产碱性蛋白酶菌株的分离.

产碱性蛋白酶菌株的分离. 产碱性蛋白酶菌株的分离 摘 要 本 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 为了研究碱性蛋白酶的性质和它的相关作用，以及产碱性蛋白酶菌株的获得。设计内容主要分为两部分:产碱性蛋白酶菌株的筛选分为初选和复选;酶活力的测定;第一部分分为三个实验设计对菌株进行富集、平板分离初筛、药瓶发酵复筛;第二部分通过透明圈法初步进行测定再在不同温度不同PH下对酶性质进行测定，为碱性蛋白酶的研究和治疗提供一定的理论及实验基础。对碱性蛋白酶的应用提供理论依据，及时的将理论转化为生产力，提高工业生产的效益。 关键词:碱性蛋白酶; 菌株; 分离 1 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 目 录 第一部分: 文献综述 1(碱性蛋白酶 ..................................................................................................................3 1.1简介 .......................................................................................................................3 1.2碱性蛋白酶的理化性质 .......................................................................................3 1.3酶的结构和活性中心 ...........................................................................................3 1.4碱性蛋白酶的专一性 ...........................................................................................4 2. 碱性蛋白酶的分类 .......................................................................................................4 2.1命名 .......................................................................................................................4 2.2类型 .......................................................................................................................4 3. 碱性蛋白酶的应用 .......................................................................................................5 3.1碱性蛋白酶在食品中的应用 ...............................................................................6 3.2碱性蛋白酶在洗涤用品中得到广泛的应用。 ...................................................6 3.3 碱性蛋白酶在羊毛制品中的应用 ......................................................................6 3.4 碱性蛋白酶在词料工业中的应用 ......................................................................7 3.5 碱性蛋白酶在其它领域的应用 ..........................................................................8 4. 产碱性蛋白酶菌株 .......................................................................................................8 4.1生产菌株的种类 ...................................................................................................8 4.2 碱性蛋白酶工程菌的选择 ..................................................................................8 5. 碱性蛋白酶的研究前景 ...............................................................................................9 1 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 第二部分 课程设计部分 1. 材料 .............................................................................................................................12 1.1 土样 ....................................................................................................................12 1.2 培养基 ................................................................................................................12 1.3 主要实验仪器 ....................................................................................................12 2. 实验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 .....................................................................................................................12 2.1菌株的分离方法 .................................................................................................12 2.2 酶活力的测定 ....................................................................................................13 3 设计 ..............................................................................................................................14 3.1产碱性蛋白酶的分离 .........................................................................................14 3.2.碱性蛋白酶活力的测定 .....................................................................................14 4总结 ...............................................................................................................................15 5设计体会 .......................................................................................................................15 参考文献 ..........................................................................................................................16 2 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 第一部分 文献综述 1(碱性蛋白酶 1.1简介 碱性蛋白酶(alkaline protease) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类, 是一类非常重要的工业用酶, 广泛存在于动、植物及微生物生物体中, 在猪的胰脏中最早被发现。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 1.2碱性蛋白酶的理化性质 微生物的碱性蛋白酶的活性作用范围在PH值7-11之间，在酪氨酸中最适范围 [1]为9-11之间，它可以水解肽键、酰胺键、醚键以及转酯、转肽等。多数微生物产生的碱性蛋白酶耐热性差，我国生产的几种碱性蛋白酶耐热温度均在60?以下。 1.3酶的结构和活性中心 碱性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4万之间，等电点多为8.0-9.0，能作用于多数肽链，水解肽键生成二肽类物质。其除酶本身的氨基酸残基外,不具有特定的活 2+2+2+2+性基团,因此,一些金属离子(Fe,Mn,Mg,Zn等)对酶有激活作用。碱性蛋白酶属丝氨酸蛋白酶,具有蛋白质的基础生化性质,一些生化物质均能引起其变性失活,一 [2]些天然植物中也有蛋白酶抑制剂。 3 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 1.4碱性蛋白酶的专一性 碱性蛋白酶具有底物专一性,当它与底物结合时,依靠物理引力的作用,首先形成非共价的酶-底物复合物,接着丝氨酸轻基攻击底物,产生四面体中间产物,随后中间产物破裂,形成酶-产物复合物碱性蛋白酶的专一性强烈地受到切开位点两侧氣基酸残基,尤其是第1和第4位氨基酸残基的影响,较之血红蛋白或牛血清蛋白, [3]它更容易酶解酪蛋白。可将碱性蛋白酶分为四种类型,依据其对切开位点 基侧氨 [4]基酸残基的专一性: —、对如精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基具有专一性,该类酶与胰蛋白酶相似;二、如枯草杆菌碱性蛋白酶等,该类酶主要表现为对疏水性氨基酸残基或芳香族具有有较强的专一性;三、如溶解细菌细胞壁的蛋白酶,该类蛋白酶表现出对小分子脂肪族氨基酸残基具有专一性;四、如葡萄球菌碱性蛋白酶,该类酶对酸性氨基酸残基存在专一性。 2. 碱性蛋白酶的分类 2.1命名 碱性蛋白酶一般按照其所产菌株的名称进行命名,如丹麦诺维(Novo)公司的卡斯柏格枯草杆菌碱性蛋白酶(Subtilisin carlsberg)是卡斯伯格枯草芽孢杆菌生产的,碱性蛋白酶Subtilisin Novo是由另一株枯草芽孢杆菌Novo生产的,Nagase公司将 [5]枯草杆菌N所产的碱性蛋白酶取名SubtilisinBPN。 2.2类型 产碱性蛋白酶的微生物从生态上可以分成两类:一类是适于在中性pH条件下生长并产酶的细菌,如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等;另一类是只 [6]在pH 8-10的环境中生长和产酶的嗜碱微生物。碱性蛋白酶大致分为两种类型: A型,由短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌生产,其性质和结构与枯草芽孢杆菌喊性蛋白酶一致,这类菌株只产碱性蛋白酶;B型,由枯草芽孢杆菌淀粉糖化变种或枯草杆菌 4 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 NRRLB3411产生,与BPN或Novo枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的性质和结构一致,这类菌株既产碱性蛋白酶,又产中性蛋白酶。A、B两型碱性蛋白酶在免疫学分析上没有交叉反应,抗枯草杆菌NRRLB3411型(B型)血清与A型碱性蛋白酶混合后生成的沉淀极少。两种碱性蛋白酶的分子量分别为27532 Da和27287 Da,各有275和274个氨基酸残基。二者的一级结构和空间构象存在很大差异,一级结构中有83个氨基酸不同,但在活性部分的肽段第64-74、第218-229个氨基酸的顺序却完全相同。它们的性质相似,最适反应温度为6?,最适pH为10,都具有广泛的底物专一性,但A 2+.型更宽一些,而且稳定性不依赖于Ca。 3. 碱性蛋白酶的应用 酶作为一种重要的生物催化剂,在生物化学反应中发挥十分重要的作用,较化学催化剂,酶的催化作用所需条件温和。无论在蛋白质工程、细胞工程、基因工程和发酵工程都需要各种酶的参与,酶工程技术己成为生物工程技术的重要组成部 主要原因是酶催化反应分。酶工程技术之所以成为现代生物技术的一个重要支柱, 具有专一性、高效性、反应体系简单和产品回收高效等优点工业酶制剂市场自20世纪中页以来得到了蓬勃发展,尤其进入20世纪90年代后,市场对酶制剂的需求进一步增强。从总体来看,世界酶制剂的产量正以每年8%左右的速度递增,酶制剂的 [7]品种已由原来的十多个发展为数十个。蛋白酶在工业酶中用得最多,约占用酶总量的60%,其中碱性蛋白酶占25%。 碱性蛋白酶主要应用于食品、洗涤及制革等行业中，微生物蛋白酶均为胞外酶，它的处理技术相对简单、价格低、来源广、菌体易培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶的所有特性，以与工业化生产。近几年，碱性蛋白酶的研究有很大的进展，取得了许多可喜的成果，及时的转化成生产力，有很大的社会和生产效益。 5 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 3.1碱性蛋白酶在食品中的应用 碱性蛋白酶在食品加工方面主要用于蛋白的降解和修饰，使蛋白变成可溶性的肽而被提取;它可以对小麦的谷蛋白进行限制性的降解修饰，可以增加面团的韧性和机械强度;血液中2/3的蛋白质存在于血细胞是血红蛋白，血红蛋白消化吸收利 [8]用率低，用碱性蛋白酶水解血红细胞，可以提高蛋白质利用率。 3.2碱性蛋白酶在洗涤用品中得到广泛的应用。 加酶洗衣粉中的碱性蛋白酶制剂可以使奶渍、血渍等多种蛋白质污垢降解成易溶于水的小分子肽。用于洗涤剂工业的碱性蛋白酶主要以固体制剂的形式添加到洗衣粉中。为满足市场需要将酶加到洗衣液中。但由于在产品中的稳定性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 未能很好解决，影响了加酶液体洗涤剂、加酶洗衣皂等产品的生产应用。综合分析，对酶制剂影响较大的因素包括产品中的表面活性剂组成、pH值、储存温度、水分含量、金属离子含量、酶制剂的稳定助剂等。 通过研究证实?减少加酶皂体系中的水分含量可显著延长样品酶活力的储存时间。?硼砂和甘油作为蛋白酶稳定助剂能显著延长样品酶活力的储存时间。?加酶皂所用原料的前期处理不能忽视，应避免使用吊白块及强氧化性物质，慎重选用螯合剂种类及加量。?通过采取综合措施，为酶制剂构造合适的生存环境，酶制剂可以在洗衣皂中得到成功应用。现在一些大型洗涤用品生产工业用的是“复合酶体 [9]系”。 3.3 碱性蛋白酶在羊毛制品中的应用 在制革工业中,碱性蛋白酶主要应用于皮革软化与脱毛,其具有只分解间隙蛋白而不分解皮革中胶原的特性。酶脱毛具有简化生产工艺、缩短周期、提高成品质量、增加得革率、降低生产成本、改善劳动条件与环境卫生，变污水为农业肥等优点 。但是酶处理时不仅羊毛表层蛋白质会水解，而且反应也深入其内部。对酶而言要分 6 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 解覆盖在羊毛表面最外层含高交键度的胱氨酸鳞片层及疏水性外层角质细胞要比分解内层及细胞膜复合体(CMC)困难得多。因此在酶处理过程中，酶对羊毛内层分解损伤所引起的副作用已大大超过了酶处理的目标值—— 剥鳞和削棱。如何将酶的水解作用最大限度地限制在羊毛纤维表面，是当今科研攻关的首要问题。经研究发现，一种新型海洋碱性蛋白酶YS-894-122在处理羊毛方面可以较好的水解磷脂 [10]层，而对皮质层的损害比较轻微，表现出良好的处理羊毛特性及发展潜力。 3.4 碱性蛋白酶在词料工业中的应用 碱性蛋白酶已广泛应用于饲料工业中动植物蛋白的水解。随着产酶技术的日趋成熟及微生物碱性蛋白酶高产菌株的获得,使得碱性蛋白酶的产量更大、价格更低廉,更加易于实现工业化大批量生产。动植物蛋白经酶水解后,其饲用品质、营养价值和溶解性等得到提高。与酸碱法相比,酶法水解植物蛋白效率高、反应条件温和、产生毒性物质的可能性小,同时随着酶反应的进行,蛋白质的相对分子质量逐渐变 [11],并转化为肽或氨基酸,更利于消化和吸收小。大豆蛋白的氨基酸配比合理,生物效价及蛋白净利用率接近动物蛋白,且不含胆固醇,是较为理想的饲用蛋白资源。但是大豆中存在胰蛋白酶抑制剂等多种抗营养因子,限制了动物对大豆蛋白的吸收利用。蛋白酶抑制剂大多具有较高的耐热性,用加热方法不能彻底钝化豆类蛋白的胰蛋白酶抑制剂活性,长时间热处理虽可部分钝化抑制剂活性,但也破坏了大豆蛋白的必需氨基酸碱性蛋白酶不但可以纯化大豆胰蛋白酶抑制剂,提高大豆蛋白的吸收利用率,而且能够水解大豆蛋白,提高大豆蛋白的溶解性、乳化性、发泡性和消化吸 [12-13]收率,并产生一些具有生理功效的小肽。 血粉作为重要的蛋白饲料原料蛋白质含量丰富,但因其蛋白质分子质量大、且适口性差等缺点不利于动物的吸收利用,用碱性蛋白酶水解则可以降解大分子蛋白, [14-15]提高动物的消化利用率。 7 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 3.5 碱性蛋白酶在其它领域的应用 在制革工业中,碱性蛋白酶主要应用于皮革软化与脱毛,其具有只分解间隙蛋白而不分解皮革中胶原的特性。在纺织工业中,碱性蛋白酶能够除去生丝外层的丝胶,使苗层得以解舒,并使丝产生特有的柔丝的手感和丝光现象,同时减轻纺织行业的环境污染。在医学中,用于消肿清炎,同时治疗各种炎症。在X射线胶片回收银 [16]的过程中,应用碱性蛋白可以避免传统的燃烧方法处理胶片产生的环境污染。在基础研究方面,碱性蛋白酶对肽键的选择性断裂可以解释肽链或蛋白质的序列、结构和功能等方面的问题。 4. 产碱性蛋白酶菌株 4.1生产菌株的种类 碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，主要有芽孢杆菌(包括嗜碱性芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、马铃薯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)、一些真菌(如酵母)以 [17]及一些革兰氏阴性菌。 生产菌株还分为高温菌、低温菌和中温蛋白酶。高温菌可以从高温堆肥或废水污泥中筛选出来的产高温碱性蛋白酶菌株，其发酵所产的蛋白酶具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，并对表面活性剂、温和型去垢剂有超强的耐受性，具有巨大的潜在应用价值。低温蛋白酶具有低温易反应，高效活力，热损失少等优点，因此，在食品、环境修复、化妆用品、医药等领域有着中温蛋白酶无法比拟的优越性。 4.2 碱性蛋白酶工程菌的选择 目前研究较多的碱性蛋白酶表达系统有三种:酵母系统、大肠杆菌系统和枯草芽孢杆菌系统。 8 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 酵母菌系统:巴斯德毕赤酵母(Pichiia pastoris)是甲醇营养型酵母表达系统中发展较为完善的一种,其作为表达外源蛋白宿主菌的优点是:具有调控外源基因的表达强启动子;可以修饰和加工表达的蛋白,使其有活性;同时生长快,易于培养,适应工业化批量生产;自身分泌的蛋白种类少,利于纯化。 大肠杆菌系统:大肠杆菌易培养、转化效率高、生长繁殖快、培养基价格低廉,可以快速生产大量的蛋白酶。它对外源基因产物的表达水平高于其他表达系统,因此是目前应用最广泛的蛋白酶表达系统。Fu克隆了嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热碱性 [18]蛋白酶基因,并成功转入大肠杆菌,直接将重组酶分泌到培养基中。刘新育从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因后,在大肠杆菌中获得表达,并表现出蛋白酶 [19]活性。 芽孢杆菌系统:芽孢杆菌具有良好的分泌特性,其发酵工艺和产物回收技术也较成熟,故广泛用作外源蛋白的分泌型宿主菌。短小芽抱杆菌胞外分泌能力较强,然其分泌的蛋白酶的活性却很弱。短小芽孢杆菌HPD31的所产胞外蛋白酶活性几乎 短小芽孢杆菌47的所分泌的蛋白酶酶性只是芽孢杆菌的1.6%。目前无法检测到, [20]许多已成功构建的有效的外源蛋白分泌载体,都是利用短小芽孢杆菌的优点。 5. 碱性蛋白酶的研究前景 目前,我国碱性蛋白醃研究己经深入到分子水平,利用基因工程和蛋白质工程技术对碱性蛋白酶产生菌定向改造是未来的一个发展方向。随着生物技术基础研究的深入和应用技术的完善,碱性蛋白酶研究将会进入一个薪新的阶段。我国碱性蛋白酶研究方向很可能会转向:一、运用生物技术和蛋白质技术进一步提高工业微生物菌种产酵基因的表达效率,选育耐热、耐碱、抗唾菌体和抗氧化的碱性蛋白酶高产菌株。二、建立新的碱性蛋白酶基因宿主表达系统,为碱性蛋白酶基因构建更多的表达载体。三、为蛋白酶的应用开拓新的渠道,特别是在医学(生物制药及化疗等) 9 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 及生物技术领域中的应用。四、选育耐极性碱性蛋白酶产生菌,如耐低温碱性蛋白酶产生菌和耐高温碱性蛋白酶。 10 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 第二部分 课程设计部分 产碱性蛋白酶菌株的分离 碱性蛋白酶是一类非常重要的工业用酶，广泛存在于动、植物及微生物体中。有数据显示，全世界T业用酶每年销售额大约为1亿美元，在所有的工业用酶制剂中，75,是水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60,左右。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途 。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点 。国内的产碱性蛋白酶菌株的应用还受到一定条件的限制。所以本实验通过对产碱性蛋白酶菌株的筛选分离，以及所产出的酶的性质进行相关研究测定，为工业生产中产碱性蛋白酶菌株的获得提供了理论基础。 11 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 1. 材料 1.1 土样 肥沃菜园土，海水，校园土各一份。 1.2 培养基 平板培养基(,):酵母粉1.5g，蛋白胨0.5g，氯化钠0.5g，琼脂1.6g，pH9。 分离培养基(,):酵母膏1.5g，脱脂奶粉0.5g，琼脂1.6g，pH9。 种子培养基(,):葡萄糖1.0g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，KHPO0.1g，MgSO24 4 0.02g， NaCO 1.0g，pH9。 23 发酵培养基(,):酵母膏1.5g，葡萄糖1.0g，蛋白胨0.5g，pH9。 酶活力测定培养基(,):脱脂奶粉2.0g，琼脂1.6g，pH9。 1.3 主要实验仪器 振荡摇床ZHWY -2102C 上海天能科技有限公司 SHH.W21.600 美国 Thermo 公司 三用电热恒温水箱 上海森信实验仪器有限公司 TGL-16台式离心机 北京医用离心机厂 721型分光光度计 美国Bio-Rad公司 2. 实验方法 2.1菌株的分离方法 2.1.1 土样采集 选取采集地点地表植被根系周围的土壤，先除去地表浮土及植被根系，然后挖取深约5cm的土壤样品。每个取样3-5个样点，每个约50g。装入灭菌牛皮纸袋中，4 冰箱中保存。 从海域浅滩采取下层泥土3份(挖去上层5-10 cm土层)，用无菌手套装取，4 ?冰箱中保存。 2.1.2 样品处理 将士样混合均匀，4?冰箱保存。 12 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 2.1.3 菌株分离(平板分离法) 土样稀释 :将土样分别取10g分别装入90mL无菌生理盐水的三角烧瓶中， -3-4-5100r/min旋转摇床培养20min，取出按常规稀释法稀释土样。保留l0，10，10 的土壤稀释液待用。 -3-4-5涂布与培养:取10，l0，10 稀释液分别涂布于平板培养基上，每个浓度涂布3个培养皿。37? 恒温箱倒置培养24h。 观察与保存:培养24h、48h后，挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。 2.1.4 初筛 采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。37?恒温培养箱中培养24h。通过观察水解圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低，挑选产生透明水解圈大的单菌落接2环于装有5mL液体发酵培养基的无菌试管中，30?条件下旋转摇床培养24h。发酵液经5000r/min离心6min钟后，用5mm方形滤纸片粘上清液贴于酪蛋白平板上，于30?条件下保温24h。然后用直尺测出菌落与透明水解圈直径，根据平板上水解圈直径和菌落直径的比值(R/r)，选出比值较大的菌株。 2.1.5 复筛(摇瓶发酵) 将初筛得到的3种菌株(R1，R2，R3)分别接于pH9的发酵培养基中，30?摇床培养24h。取发酵液离心后即得粗酶液，用移液枪取200umL粗酶液点于酪蛋白平板 种粗酶液点于同一上。为做透明圈大小的对比，以此筛选出产酶活力较高菌株，3 个培养皿上，共点3个平皿，37? 保温24h。 2.2 酶活力的测定 菌株R1经斜面活化后接种于发酵培养基中，30?条件下摇瓶发酵48h，取其发 rmin离心10min，用pH7.2磷酸缓冲液稀释100倍，冰箱保存待用。用酪酵液5000r, 蛋白为作用底物，在一定的pH和温度下用等量的酶液经一定时间反应，并用三氯醋酸终止反应，使未反应的酪蛋白沉淀。然后过滤，取滤液，用分光光度计测量波长为280nm吸光度。为消除酶制剂本身发色基团对测定结果的影响，以失活酶为空白。根据吸光度求算出释放出的酪氨酸的量。 不同温度下酶活力的测定:用7支试管分别取10ml的稀释酶液，2mL 2, 的酪 13 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 蛋白分别在10?、20?、30? 、40? 、50? 、60?、7O? 的恒温水箱中反应10min后用TCA中止反应使未反应的酪蛋白沉淀、过滤，取上清液测量光密度。计算酶活力。 不同pH条件下酶活力的测定:用7支试管分别取10mL的稀释酶液，2ml 2, 的酪蛋白在pH分别为5、6、7、8、9、10、11、12的条件下30?恒温水浴箱中反应10min 后用TCA中止反应使未反应的酪蛋白沉淀、过滤，取上清液测量波长280nm处的光密度。计算酶活力。 酶活力的精确测定:R1菌种接两环于pH为9的发酵培养基中，摇床培养48h，取发酵液离心得粗酶液，取lmL酶液，用pH9.0磷酸缓冲液稀释100倍并调pH到9。取 10mL稀释酶液，加2ml 2.0,酪蛋白溶液，30?水浴恒温反应20min，然后用2mL 0.04M的TCA中止反应，使未反应的酪蛋白沉淀 。去沉淀，得到的上清液再稀释10倍，在分光光度计上测量波长280nm处的吸光度。 酶活力定义:在30? pH为9的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 酪氨酸的酶量为一个活力单位，用U表示。 3 设计 3.1产碱性蛋白酶的分离 样品的稀释菌株的富集，将取的样加入培养基培养，将培养后的试样分别稀释-3-4-510，l0，10，将稀释后的样品分别涂布在平板上，培养24h后选出大的菌落待用。 初筛，用透明圈法，将得到的单菌落用划线法划在平板上根据透明圈大小出步选出产碱性蛋白酶的菌株，将透明圈大的菌株在液体培养基培养纯化后接种到酪蛋白平板培养，根据平板上水解圈直径和菌落直径的比值(R/r)，选出比值较大的菌株。 复筛(摇瓶发酵)，将初筛得到的几种种菌株(R1，R2，R3)分别接于发酵培养基中培养。取发酵液离心后即得粗酶液，用移液枪将粗酶液点于酪蛋白平板上。为做透明圈大小的对比，以此筛选出产酶活力较高菌株。 3.2.碱性蛋白酶活力的测定 菌株经斜面活化后接种于发酵培养基中发酵，取其发酵液离心，得到酶液。用 14 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 酪蛋白为作用底物，在一定的pH和温度下用等量的酶液经一定时间反应，并用三氯醋酸终止反应，使未反应的酪蛋白沉淀。然后过滤，取滤液，用分光光度计测量波长为280nm吸光度。为消除酶制剂本身发色基团对测定结果的影响，以失活酶为空白。根据吸光度求算出释放出的酪氨酸的量。 不同温度下酶活力的测定:用一定量稀释酶液和过量的酪蛋白分别在不同温度的恒温水箱中反应一定时间后用TCA中止反应使未反应的酪蛋白沉淀、过滤，取上清液测量光密度。计算酶活力。 不同pH条件下酶活力的测定:用一定量稀释酶液和过量的酪蛋白分别在不同PH的培养基中反应一定时间后用TCA中止反应使未反应的酪蛋白沉淀、过滤，取上清液测量光密度。计算酶活力。 酶活力的精确测定:菌种接发酵培养基中，摇床培养，取发酵液离心得粗酶液，一定量酶液。稀释酶液，加到一定浓度的过量酪蛋白溶液中，在上述测的的最适温度和最是PH下，恒温反应一定时间，然后用TCA中止反应，使未反应的酪蛋白沉淀 ，去沉淀，得到的上清液再稀释10倍，在分光光度计上测量波长280nm处的吸光度。计算酶活力。 4总结 本设计从土壤和海水中分离产碱性蛋白酶的菌株可以通过透明圈法进行初选，再用发酵培养法进行复选分离出产碱性蛋白酶的菌株，并用分光光度计对菌株所产的碱性蛋白酶的酶活力进行测定从而选出高产菌株。 5设计体会 通过本次课程设计，让我对碱性蛋白酶的应用有一定的了解，对菌株的分离方法方法，如透明圈法，发酵培养法等方法有了更深刻的印象，并对酶活力的测定进行了进一步的探究和了解。 在设计过程中我遇到了几个难题，起初我对分离纯化的认识不是太全面，后来随着参考资料的进一步阅读和理解，还有和同学的讨论，最终提出和完成了自己的设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，此外在设计过程中和设计方案的书写过程中也遇到了问题，在什么是方法什么是设计，方法和设计之间有什么区别，该如何书写方法和设计，这一问题让 15 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 我很伤脑筋，最终通过和同学的讨论决定用本设计的书写方式。在书写论文的时候 在排版格式和内容上和老师所给模板有所出入，经过再三的修订最终定稿。 这门课程马上要接近尾声了，看着自己这些天通过奋斗设计的成果，在欣慰的 同时也认识到自己的不足。这门课程设计对我来说是一次学习和提高的经历，他将 会激励我今后更加努力得学习和丰富自己。在此次学习课程中，我将以往那些学到 的专业知识得意加强和综合，更有助于我们下一步的学习。同时使自己在专业知识 以及联系实际的理论方面都有所提高，以前课本上的知识是理论，没有机会结合并 运用于实践中，借着这次课程设计，将一些理论与实际联系起来进行了一定的结合， 虽没真正实践，但也比之前有了更多 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 ，对这些知识有了更深刻的理解。这次课 程设计不仅提高了我的专业知识，提高自己的思维动手能力，同时也提高了我的计 算机水平。这次课设对我来说是一个非常难得的学习机会。 对此我非常感谢学校给我们开设了这门课程和张晓宇老师对我们的悉心指导， 崔红霞老师严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样;感谢崔红霞 老师对我们的指导与批评，使我们在课程设计过程中学到更多东西，让我受益匪浅。 也感谢我的同学在我设计过程中给予的帮助和支持，在此对他们表达我真挚的谢 意～ 参考文献 [1] Gupta R, Beg Q K, Lorenz P. Bacterial alkaline proteases; molecular approaches and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 59(1): 15-32. [2] 刘向宇. 一株碱性蛋白酶产生菌的分离与应用[D]. 湖南农业大学, 2011. [3] Amoozegar M A, Malekzadeh F, Malik KA, et al. Halobacillus karajensis sp. Nov. a novel moderate halophile[J]. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 2003, 53: 1059-1063. [4] Karbalaei-Heidari H R, Amoozegar M A, Hajighasemi M, et al. Production, optimization and purification of a novel extracellular protease from the moderately halophilic bacterium Halobacillus karajensis[J]. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 2009, 36: 21-27. 16 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 [5] Ueda M, Kubo T, Miyatake K, et al. Purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease from Fusarium sp. BLB[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007,74: 331-338. [6] 杨胜远, 陆兆新. 微生物低温碱性蛋白酶的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2004, 30 (4): 93-97. [7] Ates O, Oner E T, Arikan B, et al. Isolation and identification of alkaline protease producer halotolerant Bacillus licheniformis strain BA17[J]. Annals of Microbiology, 2007, 57 (3): 369-375. [8] 夏凡, 琚争艳. 微生物碱性蛋白酶在食品工业中的应用及其安全性研究进展[J]. 山东食品 发酵, 2008, 149(2): 19-22. [9] 张德昌. 碱性蛋白酶在洗衣皂中的应用研究[J]. 中国洗涤用品工业, 2011, 4: 73-76. [10] 郝建华, 刘均忠. 海洋碱性蛋白酶性质研究及其在羊毛加工中的初步应用[J]. 毛纺科技, 2011, 36(11): 1-5. [11] 薛林贵. 我国碱性蛋白酶的应用及研究进展. 微生物学通报[D], 1997, 24(6): 370-371. [12] 陆阳, 杨雨虹, 王裕玉等.不同比例膨化豆粕替代鱼粉对虹鳟生长、体成分及血液指标的影 响[D].动物营养学报,2010,22 (1): 221-227. [13] 吴胜华, 李吕木, 张邦辉等.多菌种固态发酵豆粕生产小肽饲料. 食品与发酵工业, 2008, 10 (34): 113-115. [14] 方俊, 卢向阳, 马美糊等. 利用微生物发酵猪血粉研究现状[J]. 食品与发酵工业, 2004, 9 (30): 93-95. [15] 范远景,庞伟,史鸿云等.枯草芽孢杆菌发酵猪血蛋白肽工艺初步研究.安徽农业科学,2009,37: 7184-7186. [16] 方海红, 胡好远, 黄红英等. 微生物碱性蛋白酶的研究进展[D]. 微生物学通报, 2002, 29 (2): 57-59. [17] 伍先绍, 贺稚非. 碱性蛋白酶产生菌株的筛选及酶学性质研究进展[J]. 中国食品添加剂, 2008, 12(2): 58-61. 17 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 [18] Fu Z, Hamid S B, Razak C N, et al. Secretory expression in Escherichia coli and single-step purification of a heat-stable alkaline protease[J]. Protein Expression and Purification, 2003, 28: 63-68. [19] 刘新育, 张品品, 李林珂. 枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达[J]. 生物技术, 2007, 17: 13-16. [20] 徐雅芫. 碱性蛋白酶产生菌筛选及其apr基因表达与酶学特性的研究[D]. 安徽农业大学, 2012. 18