猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布的研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布的研究 猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸在仔猪呼吸 及繁殖系统动态分布的研究 中国兽医杂志2002年(第38卷)第2期 猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸 在仔猪呼吸及繁殖系统动态分布的研究 任慧英,杨汉春,高云 (中国农韭大学动物医学院,北京海淀100094) 摘要:应用针对PRRSVATCCVR一2332株基因组ORF6片段的463bp的eDNA探针,对45 日龄SPF仔猪分 别人工感染ATCCVR一2332株及北京分离株B.后不同时间呼吸系统及繁殖系统组织中病 毒棱酸的分布进行了 研究.结果显示,在感染后30h.即可在鼻黏膜,气管,肺脏,睾丸,附睾,精囊,前列腺,子宫,扁桃体 等组织中捡出阳 性杂交信号,且一直持续到感染后28天.其中扁桃体中病毒的数目远多于呼吸系统及繁殖系 统组织中的数目,说 明扁桃体可作为活体检查的目的器官之一. 关t词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;原位杂交;呼吸系统;繁殖系统I扁槐体 中图分类号:$858.285.3文献标识码:A文章鳊号:0529—6005(2002)02—0003—02 Studiesonthedynamic reproductiveandrespiratory inreproductiveand distributionofporcine syndromevirusnucleicacid respiratorysystems RENHui—ying,YANGHan—chun,GAOYun (CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China) Abstract:A463bpcDNAprobewasobtainedaccordingtoORF6ofPRRSV.Studiesonthe distributionofPRRSVinreproductiveandrespiratorysystemsinpigletsartificiallyinfectedwithPRRS V ATCCVR一2332andBJ一 4isolaterespectivewereperformedbyusingtheprobe.Itwasshownthatnasal mucosa,trachea,lung,testis,epididymes,glandulaprostata,seminalvesicle,wombandtonsilwereposit ive at30hpost—inoculationandthepositivesignalsinthesetissuesexisteduntiItheterminationofexperime nt (28dpi).Signalsintonsilweremuchmorethanthoseinreproductiveandrespiratorysystems,which indicatedthattonsilcouldbeusedfordetectingofPRRSVinlivingpigs. Keywords:PRRSV;in—situhybridization;respiratorysystem;reproductivesystem;tonsil 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由动脉炎病毒 科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)引起,临床主要 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现为呼吸困难及繁殖障 碍.对该病的诊断主要集中在血清学方面,然而由于 抗体的出现远在感染之后,应用血清学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 对早期 感染的检测显得尚不理想.对该病的血清学调查发 现,猪群中血清阳性率很高.因此,寻找一种切实可 行的病原学诊断方法对该病的早发现,早预防尤为 重要为此我们应用原位杂交技术对病毒核酸在体 内的分布进行了研究,现将病毒在呼吸系统及繁殖 收藕日期:gO00—11—26 系统的分布情况报告如下. 1材料与方法 1.1病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV ATCCVR一2332及北京分离株BJ一4由中国农业大 学动物医学院传微教研室提供. 1.2棱酸探针应用PRRSVATCCVR一2332株 基因组为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 制备针对0RF6片段的cDNA探针, 探针全长463bp,经敏感性与特异性检测合格后备 用[. 1.3病料来源4头SPF仔猪45日龄时鼻内人工 感染ATCCVR-2332株(TCIDso为10),另外4头 中国兽医杂志2002年(第38卷)第2期 SPF仔猪45日龄时鼻内人工感染PRRSV北京分 离株Bs.,感染剂量为2ml/头,实验设对照猪2头. 分别于感染后3Oh,7天,17天,28天宰杀,采取肺 脏,气管,鼻黏膜,睾丸,附睾,前列腺,精囊子宫,旆 桃体等组织,制备多聚甲醛固定,石蜡包埋的组织 切片. 1.4原位杂交检测(1)将切片脱蜡,人水后晾干. (2)切片经0,2mo!/LHCl处理10min后经DEPC 水及PBS各洗涤1次.(3)用2Ommol/LTrisHC1 和2mmo|/LCaC17(pH7.4)37C作用切片10min. (4)用10~g/ml的蛋白酶K溶液37C作用切片 30min(5)0.2甘氨酸作用切片5min终止蛋白 酶K的作用,并用PBS洗涤2狄.(6)用吉5O去 离子甲酰胺,5×SSC,2封闭贮存液,0,02SDS, 100gg/ml鲑鱼精DNA的预杂交液42C作用1h (7)用含5O去离子甲酰胺,5×SSC,1O硫酸葡聚 糖,2封闭贮存液0.02SDS,100gg/ml鲑鱼精 DNA及3ng/~l的杂交液42C杂交20h,同时设不 加探针的阴性对照.(8]切片经2×SSC,60甲酰胺 52C洗绦2次,每次15min再经0,1×SSC室温洗 涤2次,每次15min.然后接Dig标记及检测试剂盒 提供的方法进行显色.(9)切片经95,100乙醇 快速脱水,晾干后.用中性树胶封片. 2螭果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 2.1桉酸阳性细胞的特点对照猪各组织中除鼻 黏膜及气管的软骨部分有轻微弥漫性非特异性着色 外,其余背景均为淡棕色,感染猪各组织中均出现阳 性杂交信号,阳性细胞为紫蓝色,有的整个细胞呈紫 蓝色圆形,有的细胞外周呈紫蓝色环形或半环形,中 心浅棕色或淡紫色.由于PRRSV为RNA病毒,病 毒的装配在细胞浆中进行,所以有的细胞阳性信号 在胞浆呈环形;而病毒核酸的复制又发生在细胞核 内,所以有的细菌阳性信号在整个细胞中存在呈 圆形. 2.2PRRSV核酸阳性细胞在组织中的分布人 工感染后30h.均可在各待检组织中检出阳性杂交 信号.其中以鼻黏膜最多,20倍物镜下每个视野可 见6,8个阳性信号,肺脏气管,睾丸,附睾,前列 腺,精囊,子宫等组织中可见1,3个阳性信号,扁桃 体中阳性信号为8,l0个;人工感染后7天,l7天, 28天这些组织中的阳性信号持续存在,但鼻黏膜中 的阳性信号数目逐渐减少至每个视野1个或很少发 现,其余组织中的阳性信号数目没有太大变化,扁桃 体中阳性信号数目基本不变.两种不同来蔼c的病毒 攻击后各组织中阳性信号的检出数目没有太大差 别. 3讨论 3,l本研究在人工感染猪的呼吸系统及繁殖系统 中均检出病毒阳性杂交信号,说明病毒可以通过呼 吸系统及繁殖系统传播,尤其是子宫及睾丸,附睾等 组织中病毒的存在证实该病可以垂直传播. 3.2从各组织中阳性信号的检出情况看,旆桃体中 的阳性信号一直保持很高的数目,而鼻黏膜中的阳 性信号在感染初期比较多,随后下降,肺脏,气管,睾 丸,附睾,精囊,前列腺等组织中的阳性信号一直保 持很少的数目,关于肺脏的试验结果与昊东来等0 的报道相一致.而与Larochelle等的报道存在较 大差异.分析其中的原因,可能是呼吸道的症状及相 应器官的病变程度会造成结果的差异.试验中所用 两种病毒对猪只感染后均未出现明显呼吸道症状, 剖检也未发现明显病变,可能由于病毒毒力比野毒 有所下降所致,这一结果与许多文献的报道存在差 异.近几年国内流行的PRRS感染中呼吸系统的特 征性症状并非100的出现,所以肺脏的原位杂交 检测结果不能作为检测该病的惟一指标扁桃体中 的阳性杂交信号数目很多,又可以进行活体取样,所 以对可疑猪群的PRRS检测无疑会是1种非常简 便,灵敏的方法. 3.3许多文献【’对RNA病毒的原位杂交检测都 有严格要求,尽量防止RAase的污染,要求所有溶 液均用DEPC水处理,对实验操作也有极为严格的 要求作者经过几十次的原位杂交,认为RNase不 象文献中描述的那样可怕,采用灭菌的洁净器皿,高 压灭菌水.不用手直接接触组织及切片,即可得到良 好的效果.本次试验在人工感染后30h即可在组织 中检出阳性信号.希望在不久的将来,原位杂交技术 能以其灵敏度高,易于操作等特点广泛应用在疾病 的早期诊断上. 参考文挟, [】j任慧英.李文立,橱汉春,等靖繁殖与蜉暇综合征病毒eDNA 探针的制备及初步应用口]-中国兽医学报,2000,20(9);4aB一 44O. [2_吴东米.郭宝清.孪桂芝,等.猪生殖呼嗳道综合征病毒抗原在 胎及新生仔猪体内的丹布[J].中国硬防兽医学报,i999-21 (2):128—129. :3]LaroehelleR,MagarRDiJ’erent]ationolNorthAmerkanand Europeanporcinereproductiveaadrespiratorysym:Iroraevirus genotypesbyinsituhybridization[JjJournalofVirology Methods.1997.68(2):161—168. [4]苏意慈.原位杂交[M].北京:中国科学拄术出版社,1994.