枣仁安神胶囊中丹参酮ⅡA的含量测定

枣仁安神胶囊中丹参酮ⅡA的含量测定 枣仁安神胶囊中丹参酮?A的含量测定 June 2013, Vol.11, No.18 Guide of China Medicine 100实验研究枣仁安神胶囊中丹参酮?A的含量测定 徐 晏 (浙江医药高 等专科学校,浙江 宁波 315000) 摘要】目的 方法 【 为后续制订枣仁安神胶囊的质量控制指标提供参考依据。 利用高效液相色谱法测定枣仁安神胶囊丹参酮? A 的含量。 结果 丹参酮? A 在 4.04 ~ 36.32μg 之间线性关系良好,r0.9999,丹参酮? A 平均回收率为 98.36%,RSD2.01%。结论 该方法准确、 专属性强、重现性好,可作为本品中丹参酮? A 的含量测定方法。 【关键词】枣仁安神胶囊;丹参酮? A;高效液相色谱法 中图分类号:R282.710.3 文献标识码:B文章编号:1671-8194(2013)18-0100-02 枣 仁 安 神 胶 囊 由 酸 枣 仁 、 丹 参 、 五 味 子 等 中 药 材 组 成 , 经 过 多 年 析 醇, 水 为 重蒸馏 水,0.45 μm 微 孔滤膜 。 的 临 床 实 践 证 明 , 对 神 经 衰 弱 患 者 心 、 肝 血 虚 症 引 起 的 失 眠 , 兼 有 头 2 含量测定 晕 、 健 忘 等 症 有 显 著 的 疗 效 , 处 方 中 所 含 有 的 丹 参 酮 ?A 是 主 要 有 效 2.1 色 谱条件 成 分 之 一 。 本 文 利 用HPLC 法 对 其 所 含 成 份 中 的 丹 参 酮 ?A 含 量 测 定 , 岛 津LC-2010AT 型 高 效 液 相 色 谱 仪 ;UV 紫 外 检 测 器 ;Diamonsil 为以 后制 订该制 剂的 质量控制指标 提供参考依 据。 C18 色 谱 柱 (5 μm ,200 ×4.6mm ) ; 检 测 波 长 :270nm ; 流 动 相 为 甲 1 仪器与材料 醇- 水(75 ?25); 流速1mL/min ; 柱 温40?。 岛 津LC-2010AT 型 高 效 液 相 色 谱 仪 ,AL204-IC 型 电 子 分 析 天 平 2.2 对 照 品 溶液 的制备 (d0.0001g , 梅 特 勒- 托 利 多 仪 器 ( 上 海 ) 有 限 公 司 ) , 市 售 枣 仁 精 密 称 取 丹 参 酮 ?A 对 照 品10mg 置 于50mL 棕 色 瓶 中 , 加 甲 醇 溶 解 安 神 胶 囊 (091201 , 贵 州 同 济 堂 制 药 有 限 公 司 ) , 丹 参 酮 对 照 品 并 稀 释 至 刻 度 , 摇 均 。 再 从 中 精 密 量 取5mL 置 于50mL 棕 色 量 瓶 中 , 加 (1241-200302 , 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 研 究 院 ) , 甲 醇 为 色 谱 醇 和 分 甲醇稀 释至 刻度, 摇均 ,即得 。 射 可 引 起 小 鼠 睾 丸 和 精 细 胞 的 形 态 学 及 超 微 结 构 变 化 , 并 发 现 辐 照 时 胞 自 我 清 除 , 凋 亡 过 多 则 导 致 过 多 的 细 胞 死 亡 , 影 响 脏 器 甚 至 机 体 的 间 相 同 而 辐 照 次 数 不 同 的 精 子 畸 变 率 无 明 显 差 异 , 提 示 超 声 辐 照 对 生 功 能 导 致 疾 病 。 神 经 系 统 的 发 育 是 在 神 经 细 胞 的 增 殖 与 自 然 凋 亡 的 动 精 细 胞 损 伤 的 程 度 主 要 取 决 于 辐 照 时 间 , 与 辐 照 的 频 率 关 系 不 大 , 与 态 平 衡 中 进 行 的 。 超 声 的 生 物 学 效 应 会 成 为 影 响 脑 细 胞 凋 亡 的 因 素 。 [4] [5] 刘 望 彭 等 的 研 究 结 论 相 一 致 。 曹 敏 丽 等 通 过 照 射 大 鼠 卵 巢 相 应 部 陈 文 雪 等 在 研 究 诊 断 剂 量 超 声 对 大 鼠 卵 巢 细 胞 凋 亡 的 影 响 时 发 现 , 超 位10min , 偶 见c-fos 的 表 达 , 随 照 射 时 间 延 长 阳 性 表 达 呈 上 升 趋 势 , 声 辐 照 可 诱 发 卵 巢 组 织 细 胞 凋 亡 , 而 且 处 于 不 同 发 育 时 期 的 卵 泡 内 细 至60min 时 阳 性 表 达 最 高 ; 持 续 照 射30min 可 致c-fos-mRNA 阳 性 表 达 胞 敏 感 度 不 同 , 不 仅 发 生 在 原 始 卵 泡 、 生 长 卵 泡 , 在 间 质 细 胞 及 卵 泡 升 高 , 即 超 声 持 续 辐 照 大 鼠 卵 巢 达 到 一 定 时 间 后 可 导 致 卵 巢 细 胞 的 免 膜 细 胞 也 可 发 现 明 显 的 凋 亡 现 象 。 给 予 诊 断 剂 量 超 声 辐 照30min ,12h 疫 组 织 发 生 化 学 反 应 , 并 通 过c-fos 和c-fos-mRNA 系 统 途 径 诱 导 卵 巢 后 其 细 胞 凋 亡 率 增 加 ,24h 达 到 高 峰 ,48h 凋 亡 率 开 始 下 降 ,96h 细 胞 细 胞 的 凋 亡 。 目 前 对 于 超 声 辐 照 引 起 的 子 代 脑 功 能 损 害 的 研 究 相 对 匮 凋 亡 率 继 续 下 降 ,120h 恢 复 至 对 照 组 水 平 。 诊 断 剂 量 的 超 声 辐 照 大 鼠 乏 ,Kieler 等 的 研 究 发 现 胎 儿 时 期 接 受 超 声 检 查 会 导 致 左 利 手 的 概 率 卵 巢 组 织 后 细 胞 凋 亡 率 随 时 间 变 化 的 曲 线 呈 近 似 抛 物 线 状 。 由 此 证 明 增 加 。 周 宁 等 对 孕18d 的SD 大 鼠 给 予 诊 断 剂 量 (3.0MHz ,MI1.6 , 诊 断 剂 量 超 声 辐 照 大 鼠 卵 巢 可 诱 导 细 胞 凋 亡 增 加 , 这 种 损 害 存 在 一 定 Tis1.8 ) 的 超 声 辐 照 ,30min 组 仔 鼠 在 水 迷 宫 测 试 中 内 环 得 分 与 对 照 的 可 复 性 , 且 细 胞 凋 亡 率 与 超 声 输 出 功 率 呈 正 相 关 。 如 果 发 育 期 的 卵 组 之 间 的 差 异 具 有 显 著 性 (P <0.05 ) , 对 孕 鼠 给 予 诊 断 剂 量 的 超 声 辐 细 胞 接 受 超 声 辐 照 不 但 引 起 卵 细 胞 凋 亡 增 加 , 间 质 细 胞 和 卵 泡 膜 细 胞 照30 min 可 导 致 仔 鼠 的 学 习 记 忆 能 力 下 降 。 本 实 验 采 取Morris 水 迷 宫 的 凋 亡 增 多 也 会 引 起 卵 细 胞 发 育 异 常 , 打 破 胎 鼠 脑 组 织 发 育 的 动 态 平 对 仔 鼠 的 学 习 、 记 忆 能 力 进 行 测 定 。 在 动 物 学 习 、 记 忆 实 验 研 究 上 , 衡 , 可 能 表 现 为 其 出 生 后 的 学 习 、 记 忆 能 力 的 下 降 。 因 此 在 临 床 常 规 仪 器 和 方 法 是 重 要 的 ,Morris 水 迷 宫 是 经 典 的 研 究 动 物 学 习 、 记 忆 的 超 声检 查 时 应尽量 避免 长时间 的辐 照。 仪 器 , 其 优 点 : 用 摄 像 系 统 代 替 了 肉 眼 观 察 , 可 避 免 人 为 因 素 的 影 参考文献 响 , 更 为 真 实 、 客 观 ; 依 靠 计 算 机 系 统 和 程 序 , 不 仅 能 测 定 各 种 实 验 [1] Oh H,Lee SE,Yang JA,et al.Establishment of a biological indicat- 数 据 , 还 能 自 动 显 示 动 物 游 泳 轨 迹 。 本 实 验 采 用 内 环 得 分 作 为 评 价 指 orfor the radiation and safety of diagnostic ultrasound using apo- 标 。 在 实 验 中 , 照 射30min 组 动 物 游 迷 宫 形 式 呈 周 边 型 。 而 对 照 组 及 ptosis[J].In Vivo,2000,144:345-349. 照 射10min 组 、20min 组 动 物 经 过3~5d 的 加 强 训 练 , 大 部 分 能 够 快 速 、 [2] 程 颜 苓, 段 云 友, 曹 铁 生. 诊 断 剂 量 超 声 与 胎 鼠 中 枢 神 经 元 的 凋 准 确 找 到 平 台 位 置 。 本 实 验 结 果 显 示 , 在 孕 前 给 予 超 过30min 的 诊 断 亡[J].中华超声影像学杂志,2001,109:624-626. 剂 量 超 声 辐 照 的 雌 鼠 其 子 代 的 学 习 记 忆 能 力 下 降 。 原 因 主 要 考 虑 为 卵 [3] 张 希 平, 曹 晓 哲, 张 绍 增, 等. 诊 断 超 声 对 小 鼠 精 细 胞 影 响 的 研 究 细 胞 对 超 声 辐 照 敏 感 , 超 声 的 热 效 应 、 机 械 效 应 及 空 化 效 应 等 导 致 卵 [J].中华超声影像学杂志,1998,74:245. 细 胞 发 育 异 常 。 在 生 长 发 育 敏 感 期 的 胎 儿 , 即 使 少 量 细 胞 的 损 伤 也 可 [4] 刘 望 彭, 梁 光 荣, 刘 晋 敏, 等. 不 同 孕 期 不 同 条 件 超 声 辐 照 对 胎 鼠 能 引 起 严 重 的 后 果 。 凋 亡 是 依 赖 能 量 的 细 胞 内 死 亡 程 序 活 化 而 致 的 细 生长发育的影响[J].中国超声医学杂志,1996,125:9中国 医 药 指 南 年月第卷 第期 101实验研究2.3 供试 品溶液 的制 备 取 装 量 差 异 项 下 的 胶 囊 内 容 物 约1g , 紧 密 称 定 , 置50mL 棕 色 量 瓶 中 , 加 甲 醇40mL , 超 声 处 理2 次 , 每 次 超 声30min , 过 滤 , 静 置 冷 却 后 , 加 入 甲 醇 稀 释 至 刻 度 , 摇 均 , 再 以0.45 μm 微 孔 滤 膜 过 滤 , 取 滤 液作为供 试品 溶液。 2.4 方法 学考察 2.4.1 标准 曲线 的制备 精 密 吸 取 丹 参 酮 ?A 对 照 品 溶 液 ( 浓 度 为20.18ug/mL )2.0 μL 、 4.0ul 、6.0 μL 、10.0 μL 、14.0 μL 、18.0 μL 注 入 高 效 液 相 色 谱 仪 进 行 测 定 , 按 上 述 色 谱 条 件 测 定 其 峰 面 积 , 以 峰 面 积 值 为 纵 坐 标 (Y ) , 进 样 体 积 为 横 坐 标 (X ) 绘 制 标 准 曲 线 , 得 到 的 回 归 方 程 为 y104232x+6149.5 ,R0.9999 。 结 果 表 明 丹 参 酮 ?A 在4.04~36.32 μg 范围内具 有良 好的线 性关系 。 1.丹参酮?A对照品色谱图 2.4.2 精密 度考 察 精 密 称 取 供 试 品1.0026g 制 成 供 试 品 溶 液 , 取10 μL 按 上 述 色 谱 条 件重复进 样测 定6次 , 测得丹 参酮?A 峰面 积值的RSD 为1.11% 。 2.4.3 稳定 性考 察 精 密 称 取 供 试 品1.0064g 制 成 供 试 品 溶 液 , 在 室 温 下 放 置 , 分 别 在 0h 、8h 、16h 、24h 、36h 、48h 进 样 进 行 测 定 , 测 得 丹 参 酮 ?A 峰 面 积 值的RSD 为1.58% 。 2.4.4 重复 性考 察 分 别 精 密 称 取 供 试 品5 份 , 每 份1g , 按 上 述 制 备 方 法 制 成 供 试 品 溶 液 , 分 别 吸 取 上 述 溶 液 各10ul 进 样 进 行 测 定 , 测 得 丹 参 酮 ?A 峰 面 积值的RSD 为1.57% 。 2.4.5 加样 回收 率 分 别 精 密 称 取 已 知 含 量 的 供 试 品 ( 含 量 为1.7583g/g )6 份 , 每 份 2.样品色谱图 0.5g , 分 别 加 入 丹 参 酮 ?A 对 照 品 溶 液 ( 浓 度 为0.8736mg/mL 甲 醇 溶 图1 丹参酮?A对照品及样品色谱图 液 ) 各1mL , 按 上 述 供 试 品 制 备 方 法 制 备 供 试 品 溶 液 , 并 以 上 述 色 谱 和 色 谱 峰 的 分 离 效 果 均 不 及 超 声 处 理 好 , 并 对 超 声 时 间 进 行 考 察 条 件 测 定 峰 面 积 , 计 算 得 到 丹 参 酮 ?A 的 平 均 回 收 率 为98.36% ,RSD 得 出 超 声30min 已 将 其 中 丹 参 酮 ?A 提 取 完 全 , 此 时 超 声 处 理 的 含 为2.29% ,表 明回 收率良 好。结果 见表1。 量 比 回 流 处 理 的 含 量 高33.3% , 故 本 文 选 择 超 声 提 取 丹 参 酮 ?A ; 表1 加样回收率考察数据 此 外 , 本 文 还 对 溶 剂 干 扰 通 过 阴 性 实 验 进 行 考 察 , 结 果 显 示 溶 剂 称样量 样品含 加入量 测得含 回收率 平均回 并 未 对 实 验 产 生 干 扰 。 经 对 三 批 样 品 的 测 定 , 表 明 本 含 量 测 定 方 编号 RSD% g 量mg mg 量mg % 收率% 法 可 靠 , 操 作 简 便 , 符 合 高 效 液 相 色 谱 法 《 中 国 药 典 ( 一 部 ) 》 1 0.5007 0.878 1.761 102.32 98.36 (2010 版 ) 的 规 定 , 且 该 方 法 重 现 性 好 , 可 作 为 本 品 中 丹 参 酮 ? 2 0.5003 0.869 1.731 99.88 3 0.5002 0.870 1.705 96.76 A 的 含 量 测 定 方 法 。 0.8630 2.29 4 0.4997 0.855 1.698 97.68 参考文献 5 0.4996 0.850 1.687 96.99 [1] 李 大 伟, 夏 青, 夏 作 理. 丹 参 对 高 脂 血 症 大 鼠 血 脂 及 血 糖 调 节 作 6 0.5000 0.862 1.695 96.52 2.5 含量 测定 用的研究[J].时珍国医国药,2007,184:794-795. 取 供 试 品 按 照 上 述 色 谱 条 件 测 定 其 峰 面 积 值 , 各 批 胶 囊 平 行 测 定 [2] 索 志 荣, 秦 海 燕. 丹 参 营 养 器 官 中 丹 参 酮IIA 的 高 效 液 相 色 谱 法 分析[J].科技创新导报,2008,291:11. 3 次 , 利 用 外 标 一 点 法 结 合 制 剂 含 量 计 算 公 式 计 算 丹 参 酮 ?A 的 含 量 , [3] 王 俊 香. 抗 癫 止 痫 丸 的 质 量 标 准 研 究[J]. 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志, 结果见表2 。样 品及对 照品色 谱图见图1。 表2 三批样品的含量测定 2012,1812:115-116. 含量(mg/ 粒) 平 均值 [4] 李 倩, 刘 伟, 罗 祖 良, 等. 一 测 多 评 法 测 定 丹 参 中 丹 参 酮 ?A 、 隐 批号 1 2 3 (mg/ 粒) 丹 参 酮 、 丹 参 酮 ? 、 二 氢 丹 参 酮 ? 的 含 量[J]. 中 国 中 药 杂 志, 20091201 0.788 0.791 0.783 0.787 2012,66:824-828. 20091202 0.781 0.795 0.789 0.788 [5] 吴 笛, 臧 忠 良, 王 德 勤, 等. 一 测 多 评 法 测 定 复 方 丹 参 片 中4 种 丹 参 20091203 0.833 0.745 0.771 0.783 3 结果与讨论 酮类成分的含量[J].中国药学杂志,2012,4718:1509-1513. 本 文 在 进 行 含 量 测 定 之 前 已 利 用 回 流 及 超 声 两 种 方 法 提 取 胶 [6] 刘 春 梅, 石 琪, 李 佩, 等. 丹 参 饮 片 分 级 与 质 量 评 价 指 标 的 现 状 分 囊 中 的 丹 参 酮 ?A , 两 种 方 法 含 量 测 定 结 果 显 示 回 流 提 取 的 效 率 析[J].湖北中医药大学学报,2012,142:66-68.