苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响 苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平滑肌细 胞增殖的影响 第13卷第3期 2004年9月 中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESEJOURNALOFHIS2DCHEMISTRYANDCYqDCHEMISTRY V01.13.No.3 Sep.2004 苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平滑肌 细胞增殖的影响 赵荫涛赵春霞汪培华汪道文 (华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,武汉430030) [摘要]目的探讨苯扎贝特对体外培养的牛血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecells,VSMC)增殖的影响, 以及可能的信号转导通路.方法采用改良的贴块法培养小牛胸主动脉VSMC,a-acfin单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定 培养细胞.以MTT法反映VSMC增殖情况;用WesternBlot方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 与细胞增殖有关的丝裂原激动蛋白激酶(MAPK) 信号传导通路.结果苯扎贝特呈剂量依赖性抑制VSMC增殖,其抑制增殖的作用主要是通过MAPK传导途径.结论 苯扎贝特通过抑制VSMC增殖可能参与延缓动脉粥样硬化及经皮冠状动脉腔内成行术(percutaneoustransluminalcoronary angioplasty,PTCA)术后再狭窄的发生,发展. [关键词]苯扎贝特;血管平滑肌细胞;增殖;动脉粥样硬化 (中图分类号]R322.121(文献标识码]A ECI.sOFBENZAF?IRAIEONPROL?:RAT【ONOFCI7I爪瓜EDBOVDE VASCUI.ARSII)0mMUSCLECELLS ZhaoYintao,ZhaoChunxia,WangPeihua,WangDaowen (DepartmentofCardiology,丁'0iHospital,丁'0MedicalCollege,Huazhong UniversityofScienceandTechnology,^口430030,China) (Abstract~ObjectiveTostudywhetherbenzafibratecanmarkedlyinhibittheproliferationofcul- turedbovinevascularsmoothmusclecells(VSMC)invitro.MethodVSMCwereharvestedfromthoracic aortaofyoungcattlebyusingthemodifiedexplantmethod.Theimmunohistochemica1techniquewasused toidentifytheVSMCTheeffectsofbenzafibrateontheproliferationofVSMCwereexamined,bymeans ofcountingcellsandMTTrespectively.MAPKproteinwasmeasuredbywesternblotanalysis.Result BezafibratemarkedlyinhibitedtheproliferationofVSMC(P<0.05),andtheinhibitoryratewas8.5, 29.8inM_TTassay(P<0.01).WesternBlotindicatedthatthephosphorylatedMAPKandtherelated ratioofphosphory1atedtotota1MAPKgraduallydecreasedwiththeincreaseinbenzafibrateconcentration (P<0.05)attheprotein1eve1.ConclusionBenzafibratecansignificantlyinhibittheproliferationofcul, turedbovineVSMCinadose-dependentmanner.andthisefffectmaybemediatedinpartthroughthesig- nalconductivepathwayofMAPK. (KeyWords3Benzafibrate;Vascularsmoothmusclecel1;Proliferation;Atherosclerosis 过氧化物酶体增生物激活受体仅(PPAR仅)是 细胞核激素受体超家族中的一员,作用非常广泛, 涉及脂质代谢和炎症反应,抗动脉粥样硬化作用 [收稿日期]2004-05—2O[修回日期]2004--05—25 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30270561) [作者简介]赵荫涛,男(1980年),汉族,硕士研究生. *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) 等[1].大样本临床研究发现,应用PPARa激动剂 能明显延缓冠状动脉粥样硬化病变的进展,显着降 低心血管病死亡率和减少心血管事件的发生C2.3], 但是关于PPARa作用机理的认识和研究明显不 足.贝特类调脂药如苯扎贝特是人工合成的 PPARa的配体,由于其有效的调脂作用已广泛用 于冠状动脉疾病的治疗和预防.苯扎贝特可降低血 浆甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL)水乎 276中国组织化学与细胞化学杂志第13卷 (尤其是小密度LDL)并升高高密度脂蛋白 (HDL),这些作用部分解释了PPARa激动剂的抗 动脉粥样硬化作用.但是这种调脂作用是否为其抗 粥样硬化的主要作用,是否存在调脂外作用,目前 还未见报道.研究表明血管平滑肌细胞(VSMC) 增殖是引起动脉粥样硬化(AS)和经皮冠状动脉 腔内血管成形术(PTCA)后再狭窄病变的重要原 因,也是AS斑块形成的一个主要病理基础_4J.因 此本实验通过观察苯扎贝特对VSMC增殖的影响, 探讨了其调脂外作用,进而为动脉粥样硬化和PT— CA术后再狭窄的贝特类药物治疗提供实验依据. 材料和方法 1.材料和试剂 小牛胸主动脉来自屠宰厂,苯扎贝特(benza— fibrate)由AmershamPharmaciaBiotech公司生 产,江苏先声药业集团馈赠;DMSO和四唑盐 (M1vr)购自Sigma公司;DMEM培养基,小牛 血清,胰蛋白酶和胶原酶等均购自GIBCO公司; 抗a—actin单克隆抗体,抗MAPK抗体和抗磷酸化 MAPK抗体购自NEB公司(NewEnglandBiola— bs);辣根过氧化物酶羊抗兔IgG抗体购自Jackson 公司;Western杂交显影化学发光试剂(ECL)购 自美国Pierce公司. 2.实验方法 2.1小牛VSMC的原代培养:取新鲜小牛 胸主动脉,分离脂肪,筋膜,结扎肋间动脉,灭菌 生理盐水反复冲洗后结扎主动脉远端,翻转主动 脉,灭菌生理盐水冲洗,撕开血管内膜,取中膜平 滑肌层剪碎成lmm.的组织块.将组织块移至离心 管内加人3,5ml胶原酶(3mg/m1),37?培养箱 内消化过夜,离心弃胶原酶,1×PBS溶液洗一 次,随后将消化后的细胞和组织块转到培养瓶内加 入含2O小牛血清的DMEM,于37?,5CO2 培养箱密闭培养,1周左右可见VSMC生长,3周 后细胞生长融合后用0.25胰蛋白酶消化,传代 培养. 2.2VSMC鉴定:光学倒置显微镜下观察细 胞形态及a—actin单克隆抗体免疫组织化学染色鉴 定培养细胞. 2.3细胞毒性实验:生长良好的VSMC接 种于24孔板,融合生长呈单层后加人终浓度为5 — 200fzmol/L的苯扎贝特溶液培养48h,台盼蓝 染色,细胞计数. 2.4实验分组:(1)对照组:加人DMSO; (2)给药组:分别加人终浓度为5—100pmol/I苯 扎贝特(溶于DMSO中). 2.5细胞增殖的检测:选用2,5代细胞, 消化收集细胞,调整VSMC密度至5×1O/mL以 每孔200l接种于96孔板,用含2O的小牛血清 DMEM培养至细胞近7O,8O汇合,用无血清 DMEM培养24h(使细胞同步于G0期).按以上 方案给药仍用2O的小牛血清DMEM培养10h后 加人MTT溶液(5mg/m1)10l,37?继续培养 6h,吸弃上清液,每孔加人100lDMSO,用全 自动酶联免疫检测仪在490nm波长下测定各孔吸 光值(OD值),每组重复设六孔. 抑制率(%)一壁碧×oo0A 2.6WesternBlot检测MAPK表达:不同 终浓度苯扎贝特处理细胞后,用细胞裂解液裂解细 胞后收集蛋白质并测定蛋白浓度,等量蛋白质采用 8SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,然后 转至PVDF膜上,室温下摇动封闭(TBS-T+5 脱脂奶粉)2h后,加人特异的兔抗磷酸化的 MAPK(p-MAPK)4X2过夜,室温下洗膜后加人 辣根过氧化物酶(HRPO)偶联羊抗兔IgG温育 (1:8000稀释),洗膜后与HRP底物反应,最后 用化学发光底物进行发光显迹,经比较特异性条带 的强度确定苯扎贝特对MAPK蛋白表达的影响. 同一张膜经处理后再和总的MAPK单克隆抗体(1 :500)反应,检测总MAPK的表达情况. 2.7统计学分析:结果以均值土标准差表 示,数据处理采用方差分析和q检验. 结果 1.VSMC培养鉴定结果:培养的VSMC生长 良好,常为长梭形,三角形和星形,逐渐重叠生长 可达多层,并呈VSMC特征性的"谷一峰"状.0t— actin单克隆抗体免疫组织化学染色均为阳性(图 1),证实培养的细胞均为VSMC. 第3期赵荫涛等苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平精肌竺望竺墅 图1培养细胞Q-actin免疫组织化学染色(DAB显色苏术翥复染)X100 Eg.1~e-aet[nimmuno]~istoehemlealstalnlz~gofincubatedce]ls(DABstainingandcounte rstainedwiLh]lematoxy]in).X100 2.细胞毒胜实验结果:200,umol/I以下浓度 的苯扎贝特对VSMC生长无毒性反应,VSMC存 活率达95以上 3.细胞增殖的检测结果:MTT法检测结果 显示苯扎贝特能明显抑制VSMC的增殖,如表1 所示:不同浓度的苯扎贝特对VSIvlC均有一定的 抑制作用.随浓度增加,其抑制作用亦逐斯增强 (P<0.01). 表1不1吾j浓度摹扎贝特对VSMC增殖的影响 Table1TheeffectofdifferentconcentrationofbenzafibrateonproliferationofVSMC(.r--s) 与对照组比较(comparedwithcontrolgroup)*P<O.叭 中国组织化学与细胞化学杂志第13嚣 4.苯扎贝特对MAPK表达的影响:不同浓度 苯扎贝特孵育牛主动脉平滑肌细胞l0小时后,用 抗磷酸化N~&PK和总MAPK抗体进行Western Blot杂交分析后所见条带如图2A所示.磷酸化的 MAPK条带强度随苯扎贝特浓度的增加呈剂量依 赖性减弱,而总MAPK条带强度无明显变化.并 图2A 且同过GeneTools密度分析软件扫描WesternBlot 条带后所得不同浓度苯扎贝特作用下的磷酸化 MAPK同总MAPK条带密度比值,分析结果显示 苯扎贝特剂量呈依赖性下调磷酸化MAPK蛋白质 的表达(觅图2B) ??, ?_?1_,-?'-—-一p-MAPK 05l02550100 图2B 12 1. l 暑 量. 皿 .2 0i3 MAPK 图2不同浓度苯扎贝特对牛主动脉平滑肌细胞磷酸化E~&PK(上)和总MAPK表达的影响.图2A:V,restem Blotting显示的不同浓度苯扎贝特作用后平滑肌细胞中磷酸化MAPK(上)和总MAPK的表达;图2B:为采用G趴e— Tools密度分析软件进行密度扫描后各淮度磷酸化MAPK同总MAPK密度的比值.(与对照组相比,*P<0.05) Fig.2TheeffectofdifferentconcentrationbezafihrateO1lexpressionofFMAPKandtotalM APKinvascu【arsm00ch musclecellsFigure2A:expressionofp-MAPKandtotalMAPKinvasco]arsmoothmusclece llstreatedwithdiffere口tcon centratlonhezafihrate.Figure2B:densltoraetrieanalysisoftheratioofp-MAPKtOtotalMA PKanalyzedbyGeneToo1sden— s[tyanalysissoftware(comparedwithcontrolgroupP<O.05) VSMC增殖是动脉粥样硬化及血管成形术后 再狭窄等病变形成的病理基础之一.而观察表明, 患者在行PTCA术后3,6个月有30,50的再 狭窄率.然而迄今尚无有效的药物治疗.因此能有 效抑制VSMC增殖的药物将可能成为临床上治疗 动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄的重要手段. 第3期赵荫涛等.苯扎贝特对培养的牛主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响279 过氧化物酶体增生激活受体a(PPARa)是细 胞核激素受体超家族中的一员,作用广泛,涉及脂 质代谢和炎症反应,抗动脉粥样硬化等.苯扎贝特 属于纤维酸衍生物类调脂药,是人工合成的 PPARa配体,作为人工合成的PPARa配体,苯 扎贝特能激活核膜上的PPAR~,促进或抑制与脂 代谢相关的多种基因的表达[5].苯扎贝特还通过增 加参与血浆脂肪酸代谢的蛋白(脂肪酸转运蛋白, 酰基一CoA合成酶等)和脂蛋白脂肪酶的合成及减 少ApoC-HI的合成,降低血浆甘油三酯;通过促进 ApoA工和ApoA?的合成增加血浆HDL—C水 平,同时也诱导HDL受体过度表达,从而增加细 胞胆固醇外流[6],发挥良好的调脂作用.最近研究 发现PPARa激动剂还具有许多调脂外的作用,如 能明显抑制TNFa刺激引起的血管炎症反应,通 过抑制转录降低血浆PAL1及纤维蛋白原水平, 从而减少血管壁炎症介质的释放和炎症细胞向血管 壁的趋化,聚集等[7].而本研究在培养的牛 VSMC中首次发现,苯扎贝特能非常有效的并呈 剂量依赖性地抑制VSMC的增殖,苯扎贝特的这 一 调脂外作用为治疗和预防动脉粥样硬化斑块和 PTCA术后再狭窄提供了一个很好的方向. 丝裂原激动蛋白激酶(mitogen—activatedpro— teinkinase,MAPK)通路是VSMC增殖调控信号 传导通路中最关键环节.VSMC胞浆内的MAPK 能被血小板源生长因子(PDGF)等多种细胞因子 激活,活化的MAPK(磷酸化的MAPK)能强烈 地刺激细胞增殖[9].因此本研究主要观察了苯扎贝 特对VSMCMAPK表达的影响,结果表明苯扎贝 特干预后,细胞磷酸化的MAPK的表达随着药物 浓度的增加而逐渐减弱,而总MAPK的表达无明 显变化;通过各浓度磷酸化的MAPK同总MAPK 密度比值分析显示,用药组与对照组相比显着降 低.这一结果表明MAPK途径可能参与了苯扎贝 特抑制VSMC增殖的效应. 总之,本研究结果显示苯扎贝特可明显抑制 VSMC的增殖,而MAPK磷酸化水平的降低可能 参与了这一过程.因而为其在防止动脉粥样硬化病 变恶化及血管成形术后血管再狭窄等作用的应用提 供了理论依据. 参考文献 (13EhrmannJJr,VavrusovaN,CollanY,eta1.Peroxi— someproliferator-activatedreceptors(PPARs)inhealth anddisease.BiomedPapMedFacUnivPalackyOlo— moucCzechRepub,2002,146(2):11-14 [2]Diabetesatherosclerosisinterventionstudyinvestiga— tors.Effectoffenofibrateonprogressionofcoronary- arterydiseaseintype2diabetes:thediabetesathero— sclerosisinterventionStudy,arandomisedstudy.Lan— cet,2001,357(9260):905-910 (33RubinsHB,RobinsSJ,CollinsD,eta1.Gemfibrozi1 forthesecondarypreventionofcoronaryheartdiseasein menwithlowlevelsofhigh-densitylipoproteincholes— tero1.NEnglJMed,1999,341(6):410-418 (43RossRThepathogenesisofathemsclerosis:aperspec— tiveforthe1990s.Nature,1993,362(6423):801—809 (53FruchartJC,DuriezP,Staels&Molecularmechanism ofactionofthefibrates.JSocBio1,1999,193(1): 67—75 (6]StaelsB,DallongevilleJ,AuwerxJ,eta1.Mecha— nismsofactionoffibrateson1ipidandlipoproteinme— tabolism.Circulation,1998,98(19):2088—2093 (73KalyankrishnaS,MalikKU.Norepinphrine—induced stimulationofP38mltogen-activatedproteinkinaseis mediatedbyarachidonicacidmetabolitesgeneratedby activationofcytosolicphosphlipaseA2invascular smoothmusclecells.JPharmco1ExpTher,2003, 304(2):761-772 (83hohH,YamamuraS,WareJA,eta1.Differentia1 effectsofproteinkinaseConhumanvascularsmooth musclecellproliferationandmigration.AmJPhysiol HeartCircPhysiol,2001,281(1):H359—370 (93YamadaH,TsushimaT,MurakamiH,eta1.Poten— tiationofmitogenicactivityofplatelet-derivedgrowth factorbyphysiologicalconcentrationsofinsulinviathe MAPkinasecascadeinratA10vascularsmoothmuscle cells.IntJExpDiabetesRes,2002,3(2):131—144