嵌合聚合物，其水溶液具有特殊的反 向热胶凝作用，即低温时为液体，在体温下可以成 为半固体凝胶，是目前研究最深入的制备温度敏感 原位凝胶的高分子辅料。温度敏感型原位凝胶是一 种新型制剂，目前尚无一套规范的检测指标和方法。 根据其自身的特点、物理化学性质和文献报道的情 况，目前常用制剂评价指标有胶凝温度、凝胶强度、 生物黏附力、流变学性质、体外释放度等[8-9]，本实 验采用胶凝温度为主要评价指标来筛选蟾酥缓释注 射液的最佳处方。本研究中发现，蟾酥缓释注射液 的胶凝温度与泊洛沙姆 407 的质量分数存在依赖 性，随着泊洛沙姆 407 质量分数越高，蟾酥缓释注 射液胶凝温度越低，这与 Kojarunchitt、Ricci 等[10-11] 6 3 0 阳 性 反 应 次 数 蟾酥缓释注射液 蟾酥溶液 10 20 30 60 120 180 240 300 360 420 480 t / min 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 5 期 2012 年 5 月 ·894· 的研究报道相一致。本实验最终确定了蟾酥缓释注 射液的最佳处方为 15.5%泊洛沙姆 407、10%乙醇、 0.5%蟾酥提取物，胶凝温度在 33 ℃左右，在室温 下具有良好的流动性，黏度小，可以方便注射；在 37 ℃以上可迅速形成半固体凝胶，发挥缓释作用。 蟾酥缓释注射液是注射式温度敏感凝胶制剂， 观察蟾酥的局部麻醉起效时间及作用时间，需要选 择合适的研究模型。蟾酥缓释注射液的主要有效成 分为蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等，现代药 理学证明蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基都具有 局部麻醉的作用[1, 12]。蟾酥缓释注射液作为局部麻 醉药，能在用药局部可逆性的阻断感觉神经冲动发 生与传递，引起局部组织痛觉消失，其作用局限给 药部位并随药物从给药部位扩散而迅速消失。热板 法、甩尾、压尾、足趾刺激等躯体镇痛模型[7, 13]常 用于筛选镇痛药，或要求药物口服、腹腔注射或在 刺激部位外用给药，不符合注射式温度敏感凝胶制 剂给药特点，或不适用于研究局部麻醉药在给药部 位的镇痛作用效果的研究，或不能用于进行时效分 析，因此本实验不能采用热板法、甩尾法等躯体镇 痛模型来研究蟾酥缓释注射液的局部麻醉起效时间 和作用时间。豚鼠皮丘法，在豚鼠背部皮内注射给 药形成皮丘，用针头按左、中、右、上、中、下顺 序刺激 6 次皮丘范围内皮肤，以皮肤点出现收缩为 痛感指标，考察药物作用效果，可进行时效分析， 是研究局部麻醉药的经典方法[7, 13]，同时也符合注 射式温度敏感凝胶制剂给药特点。 本研究采用豚鼠皮丘法，在每只豚鼠背部相近 位置选择两个皮丘点，分别注射蟾酥缓释注射液和 蟾酥溶液 0.1 mL，以皮丘点针刺反应为指标，对比 其局部麻醉作用效果，一方面可以在同一只动物研 究两种制剂局麻作用时间，另一方面可以考察药物 在注射位置的滞留时间。结果可知，蟾酥缓释注射 液组与蟾酥溶液组对比，局部麻醉维持时间明显延 长，表明蟾酥缓释注射液释药缓慢，药物可在注射 部位长期滞留，这与 Barichello 等[14]、Liu 等[15]的 研究报道相符。体内实验研究证明蟾酥缓释注射液 是一种长效缓释制剂，药物可以在注射部位长期滞 留，可用于局部-穴位给药，然而其注入穴位的疗效 和机制以及药物代谢规律需要进一步研究。 参考文献 [1] 赵 强, 孟凡静, 刘安西. 蟾酥的研究进展 [J]. 中草 药, 2004, 35(10): 4-7. 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