高血脂对脉络膜血管的影响研究

福建医科大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 高血脂对脉络膜血管的影响研究 姓名：林鸿 申请学位级别：硕士 专业：眼科学 指导教师：徐国兴 20080301 福建医科人学硕上学位论文 缩略语(英文全称) 英文缩略语表 ARMD(age—relatedmaculardegeneration) AS(atherosclerosis)⋯⋯⋯． 中文全称 年龄相关性黄斑变性 BFGF(basicfibroblastgrowthfactor) CNV(choroidalneovascularization) DAB(diaminobenzidine) DEPC(diethylpyrocarbonate) DMSO(dimethylsulphoxide) ECs(endothelialcells) 动脉粥样硬化 碱性成纤维细胞生长因子 脉络膜新生血管 ED(endothelialdysfunction)-—·-··-----·--·---·- OCT．(OpticCoherencetomography) OX-LDL(oxidizedlowdensitylipoprotein) PBS(phosphatebuffersolution) RPE(retinalpigmentepithelium) RPECs(retinalpigmentepitheliumcells) 二氨基联苯胺 二乙基焦磷酰胺 二甲基亚砜 内皮细胞 内皮细胞功能障碍 光学相干断层成像术 氧化型低密度脂蛋白 磷酸盐缓冲溶液 视网膜色素上皮 视网膜色素上皮细胞 RT-PCR(reversetranscriptionpolymerasechainsyStem)一逆转录-聚合酶链式反应 VECs(vascularendothelialcells) VEGF(vascularendothelialgrowthfactor) 血管内皮细胞 血管内皮生长因子 6 学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律结果由本人承担。 作者签名(手写)： 导师签名(手写)： ld净上月妒 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 作者签名(手写)： 导师签名(手写)： 福建医科大学硕上学位论文 高血脂对脉络膜血管的影响研究 摘 要 目的：揭示高血脂动物模型脉络膜血管组织学改变及VEGF的表达，初步探讨 高血脂在ARMD患者CNV形成中的作用及其机制。 方法：36只新西兰大白兔随机分为正常对照组与实验组，分别喂养普通饲料与 高脂饲料。分别于1M、2M、3M后应用透射电镜观察脉络膜组织学改变；应用 免疫组化染色方法和RT-PCR法对脉络膜VEGF表达进行定性、定位及半定量检 测。 结果： 1、脉络膜血管超微结构：对照组未见明显异常。实验组出现血管内皮细胞 肿胀、变形，细胞核异型，细胞间连接破坏；基底膜节段性增厚；管腔变窄， 甚至闭塞；管壁脂滴增多，见泡沫细胞。 2、免疫组化结果显示对照组VEGF在神经节细胞、内核层、视网膜光感受 器层、视网膜色素上皮层和脉络膜层有弱表达。实验组VEGF表达于视网膜神 经纤维层、神经节细胞、内丛状层、内核层、外丛状层、光感受器层、视网膜色 素上皮层和脉络膜层。实验组G1脉络膜组织中VEGF表达与对照组C1差异无 统计学意义(f=O．442，P=0．668)。。G2组脉络膜组织中VEGF表达较C2组明 显增强，经t检验分析组间差异有统计学意义(f=2．330，P=0．042)。G3组脉 络膜组织中VEGF表达较C3组明显增强，经t检验分析组间差异具有极显著统 计学意义(f=3．542，P=0．005)。 3、RT-PCR结果显示对照组和实验组均可检测到VEGFmRNA的表达，位于 363bp处。对照组C1、C2、C3组的脉络膜组织中均可以检测到微弱的VEGFmRNA 表达，条带灰度值经ANOVA分析，组间差异无显著性意义旷=O．728，P--0．499)。 在实验组中，G1组脉络膜组织中VEGF的mRNA表达较对照组C1组表达增强， 但条带灰度值经t检验分析组间差异无统计学意义(声1．703，P=0．119)。G2 组脉络膜组织中VEGF的mRNA表达较C2组明显增强，条带灰度值经t检验分 析组间差异有统计学意义(f=14．138，P<0．001)。G3组脉络膜组织中VEGF删f必A 表达较C3组明显增强，条带灰度值经t检验分析组间差异具有极显著统计学意 2 福建医科人学硕上学位论文 义(f=15．240，P<0．001)。 结论：高血脂通过对脉络膜血管内皮细胞的直接损害以及增强VEGF的表达可 能诱导CNV的发生。 关键词：高血脂脉络膜血管血管内皮生长因子血管内皮细胞超微结构 3 福建医科火学硕1：学位论文 ResearchontheEffectofHyperlipidemiaon ChoroidalBloodVessels Abstract PURPOSESToinvestigatetheexpressionofVEGFandultrastructurechangesin thechoroidalbloodvesselsofhyperlipidemiarabbits，toexploretheroleof hyperlipidemiainthepathogenesisofCNVinARMD． METHODS36rabbitsweredividedrandomlyinto2groups，normalcontrolgroup andhyperlipidemiagroupbyfeedingrespectivelystandarddietandhighcholesterol diet．Theultrastructurechangesinthechoroidalbloodvesselswereobservedbythe transmissionelectronicmicroscopeandtheexpressionofVEGFwasanalysedwith immunohistochemicalmethodandRT-PCRat1,2，3months． RESULTS 1．Ultrastructurechangesofchoroidalbloodvessels：Noabnormalchangewasfoundin thecontrolgroup．DifferentdegreesofultrastructurallesionWasfoundin·the hyperlipidemiagroupduringthecourse，theVECswereswollenanddiscontinuous，the basalmembranewasfragmentallythickened，thebloodvesselswerenarrowedand evenblocked，thefoamcellsandlipidwerefoundonthevasculardissepiment． 2．ImmunohistochemicalmethodshowedthattheexpressionofVEGFWasweakin normalcontrolgroupandthedifferenceWasstatisticallynonsignificantamonggroup C1，C2andC3(P>o．05)．TheexpressionofVEGFWasenhancedinhyperlipidemia groupandthedifferenceWasstatisticallysignificantcomparedgroupG2，G3with groupC2(P0．05)． 3．I玎-PCRshowedthatVEGFmRNAWasdetectedinbothnormalcontrolgroupand hyperlipidemiagroup．TheexpressionofVEGFmRNAparalleledtotheresultof immunohistochemiCalmethod． CoNCLUSIoNThelesionintheendothelialcellsofchoroidalbloodvesselsand 4 福建医科大学硕十学位论文 enhancedexpressionofVEGFcausedbyhyperlipidemialIli咖leadtoCNV KEYWORDSHyperlipidemia；Choroidalbloodvessels；VEGF；Vascularend— othelialcells；U1trastructure 5 福建医科大学硕士学位论文 -Jq o-1， 翮 舌 年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，ARMD)，是目前发 达国家最主要的不可逆的致盲性眼病，且有逐年增加之趋势。在美国，此病是60 岁以上老年人中心视力丧失的首要病因【l】。在我国，随着人口的老龄化和卫生保 健水平的不断提高，发病率也越来越高。临床上常为双眼发病，分为干性和湿性 两型，其中干性以黄斑区地图状萎缩为特征；而湿性以脉络膜新生血管形成 (ehoroidalneovascularization，CNv)为特征，常引起黄斑区出血、纤维瘢痕化。 因此，湿性ARMD是引起视力丧失的最主要原因。目前，其病因不明，也无有效 治疗方法。因此，探索ARMD的发病机制及治疗手段是当前的研究热点。 ARMD是一种由多因素引起的疾病。流行病学调查表明：ARMD的发生与 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、高脂饮食、高胆固醇密切相关。目前ARMD 的发病机制众说纷纭，但根据流行病学调查、临床发病特点和组织病理学研究， 血管模式机制越来越受到重视。 血管模式机制认为，ARMD是一种血管性疾病，继发视网膜色素上皮细胞 (retinalpigmentepitheliumcells，RPECs)损害，从而导致ARMD。因此，ARMD 患者脉络膜血管变化是视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)损伤 的原因而不是结果【21。此外，血管模式强调TAS和高血压在ARMD发病过程中的 重要性，认为ARMD与AS之间存在着相似的危险因素和发病机制【3】。该模式很好 地解释了为什么高血压，尤其AS人群极易好发ARMD。而且，有关抑制素和抗 高血压药(如ACEI和血管紧张素II拮抗剂)对ARMD有保护作用的报道也进一步 支持了血管模式【41。 AS的形成和发展受多种因素影响，大量的流行病学调查证实，高脂血症是 AS的重要危险因素。高脂血症时低密度脂蛋白可发生氧化修饰形成氧化型低密 度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，OX．LDL)，后者可以直接导致内皮细 胞损伤【51。近年来的许多研究己证实，血管内皮功能损伤是AS形成早期的始动环 节【61。血管壁尚未形成明显斑块时，血管内皮功能就已经受到了损伤【71。另有研究 证实：在粥样斑块中平滑肌细胞及巨噬细胞中都有血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowthfactor，VEGF)强表达，VEGF阳性细胞数目与内膜血管化程 度呈正相关，且分布与新生血管的分布高度一致【8】。 7 福建医科大学硕上学位论文 CNV的产生主要依靠脉络膜毛细血管内皮细胞和周细胞的作用。在体外细 胞培养中，单独的血管内皮细胞就能形成毛细血管管腔和血管分支并组装成完整 的毛细血管网，说明在血管形成过程中内皮细胞起主导作用【9】。 CNV的发病机制目前尚不清楚，主要有两种观点：一种认为与视网膜前新 生血管相似，系视网膜外层缺血的结果。另一种认为是RPECs代谢异常在基底 膜上形成玻璃膜疣破坏血一视网膜屏障所导致的结果。二者共同的步骤是：RPE 细胞、巨噬细胞等分泌的促进新生血管形成的细胞因子的增加，如VEGF，血管 生成素，低氧诱导因子，基质金属蛋白酶等。尤其VEGF是目前研究发现功能 最强的血管形成促进因子。研究表明通过抑制促CNV形成因子的作用，尤其是 抑制VEGF及其受体蛋白的表达、VEGF和受体的反应以及抑制信号的转导，可 明显抑制CNV的形成。这些结果将为CNV的治疗提供一定的理论基础。 本实验通过蛋白质、基因水平定性、定位、半定量研究，测定高血脂动物模 型脉络膜血管组织学改变及VEGF的表达，揭示高血脂对脉络膜血管的影响。 福建医科大学硕士学位论文 高血脂对脉络膜血管的影响研究 实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 一、实验材料 1、实验动物及分组 新西兰大白兔36只，月龄3个月，体重1．50-1．70kg，雌、雄兼可，健康无 眼病，由无锡市惠山江甫实验动物场提供，许可证号：SCXK(苏)2002．2006， 实验动物设施条件合格证：闽实动条准第01．18号。饲养条件：自然光线，室温 20--25"C，空气流通，相对湿度50---60％；动物分笼饲养，摄食普通颗粒兔饲料， 自由饮水。 实验分组：实验前行双眼前节和眼底检查未发现异常改变，称取体重。适应 性喂养一周后，将动物随机分为2组，每组各18只：①高脂组：高脂饲料喂养 (参照高脂喂养制造动脉粥样硬化模型的方式，高脂饲料配方如下：2％胆固醇， 5％猪油，10％蛋黄粉，0．5％牛胆酸钠，82．5％基础料。由福建省医学科学研究所 提供。)，其中喂养1个月组(G1)、喂养2个月组(G2)和喂养3个月组(G3) 各6只；②正常对照组：普通饲料喂养，其中喂养1个月组(C1)、喂养2个 月组(C2)和喂养3个月组(C3)各6只。 2、实验试剂 2．1免疫组化试剂 VEGF单克隆抗体(Ab．3，克隆号JHl21)美国Labvision-Neomarkers公司 鼠二步法检测试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 DAB试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 Harris苏木素液 迈新生物有限公司 柠檬酸抗原修复液 福州迈新生物公司 多聚赖氨酸玻片 福州迈新生物公司 PBS、过氧化酶阻断剂 福州迈新生物公司 二甲苯、无水乙醇、双蒸水，中性树胶等 国药集团化学试剂有限公司 2．2 RT-PCR实验试剂 9 福建医科大学硕士学位论文 RNA抽提试剂盒 TrizolReagent TaqDNA多聚酶 DNTPs PCR引物 PCRMarker 琼脂糖胶 DMSO(二甲基亚砜) 异丙醇、氯仿、乙醇 美国Fermentas公司 美国Ferment,as公司 美国Fermentas公司 美国Ferment,as公司 美国Invitrogen公司 纽英伦生物技术(北京)有限公司 深圳晶美生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司 美国G-ibco公司 均为国产分析纯 2．3主要试剂的制备 2．3．1DEPC水：吸出lml放在1000ml双蒸水中配成1％oDEPC水，放在1000ml 容量瓶静置4h备用。 2．3．275％乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放．20℃保存(其中DEPC水需 先高压)。 2．3．3 电泳缓冲液配制 10xTBE液． 1000ml Tris 1089 硼酸 559 0．5Mol／EDTA(PH8．O)4ml 先加800mlDEPC·H20，加热溶解后，再定容至1000ml。 2．3．4溴化乙锭(EB)配制 溴化乙锭 19 DEPC·H20100ml 磁力扰拌数小时以确保其完全溶解，分装至棕色瓶或锡箔纸包裹容器，室 温保存备用。 2．3．51．O％非变性琼脂糖凝胶 AgaroseI O．29 】xTBE 20ml lO 福建医科大学硕上学位论文 微波煮溶，待冷却至60—70。C时加入溴化乙锭2．5ul，混匀并将其到入制胶 板，待自然冷却； 2．3．6实验器皿准备 实验用的器皿均经高温烤干(180。C，3-4h)；离心管、吸头和enpendoff等 塑料制品，需经O．1％DEPC浸泡24h，再进行高压消毒、烘干；为了防止 RNA酶污染，取用所有的器材均需戴一次性手套。 2．3．7引物合成与设计 根据Pubmed上VEGFmRNA全长序列由由InvitrogenBiotechnology公司设 计、合成(上海英骏生物技术有限公司)，序列如下： 内对照13．肌动蛋白(p．Actin)： 上游引物：5．TCTACAATGAGCTGCGTGTGG．3 下游引物：5．GGAACCGCTCA=丌GCCAATG．3 扩增片段：497bp VEGF： 上游引物：5一GCCCATGAAGTGGTGAAGTr-3 下游引物：5．AATGCTTTCTCCGCTCTGAA．3 扩增片段：363bp 3、实验仪器 OLYMPUS显微镜 日本 日立Hu．12A型透射电镜 ’ 日本 LeicaRM2245超薄切片机 德国 切片漂烘温片仪 安徽电子科技研究所 DHG．9070A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司 HSG．IV2型电热恒温水浴锅 上海余姚天然仪器厂 HPIAS．2000高清晰度彩色病理图文 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 管理系统 中国华海公司 9700型PCR扩增仪 美国应用生物系统公司 紫外分析仪(UV-2000) 上海天能科技有限公司 生物电泳图像分析系统 美国BIO．RAD公司 福建医科火学硕士学位论文 低温高速离心机 JY3000+型多用途电泳仪 微量移液器 法国Hettich公司 美国PharmaciaBioteeh公司 美国THERMOFORMA公司 二、实验方法 1、高血脂动物模型的建立 高脂饲料喂养(参照高脂喂养制造动脉粥样硬化模型的方式，高脂饲料配方 如下：2％胆固醇，5％猪油，10％蛋黄粉，0．5％牛胆酸钠，82．5％基础料。)，其 中喂养1个月组(G1)、喂养2个月组(G2)和喂养3个月组(G3)各6只。 每只兔子进食高脂饲料1009／d；称体重1次／周；添加适量胡萝卜与青菜1次／2 周。在托吡卡胺散瞳下，手持检眼镜动态观察视网膜脉络膜血管，1次／周，操作 时动物在非麻醉、非刺激的安静状态下进行。处死前禁食12小时，取耳中央动 脉血lml，离心血清0．5ml，．70℃保存。酶法测定血清中总胆固醇(TC)、甘油 三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL．C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL．C)。 2、动物处死及标本采集 2．1电镜、免疫组化取材 两组动物分别于饲养后1个月、2个月、3个月以3％戊巴比妥30mg／kg麻 醉，处死后迅速摘除右眼球，于锯齿缘后O．5mm处剪开眼球壁，在垫有冰块的 平皿上迅速切除眼前节和玻璃体，在眼科显微镜下钝器解剖法分离视网膜及脉络 膜组织，右眼1／2视网膜脉络膜组织以视盘为中心切成1．5minx3．0mm长方形小 片，迅速固定于预冷的电镜液(福建医科大学电镜室提供)，4"C保存；送福建 医科大学电镜室常规制样，用透射电镜观察视网膜脉络膜血管超微结构；每个标 本观察2张切片。右眼剩余1／2视网膜脉络膜组织放于10％福尔马林中固定，待 石蜡包埋、连续切片。 2．2 RT-PCR取材 两组动物分别于饲养后1个月、2个月、3个月以3％戊巴比妥30mg／kg麻 醉，处死后迅速摘除左眼球，于锯齿缘后O．5mm处剪开眼球壁，在垫有冰块的 平皿上迅速切除眼前节和玻璃体，在眼科显微镜下钝器解剖法分离左眼脉络膜组 12 福建医科火学硕i：学位论文 织，速存于液氮速冻后．80℃保存，待提取脉络膜总RNA。 3、实验方法 3．1透射电镜步骤 3．1．1 前固定：3％戊二醛一1．5％多聚甲醛．0．1MPBS@H7．2)4。C数d(2h以上)； 3．1．2漂洗：O．1MPBS(pH7．2)3次。 3．1．3后固定：1％锇酸．1．5％亚铁氰化钾4℃1．5h； 3．1．4漂洗：0．1MPBS0H7．2)3次。 3．1．5脱水：50％酒精10min一70％酒精饱和醋酸铀染液4"C过夜一 90％酒精10rain一90％酒精．丙酮10min一90％丙酮10111i11一无水丙酮 10minX3次。 3．1．6浸透：①无水丙酮+环氧树脂618包埋剂(1：1)1．5h， ②纯618包埋剂35℃3h； 3．1．7包埋、聚合：35℃12h，45℃12h，60℃3d。 3．1．8切片、染色：超薄切片机切70—80nm的超薄切片；经醋酸铀、柠檬酸铅 分别染色5min，并蒸馏水水洗。 3．1．9在日立Hu．12A型透射电镜下观察并摄片。 3．2免疫组化步骤 3．2．1HE染色步骤 (1)切片在二甲苯中脱蜡10minx2； (2)无水酒精10min； (3)95％酒精10rain； (4)85％酒精10min； (5)70％酒精10min； (6)蒸馏水10rain； (7)苏木素染液染色5min； (8)水洗15mira (9)1％盐酸酒精分化10s； 13 福建医科大学硕十学位论文 (10)水洗15mira (11)伊红染液染色3mira (12)水洗30s； (13)70％酒精脱水20s； (14)80％酒精30s； (15)95％酒精lmin； (16)无水酒精2mira (17)二甲苯2min： (18)中性树胶封片。 3．2．2免疫组织化学二步法检i贝t]VEGF(所有的步骤均需在室温26。C条件下完成) (1)切片在二甲苯中脱蜡10rain×2； (2)无水酒精10mira (3)95％酒精10min； (4)85％酒精10mira (5)60％酒精10mira (6)蒸馏水15min；‘ (7)抗原煮沸修复20min(EDTA缓冲液，pH8．0)； (8)冷却20min： (9)PBS冲洗3minx3； (10)3％H，O，去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶； (11)PBS冲洗5minx3； (12)羊血清孵育15rain，封闭非特异性结合，纽进； (13)VEGF单克隆抗体孵育60min，26℃(一抗滴度为l：50)； (14)PBS冲洗5min×3； (15)羊抗鼠IgG抗体一HRP多聚体孵育20min，26。C； (16)PBS冲洗5rainx3； (17)DAB显色5mira (18)蒸馏水充分冲洗； 14 福建医科人学硕士学位论文 (19)苏木素复染20s； (20)水洗15mira (21)脱水、透明，中性树胶封片。 3．3 RT--PCR步骤 3．3．1RT．PCR(两步法) (1)总RNA提取取出脉络膜标本，采用Trizol一步法提取脉络膜组织总RNA， 并取少量样品作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析，其余．80℃冻存备用。 Trizol法提取脉络膜组织总RNA 取出分组处理的脉络膜组织 上 加lmlTRIzol |， 反复吹打(要彻底，后转至EP管) J， 颠倒混匀10次，室温5min(30℃孵育) 上 加氯仿1／5体积(O．2m1)(必须按总体积的1／5)‘ |， 颠倒混匀158，室温2-5min(30℃孵育) Jr 4"C，离心120009，15min 上 转上层水相(约400l-t1)于另一1．5mlEP管中 J， 加等体积异丙醇(约400-500rtl)，混匀室温10min 上 4。C，离心120009，10rain(30"C孵育) 上 福建医科大学硕j：学位论文 弃上清 |， 加冰预冷的75％乙醇(用DEPC水配)lml 工 4"C离心75009，5min ’L 弃上清，空气干燥5．10min(不能完全干燥) 上 溶于DEPC水中至20l-tl(101上l-201LLl) (可在55．60℃水中， 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，P0．05)；G2组脉络 膜组织中VEGF表达较对照组明显增强，经t检验分析组间差异有统计学意义 (P<0．05)；G3组脉络膜组织中VEGF表达较对照组明显增强，经t检验分析 组间差异极显著统计学意义(P<0．01)。 图12VEGFmRNA的表达 Fig．12 TheexpressionofVEGFmRNA ． 13-Actin ‘ VEGF 表3不同处理组脉络膜组织VEGFmRNA的表达情况(％，x±。) Tab-3TheexpressionofVEGFmI必Ainthedifferentgroupsofchorioid(％，x±s) 与c1组比较，+P>0．05；与c2组比较，AP<0．05；与c3组比较，★P<0．Ol； 福建医科人学硕十学位论文 1．400 1．200 1．000 蔓0．800 蜊 《0．600 0．400 0．200 0．000 时间(M) 口II-常对照绢口碜- 1．．．．．．．．．．．．．．．．．上 图l3不同处理组脉络膜组织VEGFmRNA的表达情况 Fig．13 TheexpressionofVEGFmRNAinthedifferentgroupsofchorioid 讨 论 年龄相关性黄斑变性(age．relatedmaculardegeneration，ARMD)是目前发 达国家最主要的不可逆的致盲性眼病，且呈逐年增加之势。在美国，此病是60 岁以上老年人视力丧失的首要病因【l】。在我国，随着人口的老龄化和卫生保健水 平的不断提高，发病率也越来越高。ARMD临床上分为干性和湿性两型，其中 干性以黄斑区地图状萎缩为特征；而湿性以脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成为特征，CNV又称视网膜下新生血管，是来自脉 络膜毛细血管的增殖血管。这种异常血管起源于脉络膜血管，通过Bruch膜的裂 口而扩展，在视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)下或神经上皮 下间隙内发展。由于异常的血管通透性，脉络膜新生血管极易发生出血和渗出， 继而形成瘢痕，造成黄斑区损伤，严重影响中心视力，甚至失明。因此，CNV 的形成是ARMD患者视力丧失的最主要原因。目前，ARMD的病因和发病机制 尚不明确。因此，探索ARMD尤其CNV形成的启动因素与发生发展机制成为 当前的研究热点之一。 —㈠㈠U 福建医科人学硕士学位论文 一、高血脂对脉络膜血管的影响 血脂主要是指血液中的中性脂肪，即胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。由 于甘油三酯和胆固醇都是疏水性物质，不能直接在血液中被转运，同时也不能直 接进入组织细胞中。它们必须与血液中的特殊蛋白质结合，以脂蛋白的形式才能 在血液中被运输，并进入组织细胞。因脂肪代谢或转运异常，血清中总胆固醇、 甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)过高或血清高密度脂蛋白(HDL)过低称为高 脂血症(Hyperlipidemia)[10】。高脂血症是现今严重危害人类健康的疾病。大量 研究表明，较高的TC、TG和LDL对全身各种血管均会造成损害。本研究应用 改良的高脂饲料喂养兔，结果显示血中TC、TG和LDL水平均明显高于普通饲 料喂养的兔，且血脂水平随喂养时间逐渐升高，从而成功建立了高血脂动物模型 以研究高血脂对脉络膜血管的影响。本实验选择大白兔作为动物模型，因其色素 上皮层缺少色素而充分暴露出脉络膜组织，我们能够同时观察到视网膜和脉络膜 两层血管和组织变化过程，这是选择兔为模型一个非常突出的优点。 血管内皮细胞【111(vascularendothelialcells，VECs)是连续被覆在全身血管 内膜的一层细胞群，是人体最大的、高度特化的、功能异常活跃的内分泌、旁分 泌及代谢器官，可分泌多种血管活性物质，对血管的增生、管壁的炎症修复、维 持血管壁张力和血液的流动具有重要的作用【12】。血管内皮细胞功能障碍将导致 血管的一系列继发性损害。由于血管内皮细胞直接和血液接触，很容易受到血液 中病理生理变化的影响，具有易损伤的功能性界面。因此，高血脂等损伤因子首 先作用于血管内皮，导致内皮细胞功能障碍(endothelialdysfunction，ED)。 不同类型的血脂对血管内皮的损害机制有所不同。低密度脂蛋白胆固醇 (LDL．C)对氧化很敏感，易被氧化成氧化型低密度脂蛋(oxidizedlowdensity lipoprotein,ox．LDL)。OX．LDL主要通过两种机制引起内皮细胞的损伤和功能障碍， 促进动脉粥样硬化的发展【13，14】。一是巨噬细胞通过清道夫受体识别并摄入 OX．LDL，进而被吞噬形成泡沫细胞，大量泡沫细胞聚集在内皮下即形成最早的AS 病变——脂质条纹；二是OX．LDL改变了内皮的多种功能。OX．LDL诱导内皮细胞 表达多种蛋白分子如黏附分子、单核细胞化学趋化蛋白．1、血管平滑肌生长因子 以及集落刺激因子，介导单核细胞对内皮细胞的黏附，导致内皮细胞的损伤【151。 氧化型胆固醇(oxysto'ols)增加亦可损害血管内皮细胞功能。氧化型胆固醇是 福建医科火学硕j二学位论文 胆固醇经氧化后产生的一类化合物，如3p．5a．6B．三羟胆固烷(Choltri01)等。其一 个明显的作用是对胆固醇稳态的调节，包括对胆固醇合成、分泌和代谢的调节。 此外，还影响神经鞘脂类的代谢，血小板的聚集，凋亡和蛋白质的代谢等作用【161。研 究发现，氧化型胆固醇对内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞有细胞毒作用，还能够 诱导淋巴细胞的凋亡【171。体外实验表明【18】氧化型胆固醇呈剂量和时间依赖性地 降低内皮细胞存活率，增加内皮细胞丙二醛(MDA)的生成，可引起内皮细胞的凋 亡。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发病机制的大量研究表明：高血脂可 以作为单一因素影响血管内皮功能，使血管内皮活化或损伤【l91。而内皮细胞受损， 血管内皮功能紊乱被认为是动脉粥样硬化发展过程的始动因素与中心环节【20】。 研究证实在动脉硬化病变的早期，血管壁尚未形成明显斑块时，血管内皮功能就已 经受到了损伤【2¨。由于脂质的浸润和氧化，造成内皮细胞损伤，从而引起平滑 肌细胞迁移和增殖等一系列血管壁病理改变。 脉络膜血管丰富，由3个血管层组成，即脉络膜毛细血管层、Sat-tier层和 Haller层。脉络膜毛细血管与系统循环的毛细血管不同，管壁薄，管径大，具有 窗孔结构，直径大于200A的物质也可畅通无阻。此外，脉络膜血流量要高于全 身其他组织器官，是脑组织血流量的10倍【221。这些特征决定了脉络膜血管受血 液理化性质的影响较大。本研究结果证实高血脂同样可以通过损害血管内皮细胞 而对脉络膜血管造成不良影响。随高脂喂养时间增长，脉络膜毛细血管内皮病变 加重，喂养3个月可出现：血管内皮细胞肿胀、变形，吞饮泡减少，细胞核形态 极不规则，异染色质边集。内皮细胞间连接破坏；基底膜节段性增厚，质膜不连 续；管腔变窄、甚至闭塞；管壁脂滴增多，可见泡沫细胞。这些结果表明高血脂 作为单一因素可以造成脉络膜血管内皮细胞的变性，物质转运功能和分泌功能的 下降。而脉络膜毛细血管管腔变窄、甚至闭塞可导致组织缺血缺氧，缺氧是公认 的脉络膜新生血管形成首要原因。因为在超声多普勒、OCT等检查中已经发现， 部分患者的脉络膜血流量显著减少，而Bmch膜却异常增厚，推测脉络膜局部血 流减少以及脉络膜至视网膜色素上皮与神经上皮的氧弥散障碍造成的缺氧，是引 起脉络膜新生血管形成的始动因素。 ARMD是一种由多因素引起的疾病，发病机制众说纷纭。目前主要有以下几 种学说：视网膜色素上皮衰老机制，氧化损伤机制，血管模式机制和遗传学机制。 福建医科大学硕上学位论文 血管模式机制认为：ARMD是一种血管性疾病，以原发性脉络膜血管灌注异常为 主要特征，继发视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepitheliumcells，RPECs) 损害，从而导致ARMD。随年龄增加，机体组织器官普遍进行性脂质浸润、硬化， 眼组织顺应性降低，脉络膜血管阻力增加、灌注降低，因此，无论眼供血减少还 是流体静脉压升高均可影响RPE对脱落的光感受器细胞外节膜盘中过氧化脂质 的加工处理和清除，从而引起玻璃膜疣形成、色素变化、地图状萎缩以及Bruch 膜的钙化和破裂。Bruch膜内层脂质日益堆积，可降低液压传导性，进一步损害 RPE的功能。升高的脉络膜毛细血管压、Bruch膜的破裂以及血管内皮生长因子 的共同作用可导致CNV的形成。因此，血管模式机制不同于衰老机制，认为 ARMD患者脉络膜血管变化是RPE损伤的原因而不是结梨21。此外，血管模式强 调了脂质浸润、动脉硬化和高血压在ARMD发病过程中的重要性，认为ARMD 与动脉硬化之间存在着相似的危险因素和发病机制【3】。该模式很好地解释了为什 么高血压、高血脂患者极易发生ARMD，与ARMD流行病学调查结果、临床发病 特点和组织病理学研究结果相符。而且，有关抑制素(Statins)和抗高血压药(如 ACEI和血管紧张素II拮抗剂)对ARMD有保护作用的报道也进一步支持了血管模 式H1。本研究表明高血脂可通过影响血管内皮细胞功能造成脉络膜血管的损害， 从而引起局部组织的缺血缺氧而在ARMD的发病机制中发挥重要作用。 二、高血脂对脉络膜VEGF表达的影响 VEGF是Ferrara等1989年从牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先提纯出 来的，根据其具有促血管内皮细胞有丝分裂活性而命名【23】。VEGF是一种具有肝 素结合活性的生长因子，其特异性地作用于血管内皮细胞，促进其增殖及新生血 管形成。它是最直接的血管内皮细胞促分裂素，并且作为血管生成旁分泌刺激因 子而被分泌【241。VEGF相关分子家族包含5个成员：分别是VEGF．C、胎盘生长 因子(Placentagrowthfactor，PLGF)、VEGF．B、VEGF．D和VEGF．E。其中VEGF．C 是研究最多的一类，其与VEGFl65有30％的氨基酸序列同源性，与VEGF受 体3结合，促进内皮细胞的增生和迁移。 VEGF的功能主要有以下4个方面：①VEGF是目前已知的功能最强的血管 内皮细胞促有丝分裂素，特异的作用于血管内皮细胞，诱导内皮细胞的增生、迁 移。(室)VEGF是维持血管内皮细胞存活的重要因