促黄体生成素及其检测与免疫

促黄体生成素及其检测与免疫 促黄体生成素及其检测与免疫 中国畜牧兽医2007年第34卷第12期经验交流?147? 促黄体生成素及其检测与免疫 杨献福.和钰 (1.云南省丽江市玉龙纳西族自治县龙蟠兽医站,丽江674100;2.云南农业大学动物 科学技术学院,昆明650201) 中图分类号:Q575.12文献标识码:B文章编号:1671—7236(2007)12-0147—03 2O世纪6O年代末,在内分泌学,免疫学,生物 化学等学科迅速发展的基础上,兴起了一门边缘学 科——激素免疫学.即以激素作为抗原,产生抗体 即抗激素(antihormone),然后以激素抗体主动或被 动地中和动物体内相应的激素,使该激素的生物活 性降低或全部丧失,引起内分泌平衡的改变,从而发 生各种生理变化.借此可以研究激素的生理功能, 作用机理,以及可能由此而产生的有意义的生物学 效应.目前,主要的生殖激素都已用于激素免疫的 研究,涉及到猪,牛,羊,马,犬,兔,鼠,猴等多种动物 和人.作者主要对促黄体生成素(LH)及其检测方 法,免疫的用途等作简要的介绍. 1促黄体生成素的概述 促黄体素(LH)又称为促黄体生成素(1uteini— zinghormone),在公畜称为促间质细胞素(ICSH), 它是由促黄体素细胞(1uteinizinghormonecells, LHgonadotrops)分泌的,促黄体素细胞呈圆形或 多角形,嗜碱性,颗粒直径为100,200nm,PAS染 色呈阳性. 1.1分子组成促黄体生成素由a和两个亚基 组成,属于糖蛋白,含有219个氨基酸.除垂体外, 大鼠丘脑下部分布有类似LH的免疫活性物质,它 收稿日期:2007—06—06 然界砷含量的最高背景值15mg/kg.长期施用猪 粪作为肥料的稻田,大多数土壤砷含量已超过国家 规定的最高标准;另外,水稻有一定的砷富集能力, 而且水稻各种组织的砷含量与土壤的砷含量也存在 明显的正相关.而实践证明,饲料金霉素的残留问 题并不严重,稍加注意就能控制,金霉素作为饲料添 加剂是安全,可靠的.世界上多年的实践已证明,连 续使用金霉素饲料添加剂,具有持续效果. 所以在生长育肥猪的生产上金霉素可以完全代替 阿散酸,而不会对其生长性能和屠宰性能产生影响,还 能有效地保护环境,实现养猪生产的可持续发展. 对垂体前叶LH的释放具有负反馈调节的作用;在 6,8d的兔胚泡和18d的牛孕体中也含有类似 hcG—LH样物质,可以刺激离体黄体细胞合成孕酮. 就分子结构而言,同一种动物LH,FSH和TSH三 者的a亚基分子量相同,可以互换,它们的生殖功能 与p亚基有关.因此它们可能起源于共同的祖先结 构基因(ancestalstructuralgene),然后再分出3种 不同的激素.促黄体素的a一和一亚单位均由不同的 基因编码.a一亚单位只有一个基因(人的位于第六 染色体上),在所有分泌糖蛋白激素的细胞类型中均 有 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达.a一亚单位基因的长度超过13.5kb,含有4个外显子和3个内含子.第1个内含子的大小在不 同的动物之间变化很大,小鼠为10kb,人6.4kb, 大鼠5.4kb.其翻译序列开始于外显子?第15个 碱基,包括外显子?的全部和外显子?的前75个碱 基.p基因包括调节因素的各种不同成分.p一亚单 位的同一性决定了由激素a,p异种二聚体表达的生 物学活性类型.但并不由任何分离的亚单位所表 达.许多试验结果证明,a一和一两种亚单位与受体 起着交互作用,a一亚单位与一亚单位的相互作用具 有两种很明确的补充功能:?引起a一亚单位的"活 ,能够与受体高亲和力地结合.?辨别受 性"结构 体,以抑制其他激素的结合,从而发生确切结合. 参考文献 1王付民,陈杖榴,孙永学,等.有机砷饲料添加剂对猪场周围及 农田环境污染的调查研究.生态,2006,26(1):154,161. 2刘忠琛.浅谈无公害猪肉生产存在的问题[J].河南畜牧兽医, 2004,5. 3孙棉龄.砷的毒性及其环境卫生标准[J].四川I环境,1994,4. 4杨洁彬,王晶,等.食品安全性EM].中国加工业出版社,1999. 5曹志坚,廖胜,等.阿散酸对肥育猪的饲喂效果[J].湖南饲料, 2000.5. 6曹爱智,王振勇.不同砷制剂添加剂量对雏鸡免疫功能的影响. 中国畜牧兽医,2006,33(10):24,26. ?148?经验交流中国畜牧兽医2007年第34卷第12期 1.2促黄体生成素的分泌GnRH严格的控制着 垂体LH的分泌,LH的脉冲式分泌可密切的反映 GnRH的脉冲式分泌.GnRH对LH分泌的作用 受磷酸肌醇路径的调控,LH对生物合成的刺激作 用又受cAMP的调控.在迄今研究过的大多数哺 乳动物中,其垂体中LH的量比FSH高出5,1O 倍.GnRH迅速刺激LH的分泌及生物合成,以便 大量贮存.显然GnRH是LH分泌的主要调节因 素,大部分内因(性腺反馈)或外因(光周期,外激素 等)都是通过GnRH的调节而发生排斥作用. 1.3LH对母畜的作用?LH协同FSH发生作 用,促进卵泡成熟,粒膜增生,使卵泡内膜产生雌激 素,并在与FSH达到一定比例时,导致排卵,对排卵 起着主要作用.?排卵之后,LH使粒膜形成黄体,产 生孕酮.在牛,猪及人上,还可以促使黄体释放孕酮. 2促黄体生成素的检测方法 Concannon等(1987)在小猎兔,母犬的黄体期 或妊娠期,给予马抗LH血清或多巴胺激动剂溴麦 角环肽(bromocriptine),都能引起孕酮水平降低. 促性腺激素免疫对动物生育力的控制具有积极意 义.Johnson等(1989)又把牛LH连于卵白蛋白, 分别以FCA,M103,6VR为佐剂对处女牛进行主动 免疫,在FCA和M103组均获得了确实的避孕效 果.接着DeSilva等(1986)在奶牛上进行LH免 疫,未发现对FSH的影响,用LH免疫大鼠,排卵受 到抑制,但卵泡发育正常.近几年,对促黄体生成素 免疫的研究有了新的进展,现在应用免疫学技术测 定促黄体生成素在动物和人体内的含量以下几种方 法应用的比较多. 2.1酶联免疫技术?应用单克隆与多克隆抗体 相结合的酶联免疫测定法,检测生育期妇女尿液促 黄体生成素的分泌峰值期,用以预测排卵时间,是一 种新型的检测排卵方法.该法引进了北京红十字生 物医学发展研究所与加拿大生物科技有限公司联合 生产的"双重预测LH.HCG"试剂盒,为测定排卵提 供了一种新型的检测方法.采用晨尿定性测定LH 峰值期,预测排卵是一种无创伤,经济,方便而又准 确的方法.?尿LH酶联免疫法是一种既准确又经 济预测排卵的有效方法,可在阳性48h内实施不孕 症的治疗.尿LH酶联免疫法具有操作简便,可连 续测定,反应快速敏感,价格低廉,亦可用于家庭自 测等优点.?用磁性微粒分离免疫酶联法测定血清 中促黄体生成素,观察其线性范围,试剂显色稳定 性,精密度,准确度以及放免配对比较等.该方法具 有重复性好,特异性高,准确可靠,与RIA具有良好 的相关性,且无放射性污染,值得推荐.磁性微粒分 离酶标免疫技术是一种非同位素标记免疫检测的先 进技术,称为磁性免疫技术(MAIA).磁性微粒分 离酶标免疫技术将免疫磁性微珠分离技术引入酶联 免疫测定法中,用非同位素标记的碱性磷酸酶 (ALP)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记单克隆抗体, 与抗原(LH)反应形成酶标记抗体一抗原一FITC标记 抗体的复合物与磁性微粒结合,在永久磁体吸引下 使其沉淀至管底,分离出游离酶标抗体,加入底物磷 酸酚酞(PMP),ALP催化PMP水解释放出酚酞,在 PH10.5的缓冲液中粉红色,再以永久磁体吸引磁 性复合物使其沉淀,上清液置Seroeyme型酶标免 疫分析仪测定.由于抗原抗体反应在液相中进行, 不仅反应速度快,而且均匀,整个检测过程仅需1, 2h,时间明显短于固相分离.本方法表明以碱性磷 酸酶为标记物,磷酸酚酞作为基质,酚酞呈色稳定, 重复性较好.将两份不同浓度的临床血清标本作连 续测定,观察其精密度:批内差异(n一10),LH平均 为1.94;批间差异(n一5),LH平均为8.0.同 时,分别将不同浓度的LH加到标本中,作回收试验 检测其精确性,结果LH平均回收率为104.5,表明 该方法具有较高的精密度和精确度,能满足临床检 测需要.所以认为磁性微粒分离酶标免疫技术是一 项值得推荐的微量物质检测法. 2.2放射免疫分析技术LH常用放射免疫分析 (RIA)方法.陈所淑等研制的LHRIA试剂盒,采 用非平衡法和试剂分离技术,操作简便,反应快速, 结果准确可靠.操作程序是:标准或样品加抗体于 37?温育30min,然后加标记物,与37?温育1.5h, 加PR试剂后即可进行离心分离.全部操作可在 3h内完成.本试剂盒的方法学鉴定结果:?灵敏 度为0.8mIU/ml;?精密度:批内变异系数为 2.0,5.99/5(n一6),批间变异系数为3.6, 6.5(n一20);?准确性:在加入量15,120mIU/ ml范围内,平均回收率为(105.9?3.4);?健全 性:血样稀释呈直线Y一0.79+100x,r一0.998;? 特异性:LH抗体与LH,FSH,TSH及hCG的反应 交叉率分别为100,2.19/6,0.12及9.53;?稳 定性:a.试剂盒稀释前的稳定性:将同批试剂盒分别 中国畜牧兽医2007年第34卷第12期经验交流?149? 置于4?,15d,20?,15d,37?,8d然后同时做 RIA,并各带质控样品.结果表明:由上述试剂盒所 得标准曲线的各相应质量技术参数没有差异,而且 所测质控样品低,中,高的测定值均在x?S的范围 内.b.试剂盒稀释后的稳定性:试剂盒稀释后置于 4"C,分别于1和2个月时做RIA,共测了3批试剂 盒.结果为:2个月后试剂盒的NSB?1.8, B在24.59/6,35.4,所测质控样品低,中,高的 测定值均在x?2s范围内.方法学鉴定结果表明: 本试剂盒的技术性能良好,符合RIA的要求. 2.3电化学发光技术生殖内分泌功能检测由过 去的生物,化学,酶免疫,放射免疫发展到现在的电 化学发光免疫检测(ECLIA),ECLIA是近年发展较 快的检测技术,其优点是不使用酶,而直接用发光物 质稀土元素钌进行标记抗原和抗体,用链霉亲和素 包被的磁颗粒作结合/游离(B/F)分离,利用电极板 上的氧化还原反应在电极上施加电压产生化学发光 光谱来进行分析测定.Elecsys2010分析仪具有灵 敏,精确,稳定,用血量少及快速等优点,该仪器具有 完善的报警系统,并且设有15个ECuA试剂通 道,3O个样品位连续进样,标本输入后18min出第 一 个结果,急诊标本可随时输入,15min即出结果. 该法因不使用酶,不需催化剂,故避免了许多影响因 素,大大提高了检测速度.ECLIA测定之前,只需 两点定标便可作同一批号试剂测定,且全自动操作 分析,而经典放射免疫分析法于每次试验时需作一 条标准的曲线,手工加样,试验反应时间长,放射性 核素标记试剂有效期短,存在环境污染.可见 ECLIA就显得较RIA简便,快捷,节省试剂,误差 小,且用ECLIA测定无放射性污染的发生.目前 国内尚未见到用ECUA测定过人性激素的正常参 考值的报道,无国内的正常值,国外参考值范围太 大,对临床应用缺乏指导意义.各实验室应建立自 己的正常参考范围,才能为临床提供可靠的诊断 依据. 3促黄体生成素免疫的应用 ?在畜牧兽医实践中,利用hCG与LH的免疫 反应可以控制动物的生育力.Johnson等(1989)就 用hCG主动免疫处女牛,达到了避孕的目的.通过 检测动物体内如牛,羊体内的LH水平,就可以预测 动物的排卵时间,以便在适时的时候进行授精,提高 受胎率.?检测体内的LH水平是一个用于诊断女 性不孕症的重要手段.而且对于诊断和研究下丘脑 垂体一性腺轴的功能有着重要的意义.?用于激素 的纯化工作.采用化学方法,从某种组织或器官提 取的激素,往往不是纯净的产品,要想进一步研究其 化学结构,找出活性片段,就必须加以纯化.可以选 用不同的色谱法(如柱层色谱,薄层色谱,气相色谱, 液相色谱等技术),也可以采用激素抗体中和法.如 从垂体提取的FSH,大约混有1O的LH,为了得 到纯净的FSH,就可以利用抗LH抗体,中和LH, 将LH除去. 参考文献 1王相男,刘克义,程义亮,等.斑点免疫金染色法检测恶性疟原虫 循环抗原fJ].中华医学检验杂志,1994,17(1):43,44. 2刘英.快速斑点免疫结合试验的研究进展fJ].微生物学与免疫学 进展,1998,26(4):84,86. 3刘煜凯,陈伟明,马以秀,等.兔疫层析法作早孕快速诊断测定 fJ].中华医学检验杂志,1995,18(6):364,367. 4周继文,戎广亚,杨守纯,等.胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病 毒表面抗原fJ].中华医学检验杂志,1998,21(1):3O,32. 5邵祝洪,胡建成,金志坚,等.点免疫金渗滤怯检测结核杆菌特异 性抗体fJ].浙江中西医结合杂志,1999(4):232,233. 6郑葵阳,杜文乎,刘宜升,等.快速斑点免疫金染色法检测抗囊尾 蚴抗体的初步应用fJ].地方病通报,2002,17(2):14,17. 7饶贤才,俞树荣,李芹阶,等.免疫金法检测贝氏柯克斯休[J].中 华检验医学杂志,2000,23(1):47. 8BuechlerKF,MolS,NoarB,eta1.Simultaneousdetectionofsev— endrugsofabusebythetriagepanelfordrugofabuse.Clin Chem,1992,38:1678,1684. 9GenaroO,MeloMA,CostaRTD,etal,EvaluationoftheIm— munochromatographyassayforthediagnosisofcanineviaceral leishmaniasis.Aprospectivestudyonexperimentallyinfected dogswithleishmaniachagasi.MemoriasdoInstitutoOswaldo Cruz,1996,91:192,193. 10HuangQ.LanX,TongT.eta1.Dotinmmuneogoldfiltrationas— sayasascreeningfestforsyphilis.JClinMicrobiol,1996,34 (8):2011,2013. 11LouSC,PatelC,ChingS,eta1.One—stepcompetitiveimmuno— chromatographicassayforsemiquantitativedeterminationoflip— oprotein(a)inplasma.ClinChem,1993,39:619,624. 12SpielbergF,KabeyaCM,RyderRW,eta1.Fieldtestingand comparativeevaluationofrapidvisuallyreadscreeningassaysfor antibodytOhumanimmuneodeficiencyvirus.Lancet,1989,1: 580,584. 13ValkirsGE.BartonR.Immunoconcentrationanewformatfor solidphaceimmunoassays.ClinChem,1985,31:1427,143I.