阿昔洛韦对KBV200细胞增殖抑制作用的研究及其意义

阿昔洛韦对KBV200细胞增殖抑制作用的研究及其意义 阿昔洛韦对KBV200细胞增殖抑制作用的 研究及其意义 第24卷第1期四川省卫生管理干部学院 V01.24No.1JOURNALOFSICHIJAI~ICONTINUINGEDUCATIONCOLLEGEOFM S 2005年3月 Mar.20o5 阿昔洛韦对KBV200细胞增殖抑制作用的 研究及其意义 郝瑞安,陈扬东,胡志坤 (成都青白江区人民医院普外科,四川成都610301) [摘要】目的:探讨癌症归属,证明癌症病因.方法:通过抗病毒药物阿昔洛韦对耐药肿瘤细胞(~v2oo)的抑制实 验,并对照化疗药物顺铂,5一Fu的抑制效果,证明肿瘤细胞中含有病毒核苷酸.结果:阿昔洛韦抑制KBV200细胞明显优 于顺铂,5一Fu,具有非常显着性差异(P3o<O.Ol,P4o<O.Ol,P5o<O.O1).而5一Fu与顺铂无显着性差异(P>0.05).结 论:恶性肿瘤是由病毒所致,恶性肿瘤细胞是由正常机体细胞与病毒整合而成的一种新的细胞. [关键词】阿昔洛韦;病毒;恶性肿瘤细胞 [中图分类号】11730.231[文献标识码】A[文章编号】1003—403x(2005)Ol一0003—02 ResearchonACVhahibittngKBV200CellandItsClinicalSignineanee./HaoRuian,ChenY angdong,HuZhikun,eta/.//De- partmentofGeneralSurgery,ThePeople'sHospitalofQingbaijiang,Chengdu,SichuanProv ince,610300,China. Abstract0bjeetlves:Toprovethecauseofcarcinoma.Methods:ThroughtheexperimentofA CVinhibitingKBV200cellandcomparing theeffectsofinhibitionwithCD-DPand5-Fu.wetriedtoprovethatnuc]cal"acidofvirusexist sinthecelloftumor.Results:Theeffect ofinhibitionwithACVwasbetterthanthoseofCD-DPand5-Fu(P3o<0.Ol,P4o<0.Ol, P5o<0.O1).However.theeffectofCD-DP Wiltssimil~lrtothatof5-Fu(P>0.05),Conclusions:Carcinomaiscausedbyvirus.Thema lignanttumorcellisakindofnewcellthat itisintegratedwithnormalcellandvirus. KeywordsACV;Virus;Nalignanttumorcell 恶性肿瘤是威胁人类健康的头号大敌,原因是恶 性肿瘤的发病原因至今尚无定论,而治疗上又全是治 标不治本,甚至基因治疗也是如此.加之现在又出现 了恶性肿瘤细胞的多药耐药(mort),更使肿瘤的治疗 蒙上阴影.鉴于目前尚无一种治疗方法是针对恶性肿 瘤病因的根本治疗,为此,我们综合百年来国内外大量 资料,在大量的科学事实基础上,进行科学的思维,提 出科学的假说,以期得到科学的结论.我们以KBV200 耐药细胞株为研究对象,采用blTr法检测阿昔洛韦对 该细胞株的增殖抑制作用,并分别对照5一Fu,顺铂对 KBV200细胞的抑制作用,从而证明病毒与肿瘤的关 系. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1KBV200细胞株由中国医学科学院血液学研究 所提供KBV细胞是用对长春新硷(VCR)敏感的KB 细胞为亲本,通过诱变剂甲基磺酸酯刺激,然后在培养 液中加入浓度递增的VCR诱导而得,在VCR浓度为 200nmol/L生长良好,采用含10%小牛血清,青霉素,链 霉素各lOOt.t/ml的RPblI一1640细胞培养液,在37?饱 和湿度5%CO2孵箱中常规培养,每3—4天换液传代 培养. 1.1.2药品与试剂 1.1.2.1阿昔洛韦药物为国产阿昔洛韦注射液,规格 为0.5/支. 1.1.2.2小牛血清(FBS)购自杭州四季一肝生物工程 材料研究所,56?加热半小时灭活,一20?存放备用, 临用前37~C融化. 1.1.2.3RPblI一1640培养液(GIBIoU.S.A)重节蒸水 配制,调节PH值为7.2,过滤除菌,4~C保存备用. 1.1.2.4青链霉素用无菌生理盐水配制成为1X105t~/ IIll,一20~C存放,临用前由RPblI一1640培养液稀释成 100ml. 1.1.2.5ra'rr(四甲基偶氮唑盐)购自北方同正生物制 品公司. 1.1.2.65一Fu和顺铂化疗药物为国产药物,规格分 别为0.25/支,lOmg/支. 1.2仪器和设备 1.2.1二氧化碳孵箱美国LRBODELCO2INCUBA. T0R 1.2.2超净工作台苏州净化设备厂 ?【作者简介】郝瑞安(1958一),男,汉族,山西人,副主任医师,硕士(肝癌方向). ? 3? 四川省卫生管理干部学院2oo5;24(1) 1.2.3倒置显微镜重庆光学仪器厂XSZ—D2 1.2.4酶标仪美国BIO—BADModel450型酶标仪. 1.3实验方法 1.3.1MTr法测定药物抑制KBV200细胞的药效方 法取对数生长期KBV20o细胞稀释液至1.5,2× io5/ml,于96孑L细胞培养板中培养1天.加药,继续培 养4天,弃去培养液,每孔加0.5n~ul的MTrlOOul,培 养4小时.弃去MTr,每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 ul,待溶解后于BIO—RADMode1450型酶标仪(570nm) 处测吸光度.其原理是,活细胞内线粒体脱氢酶能将 MTr转化为兰紫色衍生物甲,产物甲的颜色深浅(可以 用吸光度A值表示)与活细胞数成正比.因此,利用此 原理测定阿昔洛韦(ACV),5一氟脲嘧啶(5一Fu)和顺铂 (CD—DP)作用肿瘤细胞后A值变化,并计算肿瘤存活 率.从而预测各药物对肿瘤细胞的抑制作用. 肿瘤细胞抑制率(%)=[1一实验孔吸光度(A)/对 照孔吸光度(A)]×100%. 1.3.2M,rr法测定ACV,5一Fu和DDP对KBV20o 细胞的抑制作用,处理中分别加入不同浓度的ACV, 5一Fu和DDP. 1.4统计学处理 采用t检验方法,每次所得结果均为3次重复试 验的孟?s. 2结果 2.13种常见药物对KBV200细胞的抑制作用见表1 , 3和图1,3. 表1阿昔洛韦对KBV2~细胞的抑制作用 ?4? 图1ACV对KBV200细胞的抑制作用 表25一Fu对KBV200细胞的抑制作用 /一' lovadnfl20删aova~4ovcAm3ovgtml 图25一Fu对KBV2O0细胞的抑制作用 表3DDP对KBV200细胞的抑制作用 600O96 50.0O96 41).0O96 30.00% 20.0O96 10.0O96 0.00% /, lV.g/l'nl2;tg/ml珥'gfnu4t*qg/ml石Ilg,lTIl 图3DDP对KBV200细胞的抑制作用 从表1,图1可以看出,ACV对KBV200细胞有较 强的抑制作用,且随着浓度的增加抑制作用也增加,在 50vg/ml浓度时,抑制率高达88.8%,而表2,图2和表 3,图3可显示5一Fu和DDP均对KBV200细胞有抑制 作用,在低浓度时,即可使抑制率达37.9%和36.10%, 但随着浓度的增加,其抑制率增加不明显,在高浓度 时,其对KBV200细胞的抑制率分别为47.0o%和 52.3%. 2.25一Fu和CDDP对KBV200细胞抑制作用的比较 见表4. 表45一Fu和CDDP对KBV200细胞抑制作用的比较 5一Fu和CDDP对KBV200细胞抑制作用无显着性 差异(P>0.05). 24卷1期郝瑞安'陈扬东'胡志坤:蔫20o细胞增殖抑制作用的 2.3ACV对KBV200细胞抑制作用与5一Fu和DDP 比较见表5. 表5ACV对KBV200细胞抑制作用与5一F?和DDP比较 类别ABCDEF ACV028.7038.9072.0087.3088.80 5一Fu037.938.4046.8047.8047.00 CDDPO36.149.705O.005O.0052.00 P5>0.05>0.05>0.01<0.01<0.01 PC>0.05>0.05>0.01<0.01<0.01 ACV在中高浓度时对KBV200细胞抑制明显高于 5一Fu和DDP,有非常显着性差异.PD<0.01,PE< 0.01,PF<0.01,故对肿瘤细胞有直接抑制作用,同时 证明肿瘤细胞与病毒有直接关系. 3讨论 MTr法是评价肿瘤细胞生存状态较为推崇的方 法,它不仅操作简单,快速,特异性强,灵敏度高,结果 重复性好,要求设备简单,成功率高,易于推广,而且可 在肿瘤细胞镜下外形尚无明显变化时,通过细胞内使 MTI"转化为甲的脱氢酶类活性来反映肿瘤细胞的变 化,减少人为因素参与.同时,MTI"法在短期试验中所 观察到的结果比计数更为精细,适用于各种肿瘤细胞 株,实体瘤的体外肿瘤药敏试验[,. 本实验以长春新硷诱导的KBV200耐药细胞为研 究对象,其结果更具说服力,即对耐药细胞株有效,对 非耐药肿瘤细胞更有效.本实验结果显示,ACV对 KBV200细胞有明显的抑制作用,这一结果的产生,是 否可以反证肿瘤细胞中含有病毒DNA成份,即肿瘤细 胞就是由病毒和正常细胞组成的,为此,我们讨论如 下. 3.1致癌三大因素的辩证关系 关于恶性肿瘤发生的原因,目前较为肯定的是三 大类因素t物理的,化学的和生物的因素.但是从宏观 上来看,生物的因素不存在时间和空间的差异,即无处 不在,无时不有,而物理,化学因素存在时间和空间的 差异;从微观上,生物因素致癌可以不包含物理的和化 学的因素,如:1911年Rous肉瘤病毒致肿瘤,而化学的 和物理的因素致癌不能除外生物的因素,如:1915年 Yamagiwa和Ichikama反复用煤焦油擦兔耳诱发皮肤 癌,并证实为多环芳香烃致癌,不能除外兔体内的生物 因素.由此可知即使物理,化学因素致癌也离不开病 毒因素,包括生物因素中黄曲霉素致肝癌也离不开肝 炎病毒J,病毒才是导致癌症的罪魁祸首,摄食黄曲霉 素或其他毒素与居民肝癌也未曾建立起因果关系E4】. 3.2病毒致癌的解释性 恶性肿瘤的发生,发展过程中存在至今令人费解 的许多疑问,如:与遗传的关系,自愈性,带瘤病人,肿 瘤休眠,旁观者效应,干扰素治疗肿瘤的有效和无效性 等,化学的,物理的致癌因素不能解释,唯有病毒的致 癌因素可以解释清楚5.几乎所有鼻咽癌,肝癌等均 可以从癌组织中分离出相关病毒基因E6,7,sJ,更证明病 毒致癌,也是本实验中阿昔洛韦有效抑制KBV200细 胞的机理所在.' 3.3病毒致癌符合炎症反应 病毒致癌即是病毒在机体内寄生,复制,一旦整合 在正常机体细胞核内后,即无止境地复制.既然是病 毒感染,虽然理论上讲可以无止境地复制,但它也符合 感染范畴,也存在自愈性,慢性,急性概念,也存在SIRS 和CARS的概念,正是存在自愈和慢性过程,所以才有 带瘤病人和肿瘤休眠,正是存在SIRS,CARS,所以,才 有干扰素等细胞因子的有效和无效. 3.4病毒致癌的难治性 恶性肿瘤细胞是由病毒基因与正常机体细胞组成 的一种新型细胞,它具有病毒与正常细胞的双重性,就 机体免疫而言,它是自身细胞,如:壳上有正常细胞的 脂质层,可以逃避免疫攻击,而作为病毒属性而言,目 前又无一种药物可以杀死病毒,原因之一也可能是病 毒寄生于细胞内,乃至整合为一体.所以,攻克癌症之 时,可能期望于有效的抗病毒药物问世之日. 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