骨髓间充质干细胞与心肌细胞再生和心脏修复

骨髓间充质干细胞与心肌细胞再生和心脏修复 骨髓间充质干细胞与心肌细胞再生和心脏 修复 第33卷第5期 2005年l0月 广州医学院 ACADEMICJOURNALOFGUANGZHOUMEDICALCOLLEGE Vo1.33No.5 Oct.2005 骨髓间充质干细胞与心肌细胞再生和心脏修复 何晓青综述陈敏生刘世明审校 (广州医学院,广东广州510182) 关键词骨髓间充质干细胞;心肌细胞;再生;修复 中图分类号Q254文献标识码:A文章编号:1008—1836(2005)05—0061—04 长期以来,心肌细胞被认为是不可能发生损伤 修复的.但是,近年来随着干细胞移植的兴起,这一 观念发生了改变,许多研究已证实心肌可通过多种 途径发生再生和修复,缺血心肌的再生和修复已成 为心血管病研究领域的一大热点.而骨髓问充质干 细胞(bonema~owstromalcells,BMSCs)是存在于骨 髓基质中的一种非造血系干细胞,它不但能够在体 外扩增,而且具有多向分化的潜能,可通过诱导分化 为心肌细胞,促进血管新生等多种途径参与心肌的 再生和修复,虽然其作用机制还有待进一步探讨,但 这也将为治疗心肌梗死等缺血性心脏病开辟一条新 的途径.本文将对BMSCs缺血心肌细胞再生和 修复的研究进展作一综述. 1BMSCs的概述 BMSCs是来源于中胚层的具有高度自我更新 能力和多向分化潜能的成体干细胞.广泛存在于全 身结缔组织和器官问质中,以骨髓组织中含量最为 丰富.1987年Ffiedenstein等…发现骨髓细胞在一 定条件下可分化为成骨细胞,成软骨细胞,脂肪细胞 和肌原细胞,而且这些细胞经过20,30个培养周期 仍能保持其多向分化潜能.由于骨髓中的这种多能 干细胞能够分化为多种中胚层来源的问质细胞,故 称之为问充质干细胞.近年来干细胞的研究不断深 入,对BMSCs研究也有很大的进展.BMSCs获取方 便,体外扩增容易,已成为缺血心肌内细胞移植的优 良供体,其在组织工程中的应用也成为干细胞研究 领域的研究热点. 2BMSCs的分离,培养与鉴定 目前BMSCs的分离方法主要有密度梯度离心 ,在读硕士研究生. 作者简介:何晓青(1979.3一),男 研究方向:高血压的发病机制与防治. 通讯作者:陈敏生,男,教授,博士生导师. ? 综述? 法,贴壁筛选法,流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离 法4种.流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细 胞活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性,并 且实验条件要求高,需要骨髓量大;而密度梯度离 心法比贴壁筛选法复杂,但比贴壁筛选法的纯度 高,所以现在用得比较多的是密度梯度离心法和贴 壁筛选法. 体外培养时,骨髓MSCs呈成纤维细胞样形态, Bianco等发现BMSCs只有在经过高密度接种的 数代培养后,方能 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现出形态和表型方面的一致,但 此时会丧失其分化能力.Coher等则发现在培养 的早期阶段,BMSCs的形态,表型和功能出现不一 致性,尤其是在低密度接种的情况下.BMSCs具有 极大的扩增潜能,表现出活跃的增殖倍增能力并保 持着向多种问充质细胞系分化的潜能. 目前研究已证明,MSCs的表面抗原具有多样 性,主要的抗原标记为:CD13,CD29,CD44,CD51, CD54CD58CD71CD73CD90CD102CD105 CD106,CD123,SSEA一3等,相反,MSCs不表达 其他造血细胞系的表面标记,如CD14,CD34, CD45,CD133等,但是至今仍没有找到MSCs的特 异性抗原标记,所以目前鉴定MSCs主要依赖排除 法和生物活性分析. 3BMSCs的可塑性(Plasticity) 干细胞的可塑性是指来源于一种器官或组织的 即不仅可 干细胞具有分化为其他组织细胞的能力, 跨系分化,甚至还能够跨胚层分化.BMSCs作为骨 髓干细胞中重要的成员,具有高度的可塑性,可向多 种细胞系分化.研究表明,BMSCs在不同的体外条 件下可诱导分化为骨细胞,软骨细胞,成肌细胞,脂 肪细胞等,还可向神经细胞,上皮细胞,血管内皮细 胞,心肌细胞等分化.由于BMSCs具有这种可塑 61 广州医学院(JGZMC)2005,33(5) 性,已被越来越多地用于基础研究与临床治疗之中. 4BMSCs在心肌细胞再生与心脏修复中的作用 心肌梗死后由于心肌的缺血坏死和心室的重构 导致心力衰竭的发生,对患者的生命产生了严重的 威胁,如何有效地改善缺血心肌的缺血状况,减少心 肌的坏死以及提高心功能一直以来都是研究的重 点.随着心肌不可修复和再生这个观念的改变,近 年来已有许多学者对缺血心肌细胞的再生与修复进 行研究,对其机制已有一定的了解.目前多数学者 认为心肌细胞再生与心脏修复的关键是坏死心肌细 胞的取代与清除,缺血部位新血管的形成以保证氧 气和营养的供应,避免缺血面积的扩大和缺血心肌 细胞的继续凋亡.自从发现BMSCs有分化为心 肌细胞的潜能后,对BMSCs在心肌在缺血心肌细胞 的再生与修复中的作用进行了大量的研究,目前研 究主要认为可通过以下途径发挥作用: 4.1BMSCs可诱导分化为心肌细胞 心肌缺血时心肌细胞经历了肥大,核的改变以 及凋亡等变化,而仅有少量心肌细胞保持了增殖和 再生的能力,需要有新的有功能的心肌细胞取代凋 亡的细胞以维持心脏的功能,这可通过刺激内源的 成熟心肌细胞或干细胞增殖,还可通过移植外源的 干细胞来源的心肌细胞而获得.自Makino等 发现BMSCs经5一氮杂胞苷(5-azacytidine)处理后可 诱导分化为心肌细胞后,最近几年已有许多学者对 BMSCs诱导分化为心肌细胞进行了研究.目前认 为,干细胞进入微环境后对分化信号反应受周围正 在进行分化的细胞影响,对新的微环境中调节信号 做出反应,即"环境诱导分化"』.干细胞对环境信 号反应能力随时问而变化,反应大小取决于细胞表 面信号传递分子或转录因子表达,是定向分化的决 定因素.实验表明环境诱导分化可能与细胞接触有 关外,还存在基因水平调控,细胞因子调控等. 4.1.1细胞接触Fukuhara等?通过把表达绿色 荧光蛋白(GFP)的转基因大鼠的BMSCs(GFP. BMSCs)与新生鼠的心肌细胞在体外共培养7d,发 现部分GFP.BMSCs有肌管样结构形成并与心肌同 步收缩且表达心肌特异性肌钙蛋白.I(TroponinI) 及肌球蛋白重链,在GFP.BMSCs与心肌细胞之间还 检测到连接蛋白43的表达,这一结果提示细胞与细 胞的相互作用,电或机械刺激以及来自心肌细胞的 某些未知的生长因子可能会诱导BMSCs向心肌细 胞的分化.Rangappa11],Meifengll等也通过把不 62 同比例的GFP.BMSCs与心肌细胞共培养,发现 BMSCs可分化为具有心肌表型的细胞.而Toma 等?通过把lacZ标记的hBMSCs移植进小鼠的左 室中,60d以后发现hBMSCs表达心肌特异性肌钙 肌球蛋白重链以及Or..肌动蛋白(Or.一actinin) 蛋白.T, 等.体内和体外的实验表明细胞接触是微环境中影 响干细胞定向分化的重要因素,可能通过细胞间的 信号传导,启动定向分化因子转录,调节生长因子表 达,诱导干细胞向不同组织分化.共培养实验技术 也为研究细胞内环境对细胞分化的影响提供了一个 良好的体外模拟环境,但是目前尚未有研究提出共 培养中两种细胞之间哪种比例最有利于细胞的分 化. 最近,Terada等?提出骨髓干细胞的这种转分 化能力并不是真正的转分化,它们所获得的表型改 变是通过细胞融合而不是分化而来的.许多学者从 体外共培养?和体内移植?"两方面证明了细胞 融合在表型改变上有一定的作用,而0h?, Yoonl1等则分别从体内和体外实验证明了细胞融 合和细胞分化两者在获得细胞表型上都有作用,这 就给研究心肌再生带来了一系列新的问题.目前关 于细胞融合在有心肌再生中的作用的研究也不多, 其机制有待进一步研究. 4.1.2基因水平调控Makino等通过5.氮杂胞 苷诱导BMSCs分化为心肌细胞,此后也有学者成功 地利用5一氮杂胞苷在体外诱导BMSCs分化为心肌 细胞.5一氮杂胞苷是一种去甲基化药物,能引起 DNA中某些胞嘧啶去甲基化,推测其可能与控制向 心肌分化的特异性启动子基因上的组遏蛋白结合, 使其去甲基化,激活转录,促使其向肌性细胞分化, 这也证明了在细胞分化中基因水平调控的存在. Zhao等通过RT—PCR等检测到间充质细胞表达 心肌特异性转录因子GATA-4,Nkx2.5,心肌特异性 基因如MLC一2a,MLC一2v,cTnI等,证明了MSCs具有 心肌的某些特征,可通过基因水平调控进行诱导分 化,其具体机制尚未明确. 4.1.3细胞因子调控细胞因子广泛存在体内环 境中,可对细胞的募集,增殖,分化等产生影响.实 验证明成纤维细胞生长因子2(Fibroblastgrowth factor一1,FGF-2)的表达在心肌缺血,再灌注及心肌 重构时明显升高,在细胞的增殖,分化等方面有 重要的作用.细胞内的FGF-2可直接增强细胞 核内有丝分裂的能力而促进细胞的增殖,而胞外的 FGF-2则通过与细胞表面受体及硫酸乙酰甘素蛋白 第5期何晓青,等.骨髓间充质干细胞与心肌细胞再生和心脏修复 多糖结合而激活细胞内的信号途径进而促进细胞的 增殖和分化.Rosenblatt.Velin等在培养液中加 入FGF.2对小鼠心脏中分离出来的非心肌细胞 (nonmyocytecel1)进行培养,3星期后检测到大约 5%的细胞表达心肌细胞的表型,如Nkx2.5,GATA一 4,MEF.2c,troponinI等,并可观察到细胞的同步收 缩,证明了FGF-2对细胞的分化发生了调控.Song 等把经FGF-2转染的BMSCs用绿色荧光蛋白标 记后注入受损的心脏中,检测到BMSCs可表达心肌 细胞的表型,与未经FGF-2转染的BMSCs对比,经 FGF-2转染的BMSCs能更好地存活并更多地表达 心肌的表型,证明了FGF-2在诱导心肌分化中的重 要作用,其机制尚未明确,估计与丝裂原活化蛋白激 酶(MAPK),蛋白激酶c(PKC)等信号转导途径有 关.目前关于细胞因子在诱导BMSCs分化为心肌 细胞中的作用的研究不多,内环境中有许多细胞因 子对细胞的分化都有重要的作用,如TGF家族等, 但这些细胞因子是否都可对BMSCs分化为心肌细 胞产生调控,如果可以,其作用机制又如何?这些问 题还需进一步地研究. 4.2BMSCs可分化为血管内皮细胞形成新生血管 新血管形成是机体组织对缺血的内在反应,新 血管形成维持组织灌注,满足组织器官的生理需要. 近年来研究发现通过冠脉或心肌局部注射将 BMSCs导入缺血心肌部位可分化为血管内皮细胞, 促进局部血管新生,达到改善心肌缺血的目的,为心 肌细胞的新生和修复创造更好的条件.Tomita 等将BMSCs及经5一氮胞苷处理的BMSCs注射导 自体心肌疤痕组织内,8周后在所有移植BMSCs的 疤痕组织内均可看到有标记的移植BMSCs发育成 心肌样细胞,移植后心脏功能也有所提高,且可见疤 痕组织内有新生血管形成.Kinnaird等发现 BMSCs通过旁分泌作用释放血管原性生长因子,如 血管内皮生长因子(VEGF)及FGF.2等,从而促进 缺血部位新血管的形成,改善局部微循环.Silva 等把BMSCs注入急性心肌梗死模型中发现 BMSCs能分化为血管内皮细胞,加强血管生成的能 力,增强缺血部位再灌注,从而减少心肌的调亡,更 有效地提高心功能.而Yoon等则证明了BMSCs 在心梗后既能促进新血管的形成又有分化为心肌细 胞的能力.以上的实验研究都说明了BMSCs可分 化为血管内皮细胞促进缺血心肌组织的新血管形成 而促进心肌细胞新生和修复. 由此可见,BMSCs在缺血心肌细胞再生和修复 无论何种方式移植,血管新生 过程中起着重要作用, 必须与心肌再生同步,才能保证修复区域功能的完 整性,有效防止瘢痕的进一步形成.此外,新形成的 心肌细胞必须正确整合到心肌组织内才能有效改善 心脏泵血功能,否则,即使是一小块心肌不能发生整 合,也可能由于改变心脏的电传导和整体的收缩性, 对生命构成威胁H. 5BMSCs的应用前景及应用于临床前需解决的 问题 由于BMSCs具有取材方便,自体来源无免疫排 斥,能在体外扩增并分化成多种细胞,能促进缺血心 肌组织新血管的形成,不存在伦理问题等特点,其研 究具有广阔的应用前景,BMSCs可作为细胞移植的 重要来源,通过对缺血心肌细胞的再生和修复而达 到心脏修复的作用,为治疗心肌梗死等缺血性心脏 病提供一个安全理想的方法. 目前,关于BMSCs对心肌细胞再生与修复的作 用机制还不甚明确,对其在体内,体外的增殖和分化 的分子机制了解还比较少.以BMSCs作为临床治 疗的一个手段,还需解决以下几个问题:(1)可用 BMSCs治疗的心血管疾病类型.(2)研究一种能同 时促进心肌细胞再生和血管新生的治疗策略,因为 这两者对心室的重构及心脏的修复都有重要的意 义.(3)对于临床应用,其治疗的剂量,移植的途 径,治疗的时机,BMSCs在体内的增殖与存活时间, 如何提高BMSCs的分化能力,由BMSCs分化成的 心肌细胞的功能与存活时间,以及治疗后的随访时 间等问题都是必须解决的. 综上所述,BMSCs与缺血心肌细胞再生和修复 随着实验技术和研究方法的进步,以及 有密切关系, 对其相关机制研究的深入,BMSCs将成为防治缺血 性心血管疾病很有前途的新方法. 参考文献 [1]FriedensteinAJ,ChailakhyanRK.GerasimovUV.Bone marrowosteogenicstemcells:invitrocultivationandtrans. plantationindiffusionchambers[J].CellTissueKinet, 1987,20(3):263—272. 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