人牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞生物学活性的实验研究

人牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞生物学活性的实验研究 河北医科大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 人牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞生物学活性的实验研究 姓名:王琨 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:许彦枝 20070301 中文摘要 人牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞生物学活性 的实验研究 摘 要 目的:牙周组织包括牙龈、牙周膜及矿化组织牙骨质和牙槽骨，主要作用是支持稳固牙齿。由于其组成的多样性，使牙周组织愈合比一般的软组织愈合更为复杂。成纤维细胞是牙龈结缔组织和牙周膜的主要细胞类型，在牙周组织的形成与再生、完整性的维持及功能的实施中起重要作用。有研究认为牙周膜细胞(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,,，,,,,,)和牙龈成纤维细胞(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)虽然在光镜下与扫描电镜下观察其在形态上没有区别，但在功能上具有明显的差异:牙龈成纤维细胞主要与牙龈组织的自身稳定有关，而牙周膜细胞除维持自身的稳定外，还可分化成成骨细胞和成牙骨质细胞参与邻近牙槽骨和牙骨质的改建及修复再生。目前尚缺乏明确的区别牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的细胞标志物。 牙周病是人类常见病、多发病，发病率高达,,,以上。患病后常导致牙周组织结构破坏。牙周附着丧失、牙周袋形成、牙齿松动甚至脱落，是导致成年人失牙的主要原因。牙周病手术治疗后，牙周组织的愈合趋向于牙周各种细胞成分的竞争性生长，只有牙周膜细胞首先占据牙根面，才能形成真正意义的牙周组织再生:将体外培养的牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞植入动物体内，发现牙龈成纤维细胞不能形成新的牙周再生所需的各种组织，多为纤维性愈合，而牙周膜细 中文摘要 胞则可形成再生性愈合。 本实验采用体外原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维 细胞，四唑盐比色法(,,,)比较二者的增殖特性、检测碱 性磷酸酶(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)活性，免疫组化染色 法对比两种细胞对于，、?型胶原、骨形成蛋白(,,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,，,,,)的表达情况，流式细胞术(,,,, ;,,,,,,,,，,,,)比较两种细胞中,,,水平的表达。为深入 研究牙周组织中各种细胞的生物学特性、进一步找出牙龈成 纤维细胞和牙周膜细胞的鉴别标志提供理论基础，并为今后 改良两种细胞使其成为牙周组织工程的理想种子细胞奠定 基础。 方法:采用组织块法分离培养牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞，测定二者的增殖特性和,,,活性。利用免疫组化和,,,方法比较，、?型胶原、,,,的表达情况，以观察对 比两种细胞的生物学特性的异同。,原代培养及传代 体外人牙周膜细胞原代培养:取临床上,,岁左右因正畸需要拔除的健康前磨牙，刮取牙根中,,,的牙周膜组织，利用组织块法培养牙周膜细胞，当细胞生长至铺满瓶底,,,时进行传代。取第二代细胞爬片，鉴定细胞来源。 体外人牙龈成纤维细胞原代培养:取同一个体同一部位的龈乳头组织，按上述相同方法进行牙龈成纤维细胞培养。,增殖活性的比较 取第四代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，以,×,,,,,,的细胞浓度接种于,个,,孔培养板，,,,,,,,(,,,,,;;,?,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,)培养基共培养, ,，分别于第,、,、, 中文摘要,，各取出一个,,孔板，,,,法于酶标仪上,,, ,,波长读取,值。, ,,,活性比较 取第五代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，以,×,,,,,,的细胞浓度接种于,,孔培养板，,,,,,,,培养基共培养, ,，弃孔内液体，加入,,,,,, ,,,,,，,”,过夜，进行如下实验:取上述各孔液体及空白对照的蒸馏水一并转入另一,,孔板。按,,,试剂盒说明 依次按比例加入缓冲液、基质液，水浴，加入显色剂后在酶标仪上于,,, ,,,波长下测得,,值，间接反映细胞,,,活性。,免疫组化染色 取第五、六代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，以, ,,,,,,,的细胞浓度接种于放有,×,;,,大小盖玻片的,,孔培养板中，加入,,,,,,,培养基培养一周，,,,乙醇固定后进行免疫组化染色，光学显微镜下观察。 结果判定:细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性。以染色强度为判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，分为四级:无棕色颗粒记为(一);仅有少量、细小、散在的棕色颗粒，着色较浅，记为(，);棕色颗粒聚集成大颗粒记为(，，);颗粒密集成团片状，着色深棕，记为(，，，)。,流式细胞学检测 取第六代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞，经胰蛋白酶消化吹散，计数细胞量达, , ,,,个以上，离心收集细胞，,(,,,,?,液洗两次，,,,乙醇固定同时吹散成单细胞悬液，上机进行,,,检测。 结果 中文摘要 ,人牙周膜细胞原代培养成功率为,,,，牙龈成纤维细胞的 原代培养成功率为,,,,，倒置相差显微镜下观察，,—,, ,有细胞从组织块周围游出，放射状排列，,, ,细胞长满培养瓶底，原代及传代培养的牙龈与牙周膜细胞在相差显微镜下形态相似，均为梭形，有,,,个胞浆突起，胞核呈圆形或椭圆形，核仁明显。经免疫组化鉴定波形蛋白阳性，细胞角蛋白阴性，符合成纤维样细胞的特征。,加入,,, , ,后，各孔内均有紫黑色结晶形成，经酶标仪于,,, ,,处读数，结果显示牙龈成纤维细胞的,值明显高于牙周膜细胞，,,,(,,。, ,,,检测结果显示，牙周膜细胞,,,的,,值高于牙龈成纤维细胞，,,,(,,。,免疫组化染色:以阴性对照为参照，牙周膜细胞中，型胶原染色均为阳性，(，，),(，，，)，胞浆中充满棕黄色大颗粒，核膜周围染? 仙睿 丽赋上宋 赴 ǎ 旧 先酰 帕,感。 粕 :笮徒涸 娜旧 峁 乐苣は赴 粜裕 ǎ ǎ 丽赋上宋 赴 蜃派 系 ǎ ,拢停性谘乐苣は赴 猩钭厣 帕,芗 赏牌 矗 ǎ 丽赋上宋 赴 派 系 ǎ ,盗魇较赴 Ъ觳猓貉乐苣は赴 校拢停械挠 馇慷戎蹈哂谘丽赋上宋 赴 校迹埃 埃薄?结论,与牙周膜细胞相比，牙龈成纤维细胞取材容易，原代培养成功率高，细胞增殖活性强，进一步研究后可作为牙周组织工程的种子细胞大量使用。,免疫组化染色显示，，、?型胶原在体外培养的牙周膜细 中文摘要胞和牙龈成纤维细胞中的表达不同，牙周膜细胞表达均为中到强阳性，而牙龈成纤维细胞中为弱阳性，表明两种细胞在胶原基质合成方面存在差异。，、?型胶原可作为鉴别两种细胞的标志物。,牙周膜细胞表达的,岫活性高于牙龈成纤维细胞，免疫组化染色及,,,检测均显示牙周膜细胞的,,,表达高于牙龈成纤维细胞，,,,与,,,可作为鉴别两种细胞的标志;同时提示牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞相比，具有较强的成骨能力，是理想的牙周组织工程的种子细胞。 关键词:牙周膜细胞;牙龈成纤维细胞;增殖;,,,:,,中 英文摘要 ,,,,, ,, ,,,,,,,;,, ,;,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,,:,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ;,,,,,,, ,, ,,,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,,, ,,, ,,, ;,,,,,,,,;, ,, ,, ,,,,,,, ,,,,,(,,,, ,,,, ,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,?,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, , ,,,, ;,,,,,, ,,,;,,, ,,,, ,,,,,,, ,,?,， ,,,,,, ,,,,,,,(,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ;,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ;,,,,;,,,, ,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,?,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,，,,,;,,,, ,,, ,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,(,,,—,,,【,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,, ,, ;,,,, ;,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,?;,,?—,,,,, ,,, ,;,,,,,, ,,,;,,,, ,,;,,,;,,,，,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ;,, ,,,,,,, ,,,;, ,,,, ,,,,,,,,,;,,,, ,,, ,,;,,,,,,,;(、硼,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ;,,,,;,,,, ,,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,, ,,,, ,,,;,,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,,;,,,,, ,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,;, ,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, 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舌 成纤维细胞是人牙龈结缔组织和牙周膜中的主要细胞类型，在牙齿的发究 刖 育、牙周组织生理、病理改变及牙周组织再生等方面具有重要作用。目前研究认为牙龈成纤维细胞(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)和牙周膜细胞(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,,，,,,,,)虽然在光镜下与扫描电镜下观察形态上没有区别，但在功能上具有明显的差异，牙龈成纤维细胞主要与牙龈组织的自身稳定有关，而牙周膜细胞除维持自身的稳定外，还可分化成成骨细胞和成牙骨质细胞参与邻近牙槽骨和牙骨质的重建及修复再生。 牙周病治疗的晟终目的是牙周组织的再生和形成牙周新附着，而牙周组织再生修复的首要基础是要有一定数量的健康的牙周膜细胞。大部分牙周病晚期病例无法获得理想的牙周组织再生，其主要原因之一就是牙周病损部位参与牙周组织再生细胞的数量和来源不足。牙周膜细胞是具有一定程度成骨特征的成纤维细胞，该细胞在诱导培养条件下具有矿化能力，可形成矿化的细胞外基质，然而它来源有限，难以在临床上广泛开展:牙龈成纤维细胞来源丰富，具有很强的生长和自我繁殖能力，但目前的多数研究认为它不能形成牙周组织再生所需的各种硬组织。本实验采用组织块法原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞，四唑盐比色法(,,,)检测两种细胞的增殖活性，比较二者碱性磷酸酶(,,,,,,,, 研究论文,,,,,,,,,,,(,,,)活性的表达，免疫组化染色法对比两种细胞对，、?型胶原、骨形成蛋白(,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,，,,,)的表达情况，流式细胞术比较两种细胞对于,,,的表达。为深入研究牙周组织中各种细胞的生物学特性、进一步找出牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞的鉴别标志，并为今后两种细胞的进一步改良从而成为牙周组织工程的理想种子细胞来源奠定基础。 材料与方法,实验主要试剂及仪器,(,主要试剂 ,,匣, ,,,;, ,,, 胰蛋白酶 ,,,,, ,,, 胎牛血清,,,,) 四季青 杭州 青霉素、链霉素 华北制药 河北 ,,,免疫组化试剂盒 ,,;,,, ,,, 四唑盐(,,,, ,,,,, ,,, 二甲基亚砜(,,,,) 泰兴 天津 碱性磷酸酶试剂盒(,,,) 建成生物研究所 南京 ，、?型胶原 ,脏,，,,, ,,, ,?田(, ,,,,, ,,,, ,,,,(,主要仪器设备 ,,,培养箱 ,,,,,,,,, ,,,, ,,, 生物安全柜 ,,,，, ,,,,,,(,,,, ,,, 倒置相差显微 ,,,,,,, ，,,,, ,,,心, 研究论文 酶标仪 ,,,,,, ,,, ,,,,,，, 光学显微镜 ,，,?口,, ,, ,姆处通 流式细胞仪 ,,，,,(,,(，，型 ,,,,细胞培养 ,(,组织细胞来源 牙周膜细胞取自,,岁左右因正畸需要拔除的健康前磨牙，拔牙前,,双氧水含漱，酒精棉球消毒牙面;牙龈成纤维细胞取自同一个体同一部位的龈乳头组织。,(,原代细胞培养 将拔下的牙立即置入含青霉素(,,, ,,,,)、链霉素(,,, , ,,,,)的,—,,,,?,液中浸泡,, ,,,,，移入超净工作台，用无血清,,,,(,,,,,;,,?, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,)冲洗根面,遍，用刀片刮取牙根中,,,部位的牙周膜组织，剪切成,(, ,,,, ×,，, ,,×,(, ,,大小的碎块，均匀铺于无菌,, ,,培养瓶底，瓶底向上。加入,(, ,,含,,,,,,的,,,,培基，置,,,孵箱内,,„,、,,,,,条件下孵育, ,后，轻轻翻转培养瓶继续培养。, ,后取出观察，弃污染及组织块漂浮者。从第, ,开始，，每三天换液一次。 将切取的牙龈组织置于含双抗的,(,,,,?,液中，移入超净工作台，,—,,,,?,液反复冲洗三遍。用眼科剪将牙龈剪成, ,,,大小的组织块，均于铺于,, ,,培养瓶底，方法同牙周膜细胞。,,,传代 倒置显微镜下观察，待组织块中游出细胞至细胞铺满瓶底约,,,时，用,(,,,胰蛋白酶消化。进行首次传代，传代比例为,:,，二代以后则以,:,,,传代。传代后细胞用含,,, 研究论文,,,的,,,,培养液培养，约每,,传代一次。选用第,“代培养的细胞用于实验。,(,来源鉴定 取第,代细胞爬片，用免疫组化,,,法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，证明其为中胚层来源的成纤维细胞，即可用于实验。,实验方法,(, ,,,法检测增殖活性 分别取第,代生长良好的牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞，,(,,,胰酶消化，含,,,,,,的,,,,充分吹打制成细胞悬液，调整细胞浓度为,,,,,,,,。取,,孔板,个，每板接种两种细胞各,孔，每孔加入细胞悬液,,, ，, ,，,,”,、,,,,,孵箱中培养, ,。分别于第,、,、, ,各取出一,,孔板，弃孔内液体，加入,,,溶液(, ,,,,,),, , ,，,,”,、,,,,,继续培养, ,。终止培养，弃孔内液体，每孔加,,, , , ,,,,，振荡器震荡,, ,,,，酶标仪,,, ,,波长检测各孔,,值。,(,,,,活性 取生长良好的第,代牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞，以, , ,,,,,,的细胞浓度分别接种于,,孔培养板，每孔液量为,(, ,,。以含,,,,,,的,,,,在,,。,、,,,,,孵箱中培养, ,，弃孔内液体，,(,,,,?,液洗,次。吸干，加入,,, , , ,(,,,,,,,, ,(,,,，置,。,冰箱过夜。倒置显微镜下观察已无完整细胞结构，经振荡后，进行如下的实验:?取上述各孔液体各,, ,,，空白对照选用,, ,,蒸馏水转入另一,,孔板。按,,,试剂盒说明依次按比例加入缓冲液、基质 研究论文液，,,”,水浴,, ,,,，加入显色剂立即混匀后在,,,型酶联仪上于,,, ,,波长下测,,值，取各组平均值，间接反映细胞,,,活性。,(,免疫组化染色 取生长良好的第,代牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞，以,×,,,,,,的浓度接种于放有, , ,;,,大小盖玻片的,,孔板中，加液量为, ,,,孑,，,—,,,,?,冲洗,遍，,,,,，醇固定后进行免疫组化染色。光学显微镜下观察，摄片。 结果判定:细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性。以染色强度为判定 标准，分为四级:无棕色颗粒记为(一);仅有少量、细小、散在的棕色颗粒，着色较浅，记为(，);棕色颗粒聚集成大颗粒记为(，，);颗粒密集成团片状，着色深棕，记为(，，，)。实验结果由本人和实验室一位有经验的老师共同得出。,(,流式细胞术检测 分别取第六代牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞，,(,,,胰酶消化吹散，计数细胞量达,×,,,个以上，离一,,收集细胞，,(,,,,?,液洗两次，弃去，,,,乙醇固定并制备成单细胞悬液。上机,,,检测。,统计学方法 采用,,,,,,(,统计软件，检测结果以均数?标准差()〔?,)表示，,,,(,,为差异有统计学意义，应用两样本,检验分析方法对,,,、,,,及,,,检测结果进行统计学分析。 研究论文 结 果,原代培养:本次人牙周膜细胞原代培养成功率为,,,，牙龈成纤维细胞的原代培养成功率为,,,,，倒置相差显微镜下观察，,,,, ,有细胞从组织块周围游出，放射状排列，,,,细胞长满培养瓶底，原代及传代培养的牙龈与牙周膜细胞在光镜下形态及排列无明显差别，但原代培养的细胞中，牙龈成纤维细胞稍早于牙周膜细胞移出组织块，二者均为长梭形，,,,个胞浆突起，胞核呈圆形或椭圆形，核仁明显，细胞排列成柬状、漩涡状。经免疫组化鉴定波形蛋白阳性，细胞角蛋白阴性，符合成纤维样细胞的特征，为中胚层来源。,牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞增殖活性的比较:加入,,,, ,后，各孔内均有紫黑色结晶形成，经酶标仪于,,, ,,处读数，牙周膜细胞组的,值为,(,,,?,(,,,，牙龈成纤维细胞组的,值为,(,,,,，,(,,,(见,,,,, ,)，二者比较，差异有统计学意义(,,,(,,。倒置显微镜下可见，随着时间的推移，每次取出的培养板中各孔细胞的数量总体均比前一次取出的培养板中各孔的细胞数有所增加，最后观察的一组细胞平均长至培养板各孔的,,,。,牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的,,,活性对比:加入显色剂后各孑,内液体呈现深浅不一的红色，经酶标仪,,, ,,,,,处读数，牙周膜细胞组的,,值为,(,,,?,(,,,，牙龈成纤维细胞组的,,值为,(,,,?,(,,,(见,,,,, ,)，二者比较，差异有统计学意义(,,,(,,)，后者的,,,活性显著高于前者，说明牙周膜细胞的成骨活性明显高于牙龈成纤维细胞，,,,可以作为鉴别牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的标志之一。 研究论文,免疫组化染色:以阴性对照为参照(,,(,,,)，牙龈成纤维细胞中，型胶原染色为阳性(，)，染色较弱，颗粒细小，胞浆淡黄色(,,,(,，,)，而牙周膜细胞为中到强阳性(，，)弋，，，)，胞浆中充满棕黄色大颗粒，核膜周围染色较深(,,,(,，,)。，，，型胶原的染色结果与，型胶原相似，牙龈成纤维细胞着色较淡(，)(,,,(,，,,)，牙周膜细胞则为中到强阳性(,,, ,,，,,)(，，卜(，，，)。,,,在牙龈成纤维细胞中着色较淡(,,,(,,，,,)，为(，? 乐苣は赴 猩钭厣 帕,芗 赏牌 矗ǎ睿纾 保矗 保叮 ǎ ,伞?散蛐徒涸 ?拢停性诹街窒赴 械谋泶锊煌 梢宰魑 鹧乐苣は赴 脱丽赋上宋 赴 谋曛疚铩,盗魇较赴 В壕 扑悖 乐苣は赴 模拢停杏 馇慷戎滴 矗 常埃埂溃埃 ?,,，高于牙龈成纤维细胞,(,,,?,(,,,(见,,,,,,)，二者相比差异具有统计学意义(尸,,(,,)，提示牙周膜细胞表达较高的,,,水平，具有较强的成骨潜力。 研究论文 附 图 ,,,，, ，,,,,,,,,,,;,,,;,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,仃,, ,,,,,((,,,,, ,,,,,,,;, ,,,,,，×,,,).