人胃窦部胃泌素和生长抑素及其相关mRNA表达和定位的研究

人胃窦部胃泌素和生长抑素及其相关mRNA表达和定位的研究 人胃窦部胃泌素和生长抑素及其相关 mRNA表达和定位的研究 第11卷第4期 2002年12月 中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESEJOURNALOF"YANDCYT0CHEMlSrRY Vo1.11.No.4 Dec.2002 人胃窦部胃泌素和生长抑素及其相关mRNA 表达和定位的研究 葛振华周凡武一曼唐福康王若愚 (福建省中医药研究院福建中医学院,福州350003) [摘要]目的了解人胃窦粘膜内胃泌素和生长抑素及其nLRNA在细胞内的表达和定位.方法用免疫细胞化学和 原位杂交技术.结果G细胞内的胃泌素主要位于细胞的基部和侧部,而其mRNA则位于核周和核上区;D细胞内的生长 抑素不仅位于细胞的基部,也见于细胞突起,其mRNA则位于核周,核上区以及突起.G,D细胞均有开放型和闭合型. 结论G细胞为内分泌方式,而D细胞在人胃窦部可能存在两种细胞亚群,除旁分泌外,也有内分泌方式. [关键词]胃泌素;生长抑素;mRNA;免疫细胞化学;原位杂交 [中图分类号]R322.44[文献标识码]A EXPRESSIONANDLOCALIZATIONOFGAIN,SOMATOSTATINAND THEIllCORRESPONDINGmRNAlNHUMANANTRUM GeZhenhua,ZhouFan,WuYiman,TangFukang,WanRuoyu (FujianAcademyofTraditionalChineseMedicineandPharmacy, FianCollegeofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou,350003China) [AbstracCObjectiveToinvestigatetheexpressionandlocalizationofgastrin,somatostatinand theirmRNAinthehumanantrum.MethodImmunocytochemistryandinsituhybridizationtechniques wereused.ResultGastrinwasobservedtobelocalizedinthebasalateralpartofGcells,anditsmRNAap— pearedintheperinuclearorsupernuclearregions.ThesomatostainexpressionofDcellswasfoundnoton— lYinthebasalpartbutalsointheplasmicprocesses,whileitsmRNAwasconstantlypresentintheperinu— clearorsupernuclearareaandinprocesses.G,Dcellswerefoundtohavebothopentypeandclosetype. ConclusionThesecretionofGcellswasendocrinic,whileDcellsmayhavetwosubpopulationsinthehu— manantrumendocrinicaswellasparecrinic. [KeyWords;Gastrin;Somatostatin;mRNA;Immunocytochemistry;Insituhybridiza- tion 随着多种抗体的制备和免疫细胞化学的广泛应 用,在人与动物的胃体部已经知道有七种神经内分 泌细胞,但在胃窦部仅有三种,即G细胞,D细 胞和胃肠道嗜铬细胞(entero-chromaffincell, ECC)-1].近年的研究证实,G细胞仅分布于胃窦 和十二指肠近端,其分泌的胃泌素可促进胃酸的分 泌和胃粘膜的生长,而D细胞分布比较广泛,散 布于整个消化道和其他器官[2].在胃窦部的D细 胞,借助其分泌的生长抑素以旁分泌的方式调节着 G细胞分泌胃泌素,由于两者在功能上的相互协调 和制约;维持了胃酸的正常分泌.过去的研究发现 恶性贫血的病人G细胞增加,而D细胞减少.胃 泌素瘤时G细胞减少,而D细胞相对增加[3].Wu 等报道大鼠在进食时胃泌素mRNA水平增加,而 [收稿日期]2002—04[修回日期]2002—08 [基金项目]福建省卫生厅科研基金资助课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 (No.96057) (作者简介]葛振华,男,(1929年),汉族,研究员. 生长抑素mRNA水平下降.然而过去的研究多 集中在G,D细胞的形态学以及它们与胃肠疾病的 关系.至于在正常人胃窦粘膜内,胃泌素和生长抑 素基因转录产物一mRNA以及两种激素合成后的 储存,定位及分泌等,国内外少有报道.本文拟用 免疫细胞化学和原位杂交技术,探讨生理情况下胃 窦部G,D细胞的mRNA及胃泌素,生长抑素的 表达,以及它们在细胞内的定位. 材料和方法 1.材料:在自愿接受胃镜活检的人员中,选 取了l0例胃窦粘膜无炎症反应和其它疾患,其中 男性7例,女性3例,平均年龄30.8岁.所有标 本均取自胃窦大弯侧,经Lillie固定液固定后,常 规脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚4m, 用0.19/6的多聚赖氨酸粘片,HE染色用于病理诊 断和一般形态学观察. 2.免疫细胞化学染色方法: 第4期葛振华等.人胃窦部胃泌素和生长抑素及其相关mRNA表达和定位的研究 371 2.IG,D细胞免疫细胞化学双染法:切片 脱蜡人水,人0.2MHC120rain(阻断内源性碱性 磷酸酶),流水洗5rain.再人39/6HzOz20min(阻 断内源性过氧化物酶),流水洗5min.人pH7.4 的PBS(含0.1%TritonX一100)20min,PBS洗 5min.滴加10%正常马血清室温20min(减少背景 非特异性染色).除去多余血清后,滴加即用型兔 抗人生长抑素抗体(福州迈新公司),将切片置潮 湿容器内,室温45min,PBS洗5minx2.加即用 型生物素标记的羊抗兔IgG抗体(福州迈新),室 温45min,PBS洗5minx2.加碱性磷酸酶标记的 链亲合素(Dako,1:100),室温30min.人PBS 5min,pH8.8Tris—HC1缓冲液10rain.BCIP/ NBT(Dako)显色,暗处反应5,10min.人 5mMEDTA终止反应,流水洗5min,PBS洗 5minx2.滴加1O正常马血清室温20min;滴加 兔抗人的胃泌素抗体(福州迈新,1:10),4?冰 箱过夜.次日取出,室温平衡30min,PBS洗 5minx2.滴加生物素标记的羊抗兔IgG抗体,室 温45min,PBS洗5minx2.加辣根过氧化物酶标 记的链亲合素(福州迈新),室温30min,PBS洗 5minx2.最后用DAB底物混合液(10mlpH7.4 PBS,3mgDAB,40ul3H2O2)暗处反应5, 10min,流水洗10min.甘油明胶封片.阴性对照 片用PBS代替第一抗体,其它步骤与实验片相同. 2.2G,D细胞免疫细胞化学单染法:切片 脱蜡人水,人0.2MHC120min(阻断内源性碱性 磷酸酶),流水洗5rain.人pH7.4的PBS(含 0.1%TritonX,100)20min,PBS洗5min.滴加 10%正常马血清室温20min(减少背景非特异性染 色).除去多余血清后,分别滴加兔抗人胃泌素抗 体和兔抗人生长抑素抗体(福州迈新公司,1: 10),将切片置潮湿容器内,4?冰箱过夜.次日取 出,室温平衡30min,PBS洗5minX2.加即用型 生物素标记的羊抗兔IgG抗体(福州迈新),室温 45min,PBS洗5minX2.加碱性磷酸酶标记的链 亲合素(Dako,1:100),室温30min.人 PBS5min,pH8.8Tris-HC1缓冲液10min,BCIP/ NBT(Dako)显色,暗处反应5,10min.人 5raMEDTA终止反应,流水洗5min.甘油明胶封 片.阴性对照片用PBS代替第一抗体,其它步骤 与实验片相同. 3.胃泌素和生长抑素mRNA原位杂交方法: 试剂配制和步骤基本按I.arsson方法进行 (1993)Es]. 3.1杂交步骤:切片脱蜡入水.加0.2MHC1 配制的0.03胃蛋白酶(Sigma)室温消化20rain. 人DEPC水5minX2,人49/6多聚甲醛固定5rain. 加杂交液(探针 PBS洗5minx2,除去多余液体. +杂交缓冲液),置潮湿容器内,分别在50?(胃 泌素mRNA)和55?(生长抑素mRNA)温箱孵育 过夜.杂交液探针浓度50ng/ml,由丹麦国家血清 研究所I.arsmn教授赠送.探针序列分别为Gas5,一 TTC(?CAGOCA11GG1?C(G(几3,与人 胃泌素mRNA互补,Som5"-TGA不AGCAGA TCT1GCAGCT-3,,与人生长抑素mRNA互补, 生物素标记.次日取出,室温放置30min,用预热 的0.3XSSC42?(胃泌素tuRNA)和4O?(生长 抑素mRNA)洗15minX4. 3.2杂交后信号的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 :PBS洗5minX2, 人阻断液(PBS含1BSA,0.1TritonX一100) 室温30min,PBS洗5minX2.加鼠抗生物素抗体 (Dako,1:100)室温60min,PBS洗5minX2. 加生物素标记兔抗鼠IgG(Dako,1:100)室温 45min,PBS洗5minx2.加碱性磷酸酶标记的链 亲合素(Dako,1:100)室温30min.人洗涤缓冲 液洗5minX4,人pH8.8预检测缓冲液5minX2. 加BCIP/NBT(Dako)混合液,暗处显色10, 15min,在显微镜下观察.人5mMEDTA终止反 应,流水洗5min.甘油明胶封片.阴性对照片不 加探针,用杂交缓冲液代替,其它步骤与实验片相 同.全部过程需戴手套,所需器材必须消毒,以免 被RNA酶污染,影响实验结果. 结果 在双染的切片上,G,D细胞分布于幽门腺的 中1/3处,G细胞呈深棕色,胞核阴性,D细胞呈 蓝色,胞核阴性,它们在腺体内混合存在(图1); 有的D细胞突起与G细胞密切接触(图la),与D 细胞接触的G细胞与未接触的G细胞相比免疫活 性反应呈浅染.在单染的G细胞切片上,高倍镜 下G细胞多呈锥体状,基部膨大靠近基膜,而顶 部狭窄伸到腺腔,大多属于开放型(图2),但也 有少数G细胞呈闭合型(图2a).胃泌素在G细胞 内的分布仅限于细胞底部和侧部,有的在核上区 (图2),胞核呈阴性.G细胞的胃泌素mRNA阳 性信号出现在G细胞的核周或核上区(图3),G 细胞内的mRNA的信号强度细胞间也有差异.在 中国组织化学与细胞化学杂志第11卷 单染的D细胞切片上,可见D细胞胞体多呈梭形 或圆形,其特征是有较长的突起.D细胞的生长抑 素反应也分布在细胞的底部以及突起内(图4), 在横切面上,突起内的生长抑素多呈圆点状.有的 D细胞突起穿过细胞间隙伸达腺体基膜,D细胞也 有开放型和闭合型两种(图4).D细胞的mRNA 的阳性信号多位于D细胞的核周或核上区(图5), 胞核呈阴性,但突起mRNA亦呈阳性(图5).免 疫细胞化学和原位杂交染色的对照片均为阴性. 讨论 利用胃镜活检的少量粘膜组织,除了可用于临 床病理外,同时也可以在原位研究不同情况下,胃 泌素和生长抑素基因的表达及激素的分泌或储存. 原位杂交 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法优于生物化学分析方法;因为生 化分析,不仅需要较多的组织,同时也不能了解原 位组织细胞类型的改变.G,D细胞免疫细胞化学 显示,这两种细胞分布在幽门腺的中1/3处,这与 大鼠的G,D细胞位于腺体的下1/3或腺体底部是 不同的_6].G细胞多为开放型,细胞内胃泌素主要 分布在细胞底部和侧部,该处被认为是分泌颗粒储 存的场所,可能有利于胃泌素以经典的内分泌方式 进入血流.由于开放型的G细胞顶端狭窄部伸向 腺腔,过去曾一度误认为G细胞还具有外分泌腺 的行为,然而本实验结果未发现在腺腔内有胃泌素 活性物质,Larsson用免疫荧光方法,虽然发现大 鼠G细胞内的胃泌素在进食或饥饿时有波动,但 未观察到腺腔内有免疫活性的胃泌素_7].因此有关 G细胞除了以内分泌方式分泌外,还具有外分泌功 能说法证据不足.我们认为G细胞顶端突起伸到 腺腔的意义,与分泌无关,或许具有化学感受器的 功能.它可以接受胃内容物的化学刺激,又可接受 来自血液的体液刺激(基底面),引起激素释放活 动的变化].存在于核上区的胃泌素可能为新合成 的分泌物,尚未转移至细胞底部.胃泌素mRNA 则主要分布在核上区或核周,电镜下存在于内质网 和高尔基复合体处,这说明在G细胞内的胃泌素 及其mRNA的分布是不同的,胃泌素mRNA分布 区是合成胃泌素的场所,经过加工,剪接,转移至 内分泌储存的场所——即细胞的基部,便于分泌. 胃泌素mRNA在细胞内染色后的强度,彼此间强 弱有所差异,这可能是胃泌素基因转录和翻译并非 同步的原因: I)细胞也位于幽门腺的中1/3处,与临近的G 细胞紧密相连,有的则相互拥抱_9].在人胃窦部的 D细胞过去一直被认为是开放型的n].但本研究 并不完全支持已有的结论,很多D细胞也属于闭 合型,因为它并未直接伸到腺腔.D细胞的生长抑 素多分布于细胞底部或突起内,突起的末端膨大与 效应细胞接触,胃体的D细胞直接与壁细胞接触, 胃窦部的则与G细胞接触,尽管这种接触是短暂 的_9].Larsson用原位杂交和免疫细胞化学技术, 首次在光镜下观察到与D细胞突起接触的G细胞 内的mRNA显着减少,而未接触的G细胞内则有 较多的mRNA,这说明D细胞以旁分泌的方式调 节着胃泌素基因的表达,通过旁分泌释放的生长抑 素来抑制胃泌素的释放].本文 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 也显示,与D 细胞接触的G细胞内的胃泌素淡染,而未接触的 G细胞则深染.动物实验证明,灌流抗生长抑素抗 血清后,血清中的胃泌素水平增高,说明两者有密 切关系,其机理可能是通过D细胞上的胃泌素受 体抑制了生长抑素的释放,从而导致胃泌素的合成 和释放增加[4].尽管目前人们接受D细胞以旁分 泌方式调节G细胞的分泌,但是Lamberts等在电 镜下虽观察到G,D细胞的接触,却未发现在接触 处有生长抑素的颗粒存在_1...因此有关D细胞对 G细胞的调节机理有待进一步证实.根据本文资料 有理由认为在胃窦部的D细胞可能有两个细胞亚 群,一种是旁分泌形式,另一种是内分泌形式,后 者将生长抑素释放到血循环中.Kusumoto等用连 续切片证明D细胞突起伸至毛细血管壁上[?],他 们的试验也支持了D细胞是内分泌方式的概念; 此外生长抑素分布在D细胞底部位置,也更有利 于内分泌学说. 有意义的是,D细胞生长抑素mRNA不仅位 于核周和核上区,在细胞突起内也有表达.突起内 的mRNA是从胞质转移到突起内,还是在突起内 固有的还不清楚,不过我们推测可能是从胞质转移 至突起,因为电镜观察到突起内有成束的细丝 (cytofilaments),它的功能还不清楚,可能有利于 细胞内分泌颗粒的移动,突起的伸缩以及改变突起 的方向,与效应细胞形成接触_1... 参考文献 ff13NorlenP,CarryWJ,BjorkqvistMeta1.Cell—specific processingofehromograrinAinendocrinecellsofrat stomach.JHistochemCytoehem,2001,49(1):9 [2]StaniszAM,BefusD,BioenstoekJeta1.Defferential effects0fvasoactiveintestinalpeptide.substanceP.and somatostatinoHinm~unoglobulinsynthesisofprolifera..