谷氨酰胺转胺酶交联对大豆蛋白酶解物美

谷氨酰胺转胺酶交联对大豆蛋白酶解物美 豆丁网论文: 谷氨酰胺转胺酶交联对大豆蛋白酶解物美 拉德反应产物风味的影响 宋娜，俞勤丽，徐洁琼，黄敏，孟利茹，黄梅桂，刘平，张晓鸣 5 (江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122) 摘要:为了提高美拉德反应产物的产率，利用谷氨酰胺转胺酶交联大豆蛋白酶解产物，增加 1000-5000 Da 分子量分布的比例，研究其相应的美拉德反应产物的呈味特性。以游离氨基浓 度为指标，得到交联度最大的反应条件为:多肽浓度 10%，酶/多肽=1.6%，pH=8，40 ?保 持 5 h。从分子量分布、游离氨基酸组成、GC-MS 以及感官评定的结果来看，交联多肽的美 10 拉德反应产物 1000-5000 Da 分子量肽段的比例增加 8.71%，鲜味氨基酸增加，苦味氨基酸 减少，吡嗪、吡咯、吡啶等风味化合物含量增加，因而使得其醇厚味、持续性、鲜味增加而 苦味降低，整体接受度提高。 关键词:美拉德反应;谷氨酰胺转胺酶;交联反应;风味 中图分类号:TS202.3 15 Tranglutaminase Cross-linking Effect on Sensory Characteristics of Maillard Reaction Products from Soybean Protein Hydrolysates SONG Na, YU Qinli, XU Jieqiong, HUANG Min, MENG Liru, HUANG Meigui, 20 LIU Ping, ZHANG Xiaoming (State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, JiangSu WuXi 214122) Abstract: To improve the yield of Maillard peptides, a microbial transglutaminase (MTGase) was used to increase the content of 1000-5000 Da peptides in soybean protein hydrolysates by 25 cross-linking reaction and researched the effect on its flavoring characteristics. The content of free amino groups was determined by formaldehyde titration and the maximum cross-linking reaction conditions were as follows: the concentration of peptides 10%, enzyme /peptides 1.6%, pH 8.0, temperature 40 ?, cross-linkin reacion time 5 h. The results of molecular wight distribution, free amino acids, GC-MS and sensory evaluation showed that the yeild of Maillard reaction products 30 increased by 8.17%, the umami amino acids significantly increased, the bitter amino acids markedly decreased, and pyrazines, pyrroles, pyridines ect. volatile flavor compounds increased in the Maillard reaction products derived from cross-linking peptides, therefore the mouthfulness, continuity and umami increased and bitter taste decreased, the ovellacceptance improved. Keywords: Maillard reaction; Transglutaminase; Cross-linking reaction; Flavor 35 0 引言 美拉德反应是还原糖与氨基酸、多肽或者蛋白质之间发生的非酶褐变反应，产生一系列 的挥发性香气物质、高活性的中间产物和黑色聚合物蛋白黑素。这些美拉德反应产物是加工 [1]食品色泽和浓郁芳香的各种风味的主要来源，同时增强食品的抗氧化性。美拉德肽是指 40 1000-5000 Da 分子量范围的美拉德反应产物，它具有增强食品风味的特性，如提升鲜味、醇 [2]厚味和持续性等。另外，美拉德肽具有咸味增强或减弱的双相效果，主要取决于其浓度大 [3] 小。 一些研究发现，通过提高大豆分离蛋白水解物中 1000-5000 Da 肽段的含量，可增加美 基金项目:国家自然科学基金(31071602) 作者简介:宋娜，(1987-)，女，硕，主要研究方向:食品化学。 通信联系人:张晓鸣，(1965-)，男，教授，主要研究方向:食品化学。E-mail: xmzhang@jiangnan.edu.cn - 1 - 豆丁网论文: [2] 拉德肽的产率。Ogasawara等人提出可以通过超滤技术增加蛋白水解物中 1000-5000 Da 肽 45 段的含量，但是超滤步骤费时、操作复杂并且需要特殊的设备，这给工业化生产纯的或者高 [4]含量的 1000-5000 Da 肽增加了很大的难度。Guerard等人研究通过控制蛋白水解度来增加 其中的 1000-5000 Da 肽段的含量。虽然这些方法可在一定程度上增加 1000-5000 Da 肽段含 量，但仍然存在一定的局限性，如肽回收率低以及生产成本较高。 近年来的研究发现，通过酶法交联或聚合作用增加蛋白酶解物中高分子量肽段的含量。 [6]50 谷氨酰胺转胺酶可以通过氨基结合、交联作用、脱酰胺基作用等修饰蛋白质。谷氨酰胺转 胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，它可催化在蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的γ- 羟酰胺基和伯胺之间的酰胺基转移反应，达到分子量增大的效果。因此，本文尝试采用谷氨 酰胺转胺酶交联作用提高大豆蛋白酶解物特定分子量段的含量，以提高美拉德肽的产率，这 味基料的开发提供了重要的理论指导。 种方法对于具有风味增强特性的美拉德反应产物咸 55 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 实验室自制大豆肽(DH=13.52%，缩写为 SP);谷氨酰胺转胺酶(MTGase，酶活为 987 U/g):江苏一鸣精细化工有限公司;C6-C26 的正构烷烃 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品:Sigma 试剂公司;氢 氧化钠、盐酸、木糖、甲醇和甲醛均来源于中国医药集团上海化学试剂公司。 60 1.2 仪器与设备 全温型往复式精密恒温振荡液浴槽:杭州雪中炭恒温技术有限公司;WSC-S 测色差计: 上海精密科学仪器有限公司;集热式恒温热磁力搅拌器:巩义市予华仪器有限责任公司;超 级恒温水浴锅:上海实验仪器有限公司;紫外可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司; 电热恒温鼓风干燥箱:上海浦东荣丰科学仪器有限公司;磁力搅拌器;pH 计;天平。 65 1.3 分析方法 1.3.1 游离氨基浓度的测定 [7]采用甲醛滴定法测定游离氨基浓度。通过测定游离氨基浓度，确定交联度最大的大豆 肽即交联肽(缩写为 SPC)的工艺条件。 1.3.2 美拉德反应 70 分别称取 1.0 g SP 和 SPC，然后分别添加 0.15 g 木糖，加入去离子水 8 mL 溶解，然后 用 6 N NaOH 调节 pH 至 7.4，定容到 10 mL，再转移至 50 mL 螺旋密封的耐压反应瓶中并 o将盖子旋紧，在带磁力搅拌器的油浴中于 120 C 条件下反应 120 min，反应结束后立即用冰 水冷却，反应液分别缩写为 MSPX 和 MSPCX。 1.3.3 褐变程度的测定 75 将样品(SP 和 SPC)用蒸馏水稀释 10 倍，而样品(MSPX 和 MSPCX)稀释 200 倍， 在 420nm 下测定吸光值 A，重复测定三次，取平均值。 420 1.3.4 色差值的测定 采用色差计测量反应体系的色泽变化，取 1 mL 样品注入 2.5 cm 直径的样品槽中。其中 ***L(正值白，负值黑)，a(正值红，负值绿)，b(正值黄，负值蓝)。以水为参照，计 - 2 - 豆丁网论文: *2*21/2*2*2*21/2 80 算相应参数:饱和度 C=(a+b);总色差 ΔE=(ΔL+Δa+Δb)。 1.3.5 分子量分布的测定 采用高效液相色谱进行测定。仪器型号:Waters 600(配 2487 紫外检测器和 M 32 工作 站);色谱柱:TSK gel 12000 SWXL 300 mm×7.8 mm;流动相:乙腈/水/三氯乙酸，45/55/0.1 o C;进 (v/v/v);检测器:紫外检测器;检测波长:220 nm;流速:0.5 mL/min;柱温:30 样体积:10 μL。 85 分子量标准品:细胞色素 C(12500 Da)，抑肽酶(6500 Da)，杆菌肽(1450 Da)， 四肽(451 Da)，三肽(189 Da)。得出的分子量标准曲线:Log MW = -0.2087 T+6.6753; 2 R=0.9964 其中:MW 代表分子量，T 代表洗脱时间。 1.3.6 游离氨基酸的测定 采用 OPA 和 FMOC 柱前衍生处理。仪器型号:安捷伦液相色谱仪(Ag 1100);色谱 o 柱:5 μm ODS Hypersil(250×46)mm;柱温:40 C 流动相:A 相:0.6 mM 醋酸钠;B 相: 90 0.15 mM 乙酸钠:乙腈:甲醇=1:2:2(v/v/v);流速:1 mL/min;紫外检测:338 nm /262 nm (Pro 脯氨酸，Hypro 羟脯氨酸);梯度条件:0,27.5 min，8%,60%B。 1.3.7 GC-MS 分析 3.0 g 样品放入特制的 15 mL 顶空瓶，加入 2 μL 的 1,2-二氯苯甲醇溶液 SPME 条件:取 o(0.05 mg/mL)做内标，迅速盖上盖子，在 55 C 水浴中平衡 30 min。将已老化好的 SPME 萃取头从瓶盖中插入样品瓶中，用手柄将石英纤维头推出进行萃取。吸附 30 min 后，用手 95 柄使纤维头推回到萃取头内，拔出萃取头。将吸附了分析组分的萃取头插入 GC-MS 进样器 中，得到定性及定量结果。 气相色谱条件:色谱毛细管柱为 DB-WAX(L.D 为 30 m×0.25 mm，液膜厚度为 0.25 μm); oo-1 载气为 He，流速 1.8 mL/min;不分流;程序升温起始温度 40 C，保持 3 min，以 5 C?min o-1o-1 o o的速率升温到 80 C，以 10 C?min的速率升温到 160 C，保持 0.5 min，以 2 C?min的速 oo-1 oo100 率升温到 175 C，后以 10 C?min的速率升温到 230 C，最后在 230 C 保持 7 min;汽化室 【】o8温度 250 C。 o 质谱条件:EI 电离源，电子能量 70 eV，灯丝发射电流为 35 μA，离子源温度为 200 C， o接口温度 250 C，检测器电压 350 V，扫描质量范围为 35-450 amu。 1.3.8 感官评定 [2][9]105 感官评定的方法参照 Ogasawara和 Schlichtherle-Cerny等人报道的方法稍作调整。感 官评定小组是由八名(23-49 岁)来自江南大学食品学院的专业感官评定员组成。所有的感 官评定员都受过大于 20 h 的描述性感官评定分析培训并且拥有多种食品感官评定的经验。 这些感官评定员还针对样品做过 3 h 的区别性感官评定分析，确定样品各种属性的参照样。 样品按照 1%(w/w)添加量溶解在鲜味溶液中。鲜味溶液是用 0.5%(w/w)的盐和 1.0% (w/w)的味精配成的水溶液。80 mL 的样品和 80 mL 的参照样在 22?2 ?C 下在感官评定室 同时测定。参照溶液以及它们的强度如下:鲜味溶液中加 1%(w/w)的糊精(鲜味、醇厚 110 味、持续性，强度值为 3);咖啡碱溶液(4 mM，苦味，强度值为 5);焦糖溶液(2.5 g 焦糖化的白绵糖溶解在 50 mL 水中，焦甜味，强度值为 3)。样品和参照样在口中保持 10 s 后吞咽，在 25 s 内做完评定。感官评定员对测试样各个属性的强度在 1-7 的范围内打分。 115 - 3 - 豆丁网论文: 1.3.9 数据分析 使用软件 SPSS 13.0 进行显著性分析;使用软件 Excel 2007 和 Origin 7.5 制表和绘图。 GC-MS 数据处理由 Xcalibur 软件系统完成，未知化合物经计算机检索，同时与 T 谱库(107k 120 Compounds)和 Wiley 谱库(320k Compounds，version 6.0)相匹配。 2 结果与分析 2.1 交联反应影响因素 交联反应进行的过程中，由于共价键的形成，使末端游离氨基减少，因此可以用游离氨 基浓度来代表交联反应进行的程度。游离氨基浓度越低，说明共价键形成的越多，交联程度 越高，反之，则越低。 125 2.1.1 时间对交联反应的影响 o 反应条件:多肽浓度 10%(m/v)，酶/底物=0.8%(m/m)，pH=6，45 C 的条件下进 行交联反应，比较不同反应时间对游离氨基浓度的影响。 表 1 反应时间对游离氨基浓度的影响 Tab. 1 Effect of MTGase different reaction time on concentration of free amino group 130 1 3 5 7 9 时间(h) aabcd99.62?1.15 99.45?1.82 94.17?1.42 102.63?6.99 106.52?6.21 浓度?标准偏差(mM/L) 注: a-d 同行中数据的不同上标字母代表有显著差异(p<0.05) (n=3)。 从表 1 看出，交联反应的时间对游离氨基浓度的影响较大。在 1-3 h 过程中，游离氨基 浓度变化不显著，之后，游离氨基浓度逐渐减小，到 5 h 时达到最小值，这是因为延长一定 反应时间有利于 MTGase 与底物充分接触，一定的酶促反应对交联效果是正相关的。当反应 135 时间超过 5 h 后，游离氨基浓度反而增加，产生这种现象的原因可能是由于随着时间的延长 [10] 发生了降解反应，说明反应时间并非越长越好，交联时间的选择也是十分重要的。于国萍 等也报道了 MTGase 交联时间对大豆分离蛋白凝胶性的影响，开始随着时间增加，凝胶强度 显著增加，但是 2.5 h 之后凝胶强度降低，与本实验结果类似。本实验中，5 h 的条件下，游 离氨基浓度与其他各点存在显著性差异，即 5 h 时交联程度最高。因此选择 5 h 为最佳交联 反应时间，作为下一步优化的条件。 140 2.1.2 pH 对交联反应的影响 pH 值是影响酶活力的重要因素，根据 MTGase 的适宜 pH 以及大豆肽的反应活性，研 究了不同 pH 对游离氨基浓度的影响，反应条件:多肽浓度 10%(m/v)，酶/底物=0.8%(m/m)， o45 C 的条件交联 5 h，结果如表 2 所示。 表 2 不同 pH 对游离氨基浓度的影响 145 Tab. 2 Effect of different pH on concentration of free amino group pH 5 6 7 8 9 浓度?标abcdd 91.41?0.71 94.17?1.42 88.21?0.61 78.32?0.97 78.44?0.23 准偏差(mM/L) 注:a-d 同行中数据的不同上标字母代表有显著差异(p<0.05) (n=3)。 从表 2 可以看出，体系的 pH 由 5 增加到 6，游离氨基浓度有小幅度增加，但之后随着 150 pH 的增加，游离氨基浓度逐渐减小，当 pH 达到 8 时达到最小值，之后涨幅不显著。原因 有两个方面，一是 pH 能影响酶分子上一些氨基酸侧链的解离状态，特别是酶催化活性所需 155 - 4 - 豆丁网论文: 侧链基团解离状态，过酸、过碱可使酶空间构象改变，使酶丧失活性，pH=8 时，酶侧链解 离状态使得酶具有最高的催化活性，交联效果最佳;二是 pH 能影响底物溶解性能，好的溶 [11]解性可使酶与底物能更充分接触，增大酶与底物结合概率。因此，选择 pH=8 为最佳 pH， 作为下一步优化的条件。 160 2.1.3 温度对交联反应的影响 温度不仅影响交联反应的反应速率速率而且影响谷氨酰胺转胺酶的酶活，根据 MTGase 的适宜温度以及大豆肽的反应活性，研究了不同温度对游离氨基浓度的影响。反应条件:多 肽浓度 10%(m/v)，酶/底物=0.8%(m/m)，pH=8，交联 5 h，选择 MTGase 最适反应温 o C 进行优化。结果如表 3 所示。 度 25-60 表 3 不同温度对游离氨基浓度的影响 165 o Tab. 3 Effect of different temperature on concentration of free amino group 温度(C) 30 40 45 50 60 浓度?标abccbcb 80.6?0.60 78.36?0.57 77.93?0.48 78.32?0.97 78.52?1.02 准偏差(mM/L) 注:a-c 同行中数据的不同上标字母代表有显著差异(p<0.05) (n=3)。 o由表 3 可知，温度在 30-60 C 范围内游离氨基浓度变化幅度都不大，随着温度升高， o游离氨基浓度略有下降，45 C 时游离氨基浓度达到最低，之后游离氨基浓度略有增加。这 170 是因为温度影响酶促反应，温度较高时促使酶和底物结合，增加活化复合物浓度，从而加快 o酶促反应速度，所以 30-45 C 时，游离氨基浓度降低，交联程度不断增大;但温度过高同 时也对酶蛋白稳定性产生影响，降低酶反应活力，当超过一定温度，酶变性失活迅速加快， 也会使酶促反应速度急剧下降，从而使得游离氨基浓度有增大的趋势。因此，确定酶促反应 [11]oo合适温度也十分重要。显著性差异分析结果显示，40-60 C 没有显著差别，因此选择 40 C 175 为最佳温度，作为下一步优化的条件。 2.1.4 酶/底物对交联反应的影响 o 反应条件:多肽浓度 10%(m/v)，pH=8，40 C 条件下交联 5 h，比较不同酶/底物对 游离氨基浓度的影响。 180 表 4 不同酶/底物对游离氨基浓度的影响 Tab. 4 Effect of MTGase /peptides on concentration of free amino group 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% 1.6% 3.2% 酶/底物 aaabcbc80.21?1.87 79.53?0.93 79.65?0.38 77.93?0.48 73.85?0.38 74.26?0.98 浓度?标准偏差(mM/L) 注:a-c 同行中数据的不同上标字母代表有显著差异(p<0.05) (n=3)。 185 从表 4 可知，随着酶/底物比例的增大，游离氨基浓度逐渐减小，酶/底物达到 1.6%时， 游离氨基浓度达到最低值，然后趋于稳定。产生这种现象的原因是酶/底物是酶促反应的影 响因素之一，在一定范围内，增大加酶量可以提高反应速度，缩短反应时间，从而和交联效 果正相关，所以酶/底物在 0.1%-1.6%范围内时，交联程度不断增加;当加酶量满足底物要求 后，交联反应达到一定的程度后趋于平缓，继续增加就不再有效果，反而会造成酶的浪费， 可能是酶之间产生一定的竞争性抑制作用，因此在酶/底物达到 1.6%以后继续添加，就不再 190 继续降低游离氨基的浓度。显著性差异分析结果表明，酶/底物为 1.6%与其他各点有显著性 差别，因此选择酶/底物为 1.6%为最佳加酶量。 通过以上单因素实验，选择最大交联条件为多肽浓度 10%(m/v)，酶/底物=1.6%(m/m)， oo pH=8，40 C，在摇床中以恒定速度80 rpm 交联 5 h，后在 95 C 下灭酶 10 min。在此条件 下制备的交联肽即为 SPC。 195 - 5 - 豆丁网论文: 2.1.5 相关性关系 表 5 参数与结果之间相关系数 Tab. 5 Correlation among the variables and results 因素 游离氨基浓度 相关系数 显著性水平 0.5760 0.3095时间 pH -0.8980* 0.0380 -0.6610 0.2250 温度 -0.8821* 0.0200酶/底物 注:*p<0.05.负号代表负相关。 200 通过比较四个单因素与游离氨基浓度之间的相关性系数，对影响游离氨基浓度的因素的 相关性从高到低依次是:pH>酶/底物>温度>时间，其中 pH 和酶/底物的影响是显著的 (p<0.05)。可以得出 pH 和酶/底物两个因素是影响交联反应的主要因素，并且呈现负相关 的关系。相比较其他两个因素，温度和时间对游离氨基浓度的影响不是主要因素，并且时间 与游离氨基浓度呈正相关，而温度则呈负相关。 205 2.2 色泽的测定 色泽可以用 CIE Lab 色度空间衡量，该测量方法能反映人眼对色彩的真实感觉。颜色的 亮度(L*)会显著影响总色差 ΔE，L*值越大，说明样品颜色越亮，总色差它表示的是在彩色 空间中与参照样水相比的色差值。饱和度 C 代表的是视觉颜色的饱和度、纯度以及强度， 其定义为灰色和纯彩色之间的差值。饱和度的增加，表明体系中颜色更加的偏红和偏黄，色 [12] 彩更加的饱满强烈，直到增加到最大值。 210 表 6 交联反应对颜色的影响 Tab. 6 Effect of MTGase cross-linking on color formation AL* a* b* ΔE C 420 aaaaaaSP 0.306?0.002 58.92?0.02 1.62?0.05 17.04?0.04 9.25?0.32 17.11?0.038 bbbbbb SPC 0.322?0.004 57.91?0.02 2.03?0.07 20.31?0.06 12.62?0.05 20.41?0.059 cccccc MSPX 0.365?0.001 14.54?0.485 12.11?0.562 13.89?0.837 53.27?0.709 18.43?0.975dddddd MSPCX 0.380?0.002 12.17?0.589 13.93?1.039 14.81?0.147 56.11?0.808 20.34?0.675 注:a-d 同列中数据的不同上标字母代表有显著差异(p<0.05)(n=3)。 215 从表 6 可以看出，MSPCX 比 MSPX 的 L*值小，ΔE 值大，两者存在显著性差异，说明 MSPCX 比 MSPX 的颜色深。另外，MSPCX 比 MSPX 的 a*和 b*大，两者存在显著性差异， 代表了美拉德反应后期棕 则说明 MSPCX 的颜色比 MSPX 更加的偏红和偏黄。同时，A420nm 褐色产物的形成程度，A处的吸光值 MSPCX 大于 MSPX，差异显著，也表明 MSPCX 420nm 220 颜色更深，形成的棕褐色产物多。虽然，MSPCX 的颜色比 MSPX 的颜色深，但是它的这种 深颜色对于生产一些特定的产品是有利的。 2.3 分子量的测定 表 7 分子量分布 Tab. 7 Molecular weight distribution 225 SP SPC MSPX MSPCX abcd >5000 1.16?0.123 1.65?0.217 1.28?0.283 2.07?0.191abcd 1000-5000 15.57?0.950 18.87?0.895 19.49?0.764 22.39?0.276abcd<1000 83.27?0.966 79.48?1.085 79.23?1.047 75.45?0.057 注:a-d 同行中数据的不同上标字母代表有显著差异(p<0.05) (n=2)。 大豆肽的分子量分布经过 MTGase 交联作用发生了改变。如表 7 所示，SPC 在 1000-5000 Da 和>5000 Da 两个肽段相比 SP 分别增加了 21.19%和 42.24%。这表明 MTGase 交联作用对 - 6 - 豆丁网论文: [13]230 等人的研究相一致，经过 增加高分子量肽段分布起到了显著的作用。这一结果与 Sharma [14]ε-(γ-谷酰基)-赖氨酸异肽键的交联作用形成高分子聚合物。并且，Dondero等人研究表明 肽的交联会形成二聚物、三聚物或者更大的蛋白质聚合物。另外，蛋白质等作为底物能够被 MTGase 利用的效率不仅与赖氨酸以及谷氨酸盐的绝对含量有关，蛋白质的一级结构对于其 利用效率似乎更加重要。 235 SP 交联形成 SPC 后，将 SP 和 SPC 分别进行了美拉德反应得到 MSPX 和 MSPCX。从 看出，MSPX 和 MSPCX 相对于 SP 和 SPC 在 1000-5000 Da 和>5000 Da 两个肽段 表 7 可以 [15]含量显著增加。Su等人研究表明高分子量肽在美拉德反应过程中同时发生降解和聚合反 应，在本实验的热反应过程中，聚合反应占据了优势。同时，从表 7 看出 MSPCX 中在 1000-5000 Da 肽段的含量比 MSPX 增加了 14.88%，这个结果可能是因为 MTGase 交联作用 的结果，MTGase 的交联作用影响了 SPC 的分子量分布，从而进一步影响了 MSPCX 的分子 240 量组成。由于 MSPCX 中 1000-5000 Da 肽段含量比 MSPX 高，因而 MTGase 交联作用对于 美拉德反应产物中 1000-5000 Da 肽段的含量呈现正相关作用，并且可能会进一步影响下面 研究的风味特性。 2.4 游离氨基酸分析 [6]Aaslyng等人研究表明游离氨基酸的组成和含量可以显著影响产品的风味特性。为了 进一步说明 MSPCX 和 MSPX 感官评定特征之间差异，利用液相色谱技术测定了两者的游 245 离氨基酸组成和含量，结果如图 1 所示。 SP SPC MSPX 1.0 MSPCX 0.9 0.8 0.7 0.6 ( mg/mL) 0.5 0.4 0.3 0.2 游离氨基酸浓度 0.1 0.0 asp glu ser his gly thr arg ala tyr cys val met phe ile leu lys pro 250 图 1 MSPX 和 MSPCX 中游离氨基酸的分布 Fig. 1 The distribution of free amino acids in MSPX and MSPCX 四个样品之间的各游离氨基酸的种类虽然没有差别但是浓度存在显著性差别，这暗示着 MTGased 的交联作用明显的影响了游离氨基酸的浓度，特别是赖氨酸的含量 SPC 比 SP 少， 这是因为交联反应过程中形成了 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价键。 255 游离氨基酸是重要的风味化合物，可以分为五大类:苦味氨基酸、甜味氨基酸、酸味氨 基酸、咸味氨基酸以及鲜味氨基酸。苦味是评价最终产品特征的一个重要指标。苦味的形成 [17, 18]主要是因为疏水性氨基酸(即所谓的苦味氨基酸)以及其形成的小分子量多肽。当苦 - 7 - 豆丁网论文: [19]。在本研究中的 17 种游离氨基酸中，包含 8 中 味的强度超过其阈值，苦味就表现出来了 260 苦味氨基酸:缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、精氨酸和组氨酸， [5]其中强苦味氨基酸是精氨酸、组氨酸和蛋氨酸。苦味氨基酸和强苦味氨基酸 MSPCX 比 MSPX 分别减少 7.05%和 3.65%。因而，MSPCX 相比 MSPX 苦味可能降低。同时，谷氨酸 因为其具有鲜味，因此是一种重要的呈味氨基酸。具有鲜味口感的肽是由于高摩尔含量的谷 [9]氨酸和亲水性氨基酸残基形成的。MSPCX 比 MSPX 谷氨酸增加了 41.67%，因此鲜味会增 265 加，鲜味物质除能产生鲜味外，还能增强食品的持续性、满口性、复杂性、厚味等及食品的 特征风味(如汤的肉味)和甜味。另外，像甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸带有甜味，因此 两个样品在甜味的口感上也会有些不同。总之，通过游离氨基酸组成和含量的分析，经过 MTGase 交联作用，MSPCX 比 MSPX 增强了鲜味，减少了苦味，这与后面的感官评定结果 相一致。 270 2.5 GC-MS 分析 表 8 GC-MS 分析 MRPs 中的挥发性风味物质 Tab. 8 Volatile flavor compounds of MRPs determined by GC-MS analysis KI 风味物质种类 风味物质名称 风味物质含量(ng/g) MSPX MSPCX 1120 13.2987?0.86 17.8439?1.36 2-甲基吡嗪 吡嗪类1206 67.5235?1.87 106.4186?2.60 2,5-二甲基吡嗪 1221 0.8789?0.02 ND 2,3-二甲基吡嗪 1356 1.2256?0.10 ND 异丙烯基吡嗪 1445 13.6122?0.82 21.2068?1.33 3-乙基-2,5-二基吡嗪 1592 0.9557?0.07 ND 2-甲基-5-(1-丙烯基)吡嗪 1606 1.9880?0.29 3.1167?0.11 2-(2-甲基丙基)-3,5-二甲基吡嗪 1675 1.1191?0.01 1.5480?0.03 2-异戊基-6-甲基吡嗪 1717 2.6986?0.25 3.6879?0.06 2,5-二甲基-3-(2-甲基丁基)吡嗪 1729 16.2459?1.15 20.2805?1.19 3-异戊基-2,5-二甲基吡嗪 1783 2.3655?0.18 1.5837?0.02 2-(3-甲基丁基)-3,5,6-三甲基吡嗪 1848 4.8602?0.25 6.9646?0.07 糠基-3-二甲基-2,5-吡嗪 1423 3.0871?0.19 2.9814?0.08 2-丙酰基呋喃 呋喃类 1672 1.8130?0.08 ND 5-(2-呋喃基甲基)-5-甲基-2(5H)-呋喃 1681 1.3187?0.01 ND 3-苯基呋喃 1610 ND 44.1795?1.56 糠醛 1251 51.0924?1.41 25.0333?1.38 糠醇 1440 1.0973?0.06 ND 吡啶类2-乙酰基-5-羟基吡啶 1541 1.3524?0.03 1.9965?0.14 6-叔丁基-2-氨基吡啶 1612 ND 1.4599?0.03 2-戊基吡啶 1660 11.7862?0.85 11.3082?0.46 1-(2-呋喃基甲基)-1H-吡咯 吡咯类 1868 11.6687?0.74 14.1159?0.33 1-糠基-2-甲酸基吡咯 1021 6.2545?0.28 18.0051?0.73 吲哚类N-乙基-1,3-二硫代吲哚 860 35.8960?1.36 53.5006?1.92 醛类 3-甲基丁醛 1553 3.1364?0.19 4.7100?0.38 己醛 1198 ND 1.5872?0.08 庚醛 1338 54.2003?1.15 77.3893?2.68 苯甲醛 1350 3.7301?0.13 4.7706?0.06 辛醛 1490 9.7366?0.24 11.9621?0.10 苯乙醛 1504 5.1569?0.24 5.2897?0.15 壬醛 1546 2.5999?0.02 2.9347?0.06 2-吡咯甲醛 1550 1.0835?0.12 1.5514?0.04 4-甲氧基-2-甲基苯甲醛 1615 0.7437?0.01 1.7102?0.03 反式-2-壬烯醛 1638 1.3131?0.02 1.6689?0.03 葵醛 1744 1.1806?0.10 ND Z-3,7-二甲基-2，6-辛二烯醛 1771 2.2786?0.11 ND α-亚乙基-苯乙醛 - 8 - 豆丁网论文: 1901 2.2786?0.11 ND 5-甲基-2-苯基-己醛 894 1.7636?0.04 4.3868?0.28 酸类乙酸 1425 1.7422?0.06 2.3797?0.04 正己酸 1570 6.3551?0.10 9.9296?0.25 仲班酸 1825 2.2894?0.04 ND 2-甲基-3-羟基-2,4，4-三甲基苯基酯丙酸 2079 0.9170?0.01 2.6170?0.05 棕榈酸 1813 2.3860?0.02 酯类2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯1.5605?0.06 1900 0.7866?0.01 2.9425?0.05 邻苯二甲酸二甲酯 871 ND 7.7327?0.04 醇类4-乙炔基-4-甲基-1,5-乙二烯-3-醇 1528 8.5226?0.05 8.7528?0.41 4-甲基-4-庚烯-3-醇 1485 1.8061?0.02 1.5387?0.04 正辛醇 1508 2.8974?0.07 3.1232?0.18 芳樟醇 1629 6.6856?0.05 10.8031?1.02 1-崁醇 1643 3.6197?0.04 6.4303?0.06 β-小茴香醇 1830 ND 1.7247?0.03 反式-香柠檬醇 1857 1.2931?0.04 ND 十二醇 830 4.5676?0.09 4.5693?0.04 酮类2-丁酮 1135 2.8593?0.03 7.0515?0.16 4-(苯甲酸基)-2H-吡喃-3-酮 1194 1.8753?0.05 2.6776?0.03 2-庚酮 1343 21.9291?1.41 26.0353?1.41 6-甲基-5-庚烯-2-酮 1516 0.7431?0.02 ND 苯乙酮 1531 15.2748?0.84 19.7826?1.12 1-(2-呋喃基)-3-丁酮 1620 1.7375?0.02 ND 苯基丙酮 1698 1.6097?0.01 1.5155?0.02 反式-呋喃亚甲基丙酮 1804 1.2135?0.01 1.8273?0.03 2-(2-丁炔基)-环己酮 注:KI，保留指数。以 C6-C26 的正构烷烃混合物为标准，根据公式计算待测物的保留指数。 ND:样品中未检测到。 275 氨基酸与还原糖发生反应后会生成吡嗪、呋喃、咪唑等杂环化合物，如果没有硫化物的 存在，这些物质只有烘烤、坚果等香气。呋喃型化合物是一种重要的风味成分，不含硫的呋 喃类化合物不具有肉香特征，主要是甜香、水果香、坚果香和焦香，但是对风味有重要贡献; 吡嗪类化合物是美拉德反应形成的挥发性化合物中一类重要的化合物之一，主要风味特征是 [20] 烤香和坚果风味;在挥发性风味化合物中，也有大量的酮、醛，醛类的阈值一般较低， 280 [21]具有脂肪的香气;碳链长为 1 到 10 的酸生成的酯往往会赋予一种甜的果香特征。风味的 形成并不是取决于某一单个化合物或某一类化合物，而是由许多一定比例的具有不同结构的 挥发性物质所产生的感官影响而共同产生的，各种化合物之间存在相互增强、抑制或者辅助 的作用，有些只是风味修饰剂，如奶油香、焦香、硫味、青草和蔬菜香等，这些是形成优良 [20]的风味必不可少的。 美拉德反应产生特定风味化合物的影响因素有:蛋白水解物中的游离氨基酸的组成与含 285 [22, 23] 量、分子量分布、多肽的组成及化学构型。肽在食品中的各种呈味作用随肽链长度、 氨基酸组成、排列结构的不同而呈现出不同的味感。研究表明除酸、甜、苦、咸四种基本味 以外，还有能够使风味增强的呈味肽和使食品浓厚感增强的呈味肽。交联前后多肽分子量分 布和游离氨基酸的含量都发生了极其显著地改变，因而使得交联前后的美拉德反应产物的风 味发生了改变。从表 8 中可以看出，MSPCX 比 MSPX 在酮类、醛类、酸类、吡嗪、吡啶、 290 吡咯、呋喃类、醇类、酯类等重要化合物分别增加了 30.11%、36.65%、47.80%、44.08%、 41.10%、8.40%、25.98%、61.58%、127.02%。因此，MSPCX 比 MSPX 的风味可能有所改 善，整体风味更佳柔和、饱满，这与感官评定的结果相一致。 - 9 - 豆丁网论文: 295 2.6 感官评定 图 2 MSPX 和 MSPCX 的感官评定分析 Fig. 2 Sensory evaluation of MSPX and MSPCX 300 从图 2 可以看出，MSPCX 在鲜味、醇厚味、持续性以及整体接受度等方面比 MSPX 显 著增强，苦味明显降低，焦甜味变化不明显。美拉德肽(即 1000-5000Da 美拉德反应产物) [2]。 虽然本身并没有很强的滋味，但是当添加在鲜味溶液中会显著增强其醇厚味和持续性 MSPCX 中 1000-5000 Da 的肽段含量较高，因此会具有更强的醇厚味和持续性。另外，从游 离氨基酸的分析可以看出，鲜味氨基酸显著增加，而苦味氨基酸明显减少，这也可以说明 MSPCX 在感官上鲜味增强而苦味降低。综上，整体接受度 MSPCX 比 MSPX 显著增加。 305 3 结论 通过分子量测定的结果，谷氨酰胺转胺酶对多肽确实有交联作用，使得 1000-5000 Da 分子量分布的比例显著增大。交联反应的最佳条件为底物浓度 10%，酶/多肽=1.6%，pH=8， o 40 C 保持 5 h。交联反应后得到的多肽进行美拉德反应后与未交联的多肽美拉德反应产物相 比风味得到明显改善。综上，通过交联反应增加 1000-5000 Da 分子量分布比例是改善大豆 肽美拉德产物呈味特性的有效手段。 310 [参考文献] (References) [1] Sun, W., Zhao, M., Cui, C., et al. 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