淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达及多克隆抗体制备

淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达及多克隆抗体制备* 【摘要】 目的 为进一步研究蚊视蛋白参与杀虫剂抗性的相关分子机制及其作为现场抗性检测靶标提供多克隆抗体。 方法 以实验室前期制备的重组质粒pGEM®-T Easy/opsin为模板，通过基因工程手段克隆视蛋白胞外区片段，构建原核载体，IPTG诱导表达蛋白, 并利用His亲和层析以及肠激酶酶切片段获得纯度较高的蛋白，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。 结果 成功构建淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达载体，经IPTG1mmol/L诱导3h后高效可溶性表达重组蛋白，经His亲和层析及肠激酶酶切后获得纯度较高的蛋白，制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别蚊视蛋白而不与非特异性蛋白结合。 结论 制备的多克隆抗体特异性好，效价较高，为进一步研究视蛋白参与杀虫剂抗性的分子机制及其作为现场抗性检测靶标提供了基础。 【关键词】 淡色库蚊；抗药性；视蛋白；原核表达；多克隆抗体 【中图分类号】R384. 1 【文献标识码】A【文章编号】 Prokaryotic Expression of Major Antigenic Domain in Opsin Encoded by Culex pipens pallens and Preparation of Polyclonal Antibody ZOU Ping, SUN Yan, SUN Hai bo, ZHU Chang liang(Department of Pathogenic Biology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China) 【Abstract】 Object To investigate how protein opsin participates in the insecticide resistance and whether it can be used as a target testing resistance , a specific rabbit polyclonal antibody of opsin was obtained from a prokaryotic expression construct of Culex pipens pallens opsin. Methods The main antigenic domain encoding sequence distributed in opsin genes of Culex pipens pallens was amplified by PCR method and inserted into an inducible prokaryotic expressive plasmid pET-32a (+). Opsin-His fusion protein was induced by IPTG, purified and renatured by Ni+ affinity column and enterokinase. The purified opsin protein was used to immunize New Zealand rabbits for preparing polyclonal antibody. Results The recombinant vectors of Culex pipens pallens were successfully constructed. The fusion protein was abundantly expressed at 3 hours after the recombinant vectors were induced by 1mmol/L IPTG. Western blot analysis demonstrated that opsin expression protein can be specifically detected by the antibody in Culex pipens pallens. Conclusion The polyclonal antibody has high titer and specificity, and it will be valuable for the further study on how protein opsin participates in the insecticide resistance. 【Key words】Culex pipens pallens；insecticide resistance；opsin；prokaryotic expressive；polyclonal antibody 蚊是世界性分布的卫生害虫，它不仅吸血骚扰，而且传播疟疾、丝虫病、登革热等多种疾病，严重危害人类健康[1]。随着全世界范围内杀虫剂的大量连续使用，蚊对杀虫剂逐渐产生了抗药性。世界卫生组织预言“抗药性是控制虫媒病的最大障碍”。抗药性是由基因决定的、可遗传的、复杂的生物进化现象[2]。鉴定新的抗药性基因并研究其参与抗药性的机制成为媒介抗药性领域的研究重点。 本实验室前期采用抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片法高通量筛选，并经定量PCR及转染试验重复验证，发现淡色库蚊视蛋白基因(opsin)与溴氰菊酯抗药性相关[3]，亦有报道视蛋白基因在果蝇DDT抗性品系内、致倦库蚊溴氰菊酯抗性品系内高表达[4,5]。但视蛋白参与杀虫剂抗性的机制，目前尚未见报道。 本研究拟对视蛋白主要抗原域编码区进行克隆和原核表达并制备多克隆抗体，为进一步研究视蛋白参与杀虫剂抗性的分子机制及其作为现场抗性检测靶标提供基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种、克隆表达载体、培养基和生长条件 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株、pET32a(+)原核表达载体菌种及重组质粒pGEM®-T Easy/opsin菌种均由本实验室提供。BL21(DE3)常规培养用LB培养基，37℃振荡培养，氨苄霉素的工作浓度为50ug/ml。 1.1.2 酶及主要材料试剂 ExTaqDNA 聚合酶、dNTP、DL2000Marker购自TaKaRa公司；限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ、T4DNA连接酶购自NEB公司；胶纯化回收试剂盒购自Bioflux公司；质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；镍柱购自Thermo公司；重组肠激酶购自南京生兴公司；SDS-PAGE配胶试剂盒购自碧云天公司；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白Marker、ECL曝光试剂盒购自Fermentas公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自Abcam公司；酵母提取物(Yeast extract)、胰化蛋白胨 (Tryptone)、氯化钠、IPTG等购自上海生工公司; 弗氏佐剂购自Sigma公司；试验动物新西兰大耳白兔2只，体重约2.0 kg 1.1.3 引物 根据GenBank中已发表的淡色库蚊视蛋白cDNA序列(登录号：AY749413)，应用Primer Premier 5.0软件 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 针对其胞外段1 101-1 244bp的引物用于PCR扩增(opsin上游：5’- GCGAATTCATCGTGTACGGAATCAGCCA-3’, opsin下游： 5’- ATGCGGCCGCTTAAGCCTTCTCGTCGGAGG-3’; 下划线部分为酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ)，引物由上海英骏生物技术公司合成。 1.2 方法 1.2.1 opsin主要抗原域的片段扩增及原核表达载体构建 以实验室前期制备的重组质粒pGEM®-T Easy/opsin菌液为模板，PCR 扩增目的基因从1 101bp到1 244bp的DNA片段，PCR反应体系：10×Buffer5ul，25mmol/LMgCl24ul，10mmol/LdNTPs5ul，上下游引物各20pmoL，菌液6ul，ExTaqDNA聚合酶0.5ul，用灭菌超纯水补足至总体积50ul。PCR反应条件：94℃预变性5min，再以94℃1min，52℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用试剂盒回收。EcoRⅠ/NotⅠ酶切pET-32a(+)表达载体和PCR回收片段，37℃4h，双酶切后再次回收，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，然后将重组质粒转化入大肠杆菌TOP10中，37℃180rpm培养过夜，采用试剂盒抽提质粒，利用菌液PCR鉴定阳性单菌落，最后进行测序鉴定。 1.2.2 蛋白的优化表达与纯化 将重组质粒pET-32a(+)/opsin转化入大肠杆菌BL21(DE3），挑单菌落培养过夜后按1:100的比例接种于500ml LB抗性(Amp+)培养基中，37℃培养至菌液的OD600达到0.4-0.5时，比较以下表达条件：时间(2h、3h、4h)，IPTG浓度(0.7 mmol/L、1.0 mmol/L、1.3mmol/L)，采用液氮反复裂解收集蛋白，根据SDS-PAGE结果确定其最佳表达条件并分析融合蛋白的表达形式。在最佳表达条件下将重组体扩大培养并经IPTG诱导表达，4℃3 000g离心20min，收集菌体, PBS重悬后在冰浴条件下超声破碎菌体(工作3sec，间歇4sec，共30 次，150W)，然后4℃12 000g离心30min，收集上清用镍柱纯化重组蛋白,经肠激酶酶切，加1/3体积4×蛋白Loading Buffer，沸水浴5min后置冰上冷却，10%SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白纯度。最后采用BCA法测定蛋白浓度。 1.2.3 多克隆抗体的制备 将纯化后的可溶性蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下多点注射免疫新西兰大白兔，每只家兔融合蛋白用量500ug，初次免疫后三周，融合蛋白与不完全弗氏佐剂等体积充分混匀，免疫剂量加倍至1 000ug，皮下多点注射以后每隔10天按照第二次免疫 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 加强免疫,且在每次免疫后第七天，从兔耳缘静脉取血，分离血清，间接ELISA法测抗体效价，当测得效价大于1：16 000时，行最后一次免疫，末次免疫后第7天，心脏采血，分离血清，室温静置直至抗血清析出，收集血清，经辛酸-硫酸铵法纯化后，得到较高纯度的抗体，-80℃保存。 多克隆抗体的Western blotting分析鉴定 以pET-32a(+)/opsin融合蛋白、实验室抗性为0.5ppm的淡色库蚊蛋白以及转化空质粒的大肠杆菌细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上，以5％脱脂牛奶(溶于TBST中)37℃封闭1h，TBST(25mmol/LTris-HCl，pH7.5；50mmol/LNaCl，0.1％Tween20)洗膜后加入制备的抗opsin多克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜，TBST洗涤3次，10min/次，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗(1∶1 000)，室温孵育2h，TBST洗涤3次，10min/次，洗涤后加ECL使X光胶片感光，检测抗体的特异性。 2 结果 2.1 PCR扩增目的片段及其原核表达载体的构建 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物片段约150bp，符合预期目的片段长度(图1)。对重组载体pET32a(+)/opsin进行菌液PCR鉴定(图2) ，并进一步测序确证载体构建成功，序列没有发生任何突变。 2.2 opsin融合蛋白的表达及纯化 将pET-32a(+/opsin转化入大肠杆菌 BL21(DE3后，分别以0.7 mmol /L、1.0 mmol /L、1.3mmol /L IPTG进行诱导表达，并在1h、2h、3h分别取样，对其表达产物进行SDS-PAGE电泳分析(图3)，结果显示，与诱导前相比，在24KD附近有一明显条带，与预期的opsin融合蛋白相对分子质量一致。在25℃3h，IPTG1mmol /L表达条件下，目的蛋白得到了高效可溶性表达。融合蛋白经镍柱纯化及肠激酶酶切后，取适量进行SDS-PAGE结果显示显示为较单一的条带，纯度为85%以上(图4、图5) ，产率达1.57mg/ml(图6)。 2.3 opsin多克隆抗体鉴定 Western blot结果显示pET32a(+)/opsin融合蛋白、实验室抗性为0.5ppm的淡色库蚊蛋白的泳道上分别检测到24KD和36KD的特异性条带，而转化空质粒的大肠杆菌细胞裂解液未有明显的杂交带(图7)，表明抗体具有很好的特异性，可以应用于视蛋白的进一步研究。 3 讨论 视蛋白分子量约为30~50kDa，属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）超家族。由于视蛋白是一种膜蛋白，我们选取其胞外段的144bp进行克隆，该序列是其保守的特异性序列，且对应编码的蛋白有较强的亲水性，便于抗体制备过程中的纯化，在保证抗体特异性的前提下也利于实验本身载体的构建以及蛋白的表达。本研究通过基因工程手段克隆得到视蛋白胞外区片段，构建原核载体高表达视蛋白胞外区蛋白, 利用His亲和层析以及肠激酶酶切片段获得纯度较高的蛋白，将纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔以获得高效价的抗视蛋白抗体。通过western blot方法鉴定所制备的多克隆抗体具有良好的特异性和高度的亲和力, 为深入研究视蛋白参与杀虫剂抗性的分子机制提供了实验基础。 媒介抗药性治理的前提在于早期发现抗药性和监测抗药性的发展,所以抗药性的检测一直是媒介防制研究的热点课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。对于近年广泛使用的菊酯类杀虫剂，目前现场仍沿用WHO生物测定法检测。然而该方法需要大量的发育整齐的活体幼虫，实施难度大，检测误差大，且较低水平抗性时难以检出。本实验制备的有良好特异性和高度亲和力的视蛋白抗体，可望为建立现场快速分子检测奠定基础，具有应用潜力，值得进一步探讨。 此外，本研究选用的pET-32a(+)原核表达载体的两端，均有编码His标签的序列，即使一端有移码突变，仍能保证目的蛋白带有His标签蛋白，且不论目的蛋白在上清或沉淀表达，都能用镍柱亲和纯化，从而获得有活性的目的蛋白，是十分简捷的原核表达载体。 【参考文献】 [1] Edberg SC, Global Infectious Diseases and Epidemiology Network (GIDEON): a World Wide Web-Based Program for diagnosis and informatics in infectious diseases. 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M DNA 分子质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 1 PCR产物 图1 淡色库蚊视蛋白主要抗原域编码区PCR产物 M DNA marker DL 2000 1 The PCR products Fig.1 PCR products of the main antigenic domain encoding sequence of Culex pipens pallens opsin M DNA 分子质量标准 1 pET-32a(+)/opsin重组质粒PCR产物 图2 淡色库蚊视蛋白主要抗原域表达载体的构建 M DNA marker DL 2000 1 The PCR products of pET-32a(+)/opsin recombinant plasmid Fig.2 Construction of the main antigenic domain of Culex pipens pallens opsin expression vector M: 蛋白分子量标准 1，3，6分别为0.7mmol /L IPTG 诱导下2 3 4 h 取样表达情况 4，7分别为1.0mmol /L IPTG 诱导下3 4 h 取样表达情况 2，5，8分别为1.3mmol /L IPTG 诱导下2 3 4 h 取样表达情况 9表达菌株诱导前 图3 淡色库蚊视蛋白融合蛋白的SDS-PAGE分析 M: protein marker;1: 0.7mol/L IPTG, 2 h; 2: 1.3mmol/L IPTG, 2 h; 3: 0.7mmol/L IPTG, 3h; 4: 1.0mmol/L IPTG, 3h; 5: 1.3mmol/L IPTG, 3h; 6: 0.7mmol/L IPTG, 4h; 7: 1.0mmol/L IPTG, 4h; 8: 1.3mmol/L IPTG, 4h; 9: before induced Fig.3 SDS-PAGE ananalysis of the recombinant opsin fusion protrein of Culex pipens pallens M 蛋白分子量标准 1 重组蛋白挂柱后上清 2 重组蛋白挂柱后沉淀 图4 淡色库蚊蛋白纯化产物的 SDS-PAGE分析（镍柱后） M protein marker 1 the supernatant of recombinant protein after Ni+ affinity column 2 the precipitation of recombinant protein after Ni+ affinity column Fig.4 SDS -PAGE analysis of Culex pipens pallens purified production（after Ni+ affinity column） M 蛋白分子量标准 1 酶切后上清 2 酶切后beads 图5 淡色库蚊蛋白纯化产物的 SDS-PAGE分析（肠激酶酶切后） M protein marker 1 the supernatant after enterokinase 2 the precipitation after enterokinase Fig.5 SDS -PAGE analysis of Culex pipens pallens purified production（after enterokinase） 图6 蛋白质标准曲线 Fig.6 Standard curve of protein X axel: protein concentration; Y axel: absorption spectrum detected at OD=750 转化空质粒的大肠杆菌裂解液（阴参） 2 pET32a(+)/opsin融合蛋白（阳参） 3 实验室抗性为0.5ppm的淡色库蚊蛋白 图7 淡色库蚊视蛋白多克隆抗体特异性分析 1 the lysate of escherichia coli with pET-32a(+) 2 fusion protein of pET32a(+)/opsin 3 soluble protein of Culex pipens pallens(LC50 of deltamethrin =0.5ppm) Fig.7 Specifity analysis of the polyclonal antibody against Culex pipens pallens opsin 相关帮助 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎:http://www.fantibody.com fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网http://www.biomean.com进行咨询，期待您的加入 本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于生物仪器器械或抗体的信息，可以访问Fantibody您身边的抗体专家!致力于为研究人员提供全球商品化抗体查询、采购、抗体定制、应用技术支持服务,希望对您有帮助！