细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫苗免疫效果研究（可编辑）

细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫苗免疫效果研究（可编辑） 细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性 HBV DNA疫苗免疫效果研究 南方医科大学 博士学位论文 细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲技术增强治疗性HBV DNA疫 苗免疫效果的研究 姓名:杨富强 申请学位级别:博士 专业:内科学 传染病 指导教师:侯金林 20080421博士学位论文 细胞因子融合蛋白质粒及在体电脉冲 技术增强治疗性 疫苗免疫 效果的研究 博士研究生:杨富强 指导教师:侯金林 摘 要 乙型肝炎病毒感染患者自身抗特异性细胞免疫状态是决定 感染自然史和转归的重要因素之一,探寻有效的免疫调节治疗手段来激活 或增强慢性乙型肝炎患者机体抗特异性细胞免疫应答,以达到 打破免疫耐受或提高现有抗病毒药疗效的目的,是目前慢性感染防治领域 研究热点,将成为今后抗病毒治疗策略调整的趋势。 由于抗原的表达、修饰及合成在宿主细胞内进行,并通过.类抗原复 合物方式递呈,疫苗能更有效诱导机体特异性细胞毒性淋巴细胞 活性。因此,疫苗具有传统疫苗所不具备的优势,在抗病毒性感染如 、?和肿瘤的基础及临床试验中都表现出良好的应用前景。然而,初 步的临床试验结果表明,由包膜中蛋白编码基因构建的 疫苗治疗慢性携带者,特异性吖分泌淋巴细胞检出率及血清 水平下降并不非常明显。影响该项基因治疗技术发展的最主要的困 难是:疫苗质粒在宿主体内转染率比较低;质粒的免疫原性不强。 为了解决第一个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ,我们应用了在体电脉冲技术,成功地提高了 疫苗在大体重动物比如非人灵长类动物中的转染率,并且能有效诱导体液 免疫和细胞免疫应答。为解决第二个技术难题,我们设计构建了型细胞因 子.和吖融合蛋白基因表达质粒,用以增强疫苗免疫接种 局部抗原递呈细胞的抗原递呈功能,有助于促进细胞分化并利于中文摘要 特异性体液免疫和细胞免疫应答的诱导。本项研究以/小鼠、新西兰家 兔、非人类灵长类动物猴及转基因小鼠为动物模型和研究对象, 疫苗免疫原性及质粒 评价和探讨及分别增强和提高治疗性 宿主细胞内转染率的辅助效果和机理。 第一章双质粒 疫苗及在体电脉冲仪的研制和检定 治疗性双质粒 疫苗系采用基因重组技术构建的包膜中蛋白 疫苗联合佐剂质粒组成的双质粒 基因真核表达质粒 治疗性疫苗。在接种 疫苗的同时,联合注射编码人白细胞介 素融合蛋白./.基因质粒作为佐剂,以辅助前者对机体免疫应答的 诱导,使其激活的细胞向亚群分化,以期望更有效地诱导产生细胞免疫 应答而打破因慢性感染所导致的机体免疫耐受,达到清除病毒的治疗目 的。 本研究中,将编码胞膜中蛋白的基因序列插入真核表达载体 .构建了重组.质粒。为增强其免疫原性,我们构建了./吖 融合蛋白佐剂质粒,它是由.信号肽序列,.全基因序列,连接 序列编码以及?的全基因序列顺序连接在的钝端构 成。分子模拟根据基因编码的.和吖融合蛋白的一级结构进行。 所表达的蛋白的空间构象及与天然.和构象的比较通过数字分子模型 软件来 ,完成。用脂质体转染试剂转染.细胞,以 ,增强化学发光法. 检测转染细胞培养上清中目 的基因表达,并分别以.依赖细胞株/比色法和微量细胞病变抑制 法.检测转染后不同时间点培养上清中.及吖活性。 双质粒转染.细胞后 能检测到目的蛋白表达, 时蛋白表达达 最高值, 其中、和吖的浓度分别为.,.,.鹏几,, 时蛋白表达呈明显下降趋势。而转染空载体和未转染质粒细胞上清均未检 测到、.和.抗原活性。双质粒转染表达产物的 博士学位论文 鉴定结果,对照组未转染细胞上清和转染空载体均未检测出任何阳性反 及 处有特异性反应 应条带,而.及分别在分子质量为. 条带。 根据基因编码的./融合蛋白的一级结构模拟出其空间结构。 表达./融合蛋白的空间结构能够和天然的?.、空间结构很好的 对应起来,这表明个氨基酸的连接物能够保证表达的.和吖蛋白在空 间折叠时互不影响,并能保证.和?的生物活性区域充分暴露在融合蛋 白的表面。用.和.丫 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品作为对照,检测转染细胞上清中的细胞 时上清中 因子活性实验结果表明,.和吖具有生物学活性,转染后 /,为检测最高值,与相同样本来源 .和.的活性分别为和. 疫苗 的检测上清浓度的高峰值一致,这为质粒在治疗性 免疫过程中发挥佐剂作用的研究奠定了物质结构基础。 在体电脉冲技术的电脉冲发生器和电极由上海交通大学药学院提供,可发射 电压的方波信号,一个脉冲持续 。两个针头用的 是针灸治疗中所使用的针头,长.,直径.。两个针头距离,分 别代表阳极和阴极。以绿色荧光蛋白及荧光素酶编码基因作为报 告基因,观察上述蛋白表达质粒经导入小鼠胫前肌 后目的蛋白的表达以及组织病理改变情况。结果显示,处理中央部位肌肉组 织损伤较为严重,可观察到明显肌细胞溶解、坏死及炎症的发生,而边缘区损 伤较轻微。早期质粒转染成功并表达目的基因产物的肌细胞以边缘区域为 主, 可观察到较强的绿色荧光信号。转染天荧光信号为高峰并随时间的推移而 逐步衰减,期间损伤严重的中央区域组织修复同时进行,至天肌肉组织基本 恢复正常并可观察到阳性纤维的出现,系细胞核置于中央的再生肌纤维。 转染小鼠实验结果,经介导的的只/小鼠局部组织 荧光素酶活性为..,而同期未经介导的对照组酶活性仅 为.?.,组间相差个数量级,差异具非常显著性.,.。 ?中文摘要 。 第二章增强疫苗免疫原性的实验研究 观察佐剂质粒以不同剂量和给药方式联合疫苗?应用 诱导机体体液免疫血清抗.水平的效果,摸索出最适的免疫接种方法包 括免疫剂量、双质粒配伍和给药途径,以提高疫苗的体内免疫效果并为 下一步确定细胞免疫实验中动物接种方式提供参考。 . 疫苗免疫诱导体液免疫结果 联合 三个不同剂量的 疫苗.单独免疫小鼠后血清抗一 . 水平及阳性数观察结果,大 /只初次免 .叫只、中剂量组 疫周时分别为.?./,.?./并可诱导组内全部动物 抗体水平呈阳性,而低剂量组 /只水平为.?./,组内抗体 阳性数仅为只每组只。、、周时各组抗体水平均有升高,但高、 中剂量组升高较低剂量组更为明显。 然而,低剂量 /只的.与相同剂量的联合免疫、周 时血清抗体水平分别为.?./、.?. /,组内全部 只小鼠周时抗体水平呈阳性;剂量升高未能增强.的免疫效果,其 剂量为/只, 只时联合.接种免疫效果明显降低,连同对照组 ..,‖只】较低剂量组./只】周 或周时水平差异具显著性.。低剂量 /只, /只的虽未 明显减低血清抗体水平,但检测值的均一性较差,且,周时未能诱导出组内 全部动物抗体水平呈阳性。 为考察/只接种时间和部位对联合./只免疫效果的影 响,分别设置同时接种组:.、于.免疫前日接种 组:.、.免疫后日接种组:.及 与.分左右腿胫前肌接种组:.似/四组,比较 .免疫周,周时血清抗体水平及阳性数。结果显示组免疫效果最佳, 表现为抗体水平较高、检测值个体差异较小,仅该组与?组水平比较差异具 显 博士学位论文 著性.,且其组内全部小鼠抗体水平均呈阳性。据此联合.免 疫方式,观察二者高 /只】、中‖只】、低剂量 /只】联合免疫效果显示,高、中剂量组、周时均能诱导组内全部动物 抗体水平呈阳性,二组周时抗体水平较低剂量组升高明显,差异具显著性 尸.。 . 联合.诱导细胞免疫应答结果 /只联合?/只免疫组小鼠脾细胞体外经 刺激培养上清/?水平.?./../较同剂量的 联合空载体.免疫组.?./.?./高,差异具显著性 尸.;.水平于各组质粒免疫影响不明显。 .免疫组小鼠局部引流淋巴结中单核巨噬细胞计 数及其占细胞的百分比结果.×,.%明显高于?. 组.×,.%及空载体免疫组.×,.%; 同时,. 免疫组能明显刺激致敏的细胞增殖,其细胞增值指数 .较?.组.及.组.高。 疫苗诱导小鼠特异性活性结果, 疫苗免疫诱导 小鼠活性的强弱与效/靶厂比例及其上清液中.分泌水平有一定 关系。/为:及:时,联合佐剂质粒免疫组?活 性细胞溶解率:.%,.%较?.组.%,.%高; /时,?组仍有免疫活性%,而?. 组活性%,实验过程中空白载体.对照组活性于任一/ 比例条件下均%。 抗原特异性分泌.或. 细胞检测结果,?免 疫健康/小鼠周后,脾细胞在体外用刺激后其诱生的.细 胞频数.?. /×脾细胞,较同期对照组用空载体. .?. /×脾细胞高,差异据非常显著性.,.。脾 中文摘要 /×脾 细胞在体外用刺激后其诱生的细胞频数.. /×脾细胞高,但差异没有显著性 细胞较不用组.. .,.。经流式细胞术实验分析,.免疫组诱导 小鼠胞内分泌.的细胞百分比..%与.对照组 .?.%比较,无显著性差异尸.,.;而其诱导小鼠胞内分泌 .的细胞表达.百分.?.%较对照组.?.% 高,差异具显著性尸..,.。 .不同细胞因子表达质粒联合.免疫诱导特异性免疫应答结 果 为进一步说明和证实./.融合蛋白表达质粒设计的合理性 及作为佐剂增强.免疫原性的有效性,通过基因克隆及重组技术分别设计 及融合蛋白表 和构建了鼠源性,? 达质粒作为佐剂,并以其小剂量‖只联合. /只接种 /小鼠,并对各自诱导的免疫应答阳性数进行观察比较。结果显示,【.. /只】 联合.免疫诱导一特异性体液免 疫和细胞免疫效果最佳,并与相同剂量的?组效果相当,主要表现为 其组内诱导的特异性分泌. 细胞阳性反应动物数目与单独使用细胞因 子质粒或 ?及免疫组未获得阳性应答具本质性差别, 提示.及.质粒作为免疫佐剂在增强 疫苗免疫效果上具有 协同效应。而鼠源性融合蛋白在本实验中未显示出佐剂效应,推测可 能与其构建时所选用的连接肽基因与人源性相同未能在融合蛋白分子 结构上保持.及.各自活性有关。 第三章在体电脉冲法提高 疫苗免疫效果的实验研究 本研究以新西兰家兔、恒河猴及食蟹猴为实验对象,观察评价通过提 高裸质粒在宿主体内细胞导入率,增强 疫苗诱导大体重动物 特异性免疫应答效果。另采用高水力学注射法 或水力 博士学位论文 注射法将质粒.转染至/小鼠肝细胞内作为模型,观察介导的 .免疫对该模型小鼠肝细胞表达的抑制效果。 . 联合接种 疫苗诱导兔和猴特异性免疫应答结果 整个实验整个观察过程,未经介导的高剂量一只双质粒 疫苗.免疫组内各只动物家兔或猴血清抗.均 为阴性水平/。 经介导的双质粒 疫苗免疫于新西兰家兔实验结果: 周时大剂量;/只及中剂量组/只分别有/只,/只动物血清 抗.水平呈阳性 /至周时阳性数虽无变化,但二组水平均明 显升高。第次免疫后周即第周增强免疫后周时,介导的大、 中、小剂量组动物均有血清抗.阳性出现,分别为、与只,其中大剂 量组阳性数与同期对照组比较,差异具有显著性尸.。 介导的双质粒 疫苗免疫恒河猴实验结果:初次免疫后 周即第次增强免疫后周时,大、中剂量组,分别有及只动物血 清抗.阳性,至免疫后周即第次增强免疫后周时,大、中、小 个剂量组全部只动物血清抗.为阳性。 介导的双质粒 疫苗免疫食蟹猴免疫实验结果:中剂量 组./接种后第周即有动物血清中测出较高滴度的抗.;随着 接种次数增加,血清抗.阳性的动物数量也随之增加,至周时低 ./、中剂量组内全部动物血清抗体呈阳性,而高剂量组/ 阳性数为/只;各组血清.水平高峰期大约在~周之间,随后小幅下 降。周时介导的 疫苗免疫高、中、低剂量组各只食蟹猴中 分别有、、只特异性吖细胞计数阳性;周时高、中、低剂 / , 量组全部动物应答呈阳性,其计数结果分别为.?. .?. /× /’及.?. ;而相同时间佐 剂组和对照组只食蟹猴均为阴性。 ?中文摘要 . 介导的 疫苗免疫对小鼠肝内表达水平的影响 小鼠经水力学法注射.后小时即可检测出表达. /,以后表达量随 ?./,.肝内表达为高峰期.. 疫苗免疫 时间而降低。.与未经介导./的 后的小鼠肝组织水平均有不同程度的降低,./组..? . /,..?. /水平较同一时间未免疫对照组. ?./,.?. /低,差异具非常显著尸.及显著性尸.; /,.../及.水平. .组于..?. ./较同期对照组.?./,.. /,.. / 低,差异具非常显著性氏.,较同期.组.. /,. . /,.?. /水平低,差异亦具非常显著性尸.。 免疫组化计数染色阳性细胞结果,.组于观察期间各个时 间点阳性染色肝细胞数目均较对照组少,差异分别具显著、、天,. 及非常显著性.、天、天,.。 观察肝组织病理及血清转氨酶水平变化结果发现,动物经水力注 射转染.后肝组织病理无明显改变,尽管血清呈现短暂性升高,但各 时间点上.与对照组比较无显著性差异。 疫苗效果的评价 第四章联合提高治疗性 本研究以健康/小鼠及转基因小鼠为研究对象,分别比 疫苗体液免疫 较分析和系统研究、单独和二者联合应用增强 及细胞免疫效果的辅助作用,探寻最佳的接种组合方式及给药剂量。在此基 础 上,进一步评价和探讨联合免疫增强 小鼠细胞免疫及促进病毒应答的 治疗效果及初步作用机理。 .健康/小鼠免疫应答效果 血清抗.抗体水平检测:介导的疫苗免疫组间比较, /,血清阳性率为%, 组.清抗.水平为.?. 博士学位论文 /,血清 组..血清抗抗体水平为.?. 阳性率为%。组血清抗.水平及血清阳性率均高于组., .。及非.联合疫苗免疫组间血清抗体阳性 率比较,即组与组.及组与组.. 比较,差异均具显著性.;同时,与各自增强血清抗体应答阳 性率比较组.组差异亦具显著性卢.。 特异性细胞免疫应答水平检测:在或非介导 .免疫反应比较中,组..和组 ..以.质粒代替了组.、 组.的,结果、组的特异性细胞免疫应答水 平及阳性率组:? /× /×脾细胞,%;组:? 脾细胞,%较相对应的、组组:? /×脾细胞,%; 组: /×脾细胞,%低,其中、二组阳性率差异经统 计分析具有显著性卢.。而细胞计数×脾细胞结果经异方 差多组内两组间多重统计分析比较,仅组与组比较差异具有显著性 .。. 研究结果表明,以提高 疫苗体液免疫应答效果最为明显,其 辅助作用较强;而在本研究中仅能显示出明显增强疫苗诱导的 疫苗免 细胞免疫效果的佐剂作用。因此,我们认为联合在 疫即组:.能获得最佳的体液和细胞免疫应答效果。以上述 组合方式接种不同剂量的 疫苗,结果显示具有一定的剂量依赖性, 为进一步的 动物模型实验有效剂量的选择奠定了实验基础。 . 小鼠模型实验结果 血清定量检测结果,.组免疫第周士 拷贝/、周时士拷贝分别较免疫前:拷贝/ 明显减低,差异具非常显著性尸.;..组周士 中文摘要 拷贝/及周时士拷贝/均较其免疫前水平:拷 贝/明显降低俨.,但不能持续到周时士拷贝/,并 明显高于此时.组水平,差异具非常显著性尸.。 病毒应答与细胞免疫应答的平行比较:各组小鼠血清水平 无明显变化,但肝脏免疫组化结果显示,表达水平存在差别。. 和..组分别有只和只 小鼠肝组织切片表达 阳性的肝细胞低于观察视野总计数细胞的%,.对照组鼠 表达阳性的肝细胞均在%以上。.组只/升高 ,..组和.组均只有只检测到?岍活性升高。 .组特异性.分泌细胞数.?./个脾细 胞亦多于...?./个脾细胞或.组 .?./个脾细胞,其中.组较.组差异具显著 性尸.,.,且三组动物个体观察结果发现特异性的升 高与血清基本一致,并伴随着血清 及肝组细胞表达水 平的降低。 疫苗免疫 本研究结果表明,能够显著增强介导的 的复制及表达。 的治疗效果,表现为联合免疫能持续性抑制 的引用大大降低了质粒的有效接种剂量。观察终点周时,联合 水平显著低于疫苗单独免 疫苗免疫组小鼠血清 疫及对照组,个体血清 及肝组织表达水平降低的同时,伴随 其血清剐水平及特异性吖分泌细胞数目的升高。值得注意的是, 疫苗免疫组肝脏细胞空泡样变较对照组明显,可能与疫苗免疫所介 导的特异性或非特异性免疫应答造成的肝脏炎症损伤有关。由于小鼠动物 模型基础上研究外周血单个核细胞免疫应答水平的局限,本文结果 中病原学与免疫学应答相关性的研究仅限于观察结束的一个时间点上,但所 要 提示的与近年来文献报道结论基本一致,即的清除与溶细胞或非溶细胞性 博士学位论文 免疫应答有关。 综上所述,型细胞因子./融合蛋白编码基因质粒联合 疫苗.接种能有效增强.的免疫效果,与:.剂量 按:配伍混合共注射免疫效果最佳;在体电脉冲技术通过提高质粒 体内细胞转染率,有效增强 疫苗在各种动物包括非人类灵长动 物诱导的免疫效果;通过加强初始细胞向方向分化,能够增强 疫苗免疫的治疗性作用,与联合疫苗治疗 小鼠后, 能在一定程度上抑制小鼠 复制和表达。 以上研究结果有益于目前疫苗及裸质粒基因治疗技术瓶颈性难题的解 决,并为寻找更有效的抗感染免疫治疗策略提供新的技术途径和实验依据。 关键词:乙型肝炎病毒疫苗电脉冲一/?融合蛋白表达制粒 博士学位论文 / ?? ..: :.嬲 . ,? , . ,。 ?, /. ;. ,. ,, . ,、?, , ,. . ,吖 ..//吖 ./ ,.士. 博士学位论文 , ? .士. ,..,? .. ,, , . /. . / :州/ . / ,..州 . ., .., . .//;?谢 / .. ./ , ,//, / , // ,/ ./? :. ? . 曲 % ? , 尸.. .... . :, . , .,.,? / 埘 , 刚吖 , / . . ’? , / . 、? 丽 ,/ , ; ,/ / . , / ./ ; 博士学位论文 ?.,吖 , /’ ? /衅. /’. / 、析 .州. ? . .’ ,. ., , ?谢 , ... , , . 、, .. ? . 吖.., . , . /, . ,. . 丫, ? ,.; : ; ; /??/.原创性声明 南方医科大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外, 本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属南方医科大学。 本人承诺承担本声明的法律效果。 日期: 年月日 作者签名:杨富 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和 借阅。本人授权南方医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于请在以下相应方框内打“?: 、保密口,在一年解密后适用本授权书。 、不保密口。 日期: 年月日 作者签名: 杨富强 日期: 年月日 导师签名: 侯金林博士学位论文 绪 论 相关概论 坠丛?瘗苴亦称基因疫苗或核酸疫苗,是指编码某种蛋白抗原的基因片段经 扩增后插入适当的真核表达载体中构建成的重组裸质粒,经肌注或物理技 术直接导入动物细胞内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主 产生 对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。 疫苗与传统疫苗相比,有许多独特优点:消除了导入可能与“减毒” 疫苗相关的强毒性病毒的危险性;疫苗可以干粉形式保持数年,且仍保持其 活性;小剂量适当的基因构建质粒即可诱导保护性免疫;使用一次就能产生 长 期免疫力,无须增加剂量,并可提高依从性;大量制备疫苗将使终产物的 价格降低。此外,疫苗免疫与病原体在宿主体内表达抗原过程与自然感染相 似,可以递呈天然构像的抗原,无抗原表位的改变而诱导全面的免疫应答,具 有预防和治疗双重作用等,所以,自年其技术概念正式提出以来,疫 苗受到广泛重视,已成为当前疫苗研究的重点,被誉为继病原体疫苗、亚单位 疫苗之后的第三代疫苗。 皇点进介导又称电穿孔,的疫苗和基因治疗技术是利用电脉冲 把药物和基因输送到人体细胞的技术。这种方法就是在向靶组织内注射之 后,紧接着进行电脉冲的释放,施加的电场能够在细胞外膜上造成瞬态的通 透, 电场撤除之后,这种通透的状态仍能维持数分钟而细胞没有明显损伤,有利 于 提高质粒在宿主细胞内的导入率。 渔痘佳塑厦趋婴坠盥?瘗苴系采用基因重组技术构建的包膜中蛋白 疫苗联合佐剂质粒组成的双质粒 基因真核表达质粒 治疗性疫苗。在接种 疫苗的同时,联合注射编码人白细胞介素 融合蛋白一/.基因质粒作为佐剂,以辅助前者对机体免疫应答的诱 导,使其激活的细胞向亚群分化,更有效地诱导产生细胞免疫应答,以 期望达到打破因慢性感染所导致的机体免疫耐受和清除病毒的治疗目的。绪 论 研究背景及依据 乙型肝炎病毒感染是一个严重的公共卫生问题。全球大约有. 亿人为慢性感染,约%.%最终死于感染相关的肝病。我国是乙 型肝炎简称乙肝的高流行区,根据年全国乙肝血清流行病调查表明, 一般人群中流行率为.%,约.亿人为慢性感染,占全球慢性 感染者的/?。其中慢性乙肝约为.万例,全国每年死于乙肝相 关肝病约万例,严重危害中国人民的身体健康和人口素质,并给国家带来了 沉重的经济和社会负担。自国家“七五规划以来,乙肝的防治一直被列为医 药卫生行业重点科技攻关项目。 抗病毒治疗是慢性乙肝的根本治疗方法,其基本治疗目标是清除或永久抑 制的复制,降低致病性和传染性,消除或减轻肝脏的炎症和坏死】。根据 循证医学的原则,全球 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 的临床试验积累的证据表明,有效抗治疗药物 主要为二类,即具有病毒持续应答的干扰素和维持应答的以拉米夫定为代表 的 新一代核苷类似物【。然而,昂贵的医药费用以及治疗引起的毒副作用、病 毒 变异和病情反跳加重了广大乙肝患者经济和精神负担,使得抗病毒的药物治 疗 难以在我国推广。据调查,在我国慢性乙肝患者中,接受抗病毒治疗的患者仅 占%。 乙肝患者自身抗特异性细胞免疫状态是决定感染自然史和转归 的重要因素之一,探寻有效的免疫调节治疗手段来激活及增强患者机体抗 特异性细胞免疫应答,以达到提高现有抗病毒药疗效目的,是目前该领域 研究的热点,将成为今后抗病毒治疗策略调整的趋势。近年来,国内外学者针 对免疫调节治疗患者,先后研发了治疗性多肽疫苗、免疫复合物疫 苗及大剂量蛋白质疫苗,并已在临床进行、期试验,但至今其确切疗效尚 未得到证实【驯。如何提高乙肝患者机体免疫系统特异性细胞应答,通 过细胞毒性淋巴细胞和细胞因子直接清除和抑制病毒,为抗病 毒药物治疗提供临床手段,已成为乙肝治疗的重要目标和亟待研究解决的问 题。 博士学位论文 由于抗原的表达、修饰及合成在宿主细胞内进行,并通过.类抗原复 合物方式递呈,疫苗能更有效诱导机体特异性活性『州。因此, 疫苗具有传统疫苗所不具备的优势,在抗病毒性感染如、和肿瘤 的基础及临床试验中都表现出良好的应用前景?】。等以转基因 小鼠为研究对象,发现大剂量的包膜蛋白构建疫苗一次性接种,能 够清除实验组转基因小鼠血清中表达】。疫苗下调及抑制 小鼠 及其表达的作用机理与细胞因子.的分泌密切相关,一项 以 疫苗及过继免疫治疗疗效机理的结 小鼠为动物模型,研究 果发现,疫苗及过继免疫治疗效果随着小鼠出生前.基因的敲除 而消失【。通过 小鼠及黑猩猩动物模型的实验研究表明,识别和 溶解体内感染细胞是疫苗发挥疗效的主要免疫作用机理;此外,经 疫苗诱导的具有非溶细胞性清除机制,即在不引发细胞损伤的情况下, 通过分泌.可抑制和清除感染细胞内的病毒复制如。 年法国巴斯德研究所和年韩国.药厂分别进行了 疫苗单独应用和与抗病毒药联合应用的临床试验研究,初步结果显示,治疗 性 疫苗具有一定的降低血清 水平和血清转换的治 疗效果,并能在病毒应答患者中诱导出特异性细胞免疫应答;同时,观察 到与拉米夫定合用 疫苗能够降低乙肝抗病毒药治疗后的复发率,获 得病毒持续应答的治疗效果,为慢性乙肝的抗病毒治疗提供了新的值得深入 研 究和探讨的手段和策略。 存在问题及解决手段 尽管动物实验和初步的临床试验结果显示 疫苗具有良好的应用 前景,但其免疫效果仍有待改进和提高【。疫苗免疫属基因治疗技术应 用研究领域和范畴,所不同的是疫苗为非病毒载体的裸质粒,因此, 其技术的推广应用面临的最大问题仍是裸质粒难以有效进入大动物的组织 细胞,从而抗原表达量甚微降低了其免疫原性;此外,治疗性疫苗以诱导绪论 机体特异性细胞免疫应答为目的,如何增强疫苗细胞免疫原性也是治疗性 疫苗研制需要解决的技术问题。当前,增强疫苗免疫效果的方 法主要有:提高质粒的转染率以增加抗原的表达;增强疫苗自身的免疫 。 原性或提高机体对抗原的免疫反应性 在体电脉冲或电穿孔技术可使细胞膜通透性增加,从而提高化疗药 物和质粒进入细胞的效率,在肿瘤临床治疗中已作为常规辅助给药措施 【】。等:报道,可提高疫苗转染效率和免疫效果倍以上。 由于该项技术市场开发前景看好,国外多个国家都正在进行电脉冲介导的 疫苗接种技术的研究和开发。美国公司在人体进行了电脉冲介 导的输送方法的评估【,结果显示,无需麻醉的情况下,这种技术是安全 并可以接受的。这项研究使用该公司的电脉冲输送仪器,测量了志愿者在 接受电脉冲刺激后的痛感,研究结果支持该技术可应用于严重性疾病。这一研 究对今后使用电脉冲介导的疫苗和基因治疗的临床实验的设计和完善有重 要的借鉴意义。 国内上海交通大学已进行了多年的该技术的研究 。基于该技术原理研制 了多套实验样机,并投入了大量的精力和物力进行了医疗级的电脉冲发生器、 电极和电脉冲条件的设计和完善。以期得到最安全,有效并最为经济的不同的 医疗应用仪器。在国内疫苗的研发领域,率先与我们建立科研协作关系, 共同开展提高治疗性 疫苗质粒转染率及免疫效果的研究和探索。 在引进有效提高质粒宿主细胞内转染率技术手段的基础上,思考和探 索如何增强治疗性 疫苗细胞免疫原性及提高其治疗效果仍是本研发 项目亟待解决的问题。将特异性免疫应答淋巴细胞导向活化的 型辅助细胞并激活特异性细胞毒性细胞活性,是治疗 性 疫苗研发的关键。尽管来自细菌质粒骨架中非甲基化的免疫 刺激基序具有诱导向分化的功能,并产生活化细胞因子如 .,.及虾.,但在人体试验中由此所表现出的疫苗细胞免疫原性 的增强力度有限,不足以有效抑制和清除病毒【“】。利用细胞因子免疫调节作用, 博士学位论文 设计和探索分子佐剂以提高治疗性 疫苗诱导的细胞免疫应答效果是 本项研究另一重要目的。 初次免疫抗原接种局部细胞因子种类、递呈给细胞的抗原有效浓度以及 抗原递呈细胞的性质决定着免疫应答过程中初真的淋巴 细胞分化成或效应细胞的方向。这其中,局部细胞因子作用最为重 要。.对于的分化起着强有力的支持作用,并可直接杀灭细胞内感染 的病原体‘。.为细胞生长因子,可能是细胞因子佐剂中研究得最为深入 的一个,为 细胞分化或所必需。合理及适量地使用.能克 服宿主.相关的多肽抗原无应答性,并能有效诱导免疫无应答患者 血清抗体产生】。 然而,采用细胞因子蛋白作为佐剂所遇到的问题是其过短的半衰期及其对 机体产生毒副作用。可将细胞因子于疫苗接种局部维持较低水平,以起到治 疗 性或预防性疫苗佐剂效应并减轻其毒性,而采用细胞因子表达质粒作为佐 剂直接联合疫苗肌注到接种部位,正是基于这种思路所提出解决问题的技 术方法。等矧报道,.、.和.等细胞因子基因表达质粒能显 .等【研究显示,./.融合 著增强 疫苗的免疫效果。 蛋白具有免疫刺激的协调作用,其基因表达质粒有显著的抗肿瘤作用。 参照国内外研究动态和发展趋势,我们在构建了 疫苗. 的同时,构建了./.融合蛋白基因表达质粒作为分子佐剂,个 质粒按:配伍联合应用,再配合进行介导以期望获得提高治疗性 疫苗的免疫效果。 本研究设计分体外和体内实验开展实施。首先,体外实验对表达的目 的蛋白进行分子模拟分析,并通过酶联免疫法、增强化学发光 蛋白免疫印迹. 以及.依赖细胞株/比色法和微 量细胞病变抑制法.检测表达的目的蛋白水平及其细胞因子生物 学活性。而后,体内实验检测及各自的生物学功能,即体内抑制移 植性肿瘤细胞的生长及体内导入报告基因质粒的有效性。在此基础上,我们 绪论 以/小鼠、新西兰家兔、非人类灵长类动物猴及转基因小鼠 为动物模型和研究对象,分析评价和深入探讨及提高治疗性 疫苗免疫效果的辅助作用及其机理。 本研究意义及展望 .有益于目前疫苗及裸质粒基因治疗研究与开发领域瓶颈性技术难 题的解决,并为寻找更有效的抗感染免疫治疗策略提供新的技术途 径和实验依据; . “治疗性双质粒 疫苗’’的研制成功,将为临床提供一种 新的免疫调节治疗手段,以提高机体特异性细胞免疫功能达到打破 慢性感染所形成的自身免疫耐受;与目前抗病毒药物联合应用以提 高治疗效果,降低病毒的反跳和变异风险,为乙肝抗病毒治疗获得持续 性应答疗效提供新的辅助手段;期望通过乙肝患者机体自身特异性 活性的增强而达到清除肝细胞内感染 的目的; .本项目符合国家“十一五重点发展生物技术医药产业政策,属于 生物医药领域重大疾病治疗创新药物研究范畴,项目成功实施将有助于 推动我国基因药物的研究和开发,并为其它重大疾病的基因治疗药物研 发提供先进、实用的技术平台。 参考文献 】庄辉乙型肝炎病毒基因型及临床和流行病学意义叨.首都公共卫生,, : .. 【】中华医学会肝病学分会和感染病学分会《慢性乙肝防治指南》. 【】 .,儿.【】. . . ,,: .【】 , :. .,: 【】庄辉乙型肝炎的防治现状与展望中华医学会全国第九次感染病学学术会 成都 议论文汇编中华医学好感染病学分会. 博士学位论文 【】 , , , ,:. , ,、 : ,,:. . .】 ., ., ., . ,:?. , , , . ? .,,: 【】熊一力;贾彦征;施理等.疫苗对非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应 答的影响叨.世界华人消化杂志,,:. ., , .,,:. . 【 , , :, :. ,, 叮】. ., , .,:【 , , , . . , ,:. . 【 , ,, , , / .,:. . 【 , , , , ? ,? .,:. . 【】 , , , , , 绪论 :: . , . . , , ’ , 【】、, :?. ,, 【. ., , , , .,,:?. ., 【 ., ., .弱 【】. ,: . . , ., 【 ., ,, . , 【 , . . ,,:. .? / , , , 【 , .,,:. . ., , ., 【 .,:. . ., ., ,【 一 ,,:. .. , ,’ 【 ,舶:, ,:?. .. . 一 ,?,, 田. 博士学位论文 ,,:?? . . ., .,., 【 ?. ,: 【】., . , ,, , : ?. , , . .,? 【【】. ,, :.. 第一章双质粒 疫苗及在体电脉冲仪的研制和检定 第一章双质粒 疫苗及在体电脉冲仪 的研制和检定 治疗性双质粒 疫苗系采用基因重组技术构建的包膜中蛋白 疫苗联合佐剂质粒组成的双质粒 基因真核表达质粒 治疗性疫苗。在接种 疫苗的同时,联合注射编码人白细胞介 素融合蛋白./吖基因质粒作为佐剂,以辅助前者对机体免疫应答的诱 导,使其激活的细胞向亚群分化,更有效地诱导产生细胞免疫应答而打 破因慢性感染所导致的机体免疫耐受,以达到清除病毒的治疗目的。 本研究中,将编码胞膜中蛋白的基因序列插入真核表达载体 .,,构建了重组.质粒。为增强其免疫 原性,我们构建了./融合蛋白佐剂质粒,它是由.信号肽序列, .全基因序列,连接序列编码以及吖的全基因序 列顺序连接在的钝端构成。分子模拟根据基因编码的.和吖 融合蛋白的一级结构进行,所表达的蛋白的空间构象及与天然.和吖 构象的比较通过数字分子模型软件来 ,完成。用脂质体转染 试剂转染.细胞,以,电化学发光法. 检测 转染细胞培养上清中目的基因表达;其表达产物的体外生物活性鉴定以 .依赖细胞株/比色法和微量细胞病变抑制法.进行;体 内生物学活性研究主要观察导入裸鼠体内对人口底细胞移植瘤的抑制 作用。 电脉冲介导又称电穿孔的疫苗和基因治疗技术是利用电脉冲 把药物和基因输送到人体细胞的技术 。二十年前研究者发现简单地施加电 场 就能在细胞外膜上造成瞬态的通透【。电场撤除之后,这种通透的状态仍能 维 持数分钟,而细胞没有明显损伤。利用这种现象,分子药物就可以进入细胞。 这种治疗方法已经发展为具有很大潜力的药物输送方法。通过体内介导绿 博士学位论文 色荧光蛋白及荧光素酶报告基因质粒,我们对提高裸质粒在 宿主体内细胞转染率进行了研究和评价,并对介导过程中所造成局部组织 损伤进行了观察和分析。 材料与方法 .质粒、菌株、细胞 基因全长由美国哈佛大 .士、含型 学刘立明博士惠赠。/法国巴斯德研究所教授惠赠, 菌株本院全军肝病研究中心免疫生化室保存,.细胞株引自中科院 上海细胞所,细胞、.细胞及水泡口炎病毒由南方医科大学 分子免疫研究所引种保存。人口底癌细胞株由中山大学肿瘤防治中心常规 体外培养传代。 .主要试剂 、 ..分子生物学上游实验: 、 、 、、 .脂质体转染试剂,工具酶呐 、 , 聚合酶,小牛碱性磷酸酶和限制性内切酶 、、 . 等分别购于、、 等公司。 ..质粒体外转染及其表达产物鉴定:纯品及酶联免疫吸 附试验检测试剂盒购自华美生物工程公司,?和 检测试剂盒购自深圳晶美公司。增强化学发光蛋白免疫印迹 . 所用试剂:鼠抗人.抗体,购自公司;马抗鼠 ?,购自广州展晨公司;鼠抗人,购自公司;膜 购自广州威佳公司,进口分装; ..体外生物活性实验:.国家标准品商品名为欧耐特,/ 支,北京瑞得合通药业有限公司,国家标准品商品名为利分能,/ 支,哈尔滨药业集团,胰蛋白胨和酵母提取物购于公司,第一章双质粒 疫苗 及在体电脉冲仪的研制和检定 培养基购自美国公司,小牛血清由杭州四季青公司提供。 ..体内抑瘤实验:阳性对照药环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有 限公司产品,批号。 ..外源基因质粒体内导入实验:报告基因及均购自 ,美国。 .实验动物 .. 体内抑瘤评价实验:至周龄的/裸小鼠,雌雄各半, 由中山大学实验动物中心提供。动物合格证号:医动字.号。 .. 体内基因导入实验:.周龄雌性/小鼠购自上海复旦大学 实验动物中心。实验过程中,所有实验动物在特定的无病原体环境下饲养, 实 验操作符合国家及省市相关实验动物管理规范。 .方法 ‘ ..质粒抽提、酶切、连接、转化按常规方法进行。 .. 参照文 ?基因和./融合基因的扩增、克隆及测序: 献报道的 ?、.和吖基因序列【叫,设计?基因和 ./融合基因扩增的特异引物。?基因扩增引物为:, 端引入粒细胞.巨噬细胞集落刺激因子.的信号肽编码序列,以利 . 其在细胞的分泌表达, . . :: ; ./融合基因前端含.信号肽编码序列,中间插入一段序 列共碥码个、个、个以保证组成 融合蛋白的两因子保持其各自的空间构象和功能,其引物为: . ’ . : . . ;: . 认 .;: 博士学位论文 。 分别以含 基因的质粒 和人外周血单核细胞为模板,经扩增获得包膜中蛋 和一/融合蛋白基因片段,采用纯化扩增的目的基因片段, 直接将扩增片段 克隆 入.载体,重组体.?和分别转化大肠杆菌, 随机挑取转化菌落,小量抽提质粒, 酶切筛选含外源插入片段的阳性克 隆,对阳性质粒进行序列测定。 ..真核表达质粒?和的构建图.:经测序确证的克隆质粒 .?和.,分别经 酶切,真核表达载体.同样用回收 线性化,并用做去磷酸化处理。经 目的基因片段和载体片段,进行连接反应,并转化感受态菌。通过 、 和 酶切筛选出目的基因片段为正向插入的阳性克隆,再经 和 做进一步的酶谱分析。同时,选用和为正反向引物,对? 和重组质粒进行序列验证上海基康生物技术有限公司测定。 ..细胞转染及检定:参照公司脂质体转染试剂 操作说明进行。.细胞株,按常规方法培养于含% 用胰酶消化贴壁, 新生小牛血清的.培养基中,转染前 重悬于含血清培养液,按细胞/孔转种于孔培养板中,、 %培养,待贴壁细胞生长达%.%融合度,分别取纯化质粒.、 进行转染,同时设立未转染细胞组和空质粒转染细胞组为对照,继续培养 并于转染后,,, 收集上清,待检测。双质粒转染后表达上清的 活性检测按“立可读”乙肝表面抗原试剂盒和人.和吖检测试剂盒的说明 书进行,分别采用乙肝疫苗、市售的人.和吖为对照标准品。分 子模拟根据基因编码的.和融合蛋白的一级结构进行。所表 达的蛋白的空间构象及与天然.和叫构象的比较通过数字分子模型软件 来 ,完成。质粒转染表达融合蛋白的.和吖的活 性测定参照版《中国生物制品规程》进行,白细胞介素.效价测定用疫苗及在 体电脉冲仪的研制和检定 第一章双质粒 .依赖细胞株/比色法,干扰素效价测定用细胞病变抑制法,按下述 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算活性: 待检样品效价柿馓价×蓑鬈鬻×糕瓣 休偃面坝怖棒惜鳅 怀臣自口耿怖秤 古鳅 ..双质粒表达产物的 分析 % .步骤将收集的转染细胞培养上清进行倍浓缩,采用 分离胶,按常规方法进行.;电泳结束后,取出凝胶,剪滤纸、 膜和胶同样大小,并将滤纸置于转移中浸泡半小时,膜置甲醇中 浸泡.;按照滤纸一膜一胶~滤纸的顺序层层放好,注意不要有气泡, 夹住后,凝胶一侧置负极,通电按./,设置电流约为,转移过 夜;次日取出膜用.漂洗三次,每次胶用考马斯亮蓝染色;加入 封闭液%的的.,度封闭,.洗三次;加一抗鼠抗 人.、鼠抗人.,鼠抗.,按:稀释,?温浴小时,取 出膜,.漂洗三次,每次.;加入二抗,马抗鼠:.: 稀释, 小时,取出膜,.漂洗三次,每次.。 增强化学发光法实验步骤将两种显色底物:等体积混合一般 各/.试剂;将混合物覆盖在膜表面,.分钟,摇晃使均匀; 用保鲜膜把膜包起来,放入夹板中;在暗室中将光片,覆盖在膜的上面,夹好 夹子,曝光可以根据荧光强弱来定时间的长短;放到显影液中显影; 再放到定影液中定影;最后放到自来或蒸馏水中冲洗干净。根据结果调 整曝光时间和曝光区域,得到最佳结果。 .. 体内抑瘤实验取体外培养的制成浓度为./砌的细胞悬 液,每鼠右腋下接种.含个细胞的细胞悬液。接种天后称体 重,随机分组和给药,每组“只,设阴性对照组、阳性药物对照组、空质粒 对照组、低、中、高剂量组,具体分组及给药 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 如下:生理盐水 、阳性药物阳性对照组/,., 对照组/,., 博士学位论文 、空质粒对照组瘤内注射,、低剂量组 瘤内注射, 、中剂量组上瘤内注射,、高剂量组 瘤内注射,,除生理盐水对照组和阳性药物阳性对照组 外,其他各组均于注射后对注射局部作电脉冲处理。从分组当日开始隔日测 定 肿瘤的长径和短径,按公式计算肿瘤体积。接种后第天处死裸鼠,称其体 重,剥离其瘤块并称其瘤重,按公式计算抑瘤率,在以肿瘤体积计算瓜 时以未次测量的肿瘤体积代替公式的瘤重。 长径短径 肿瘤体积 公式 。 ,. 对照组平均瘤重一给药组平均瘤重 公式 一????茹两再两面?一% .. 介导报告基因体内导入实验导入小鼠动物实验:只健 康/小鼠胫前肌注射后约,随机分为组只/组, 分别接受电场强度为/及/的电脉冲。日后取注射部位肌肉, 加入细胞裂解液,制备均浆,于离心 /,检测上清荧光 素酶活性。检测方法:取肌肉上清液,加入?山荧光素酶检测底物,用 , /光度计测定内的光产出量,结果以相对光单位 表示。参导入小鼠实验:不同时间点分离小鼠进行冰冻组织切 片,取个断面中的个分别在荧光显微镜 光源,滤片波 长:下观察绿色荧光蛋白表达及制做染色切片观察电脉冲损伤中央 及边缘部位组织病理变化情况。 .仪器 在体电脉冲技术的电脉冲发生器和电极由上海交通大学药学院提供, 可发射电压的方波信号,一个脉冲持续 。两个针头用的是 针灸治疗中所使用的针头,长.,直径.。两个针头距离,分别 代表阳极和阴极。 .统计第一章双质粒 疫苗及在体电脉冲仪的研制和检定 计量数据符合正态分布及方差齐性者,采用 或配对检验,多 组比较采用单向及重复测量方差分析,若数据不符合正态分布及方差不齐, 则 采用非参数检验;阳性计数资料采用列联表卡方检验,样本数量小的实 验组比较采用直接概率法’ 。以上操作均采用.统计 软件所提供的相关应用模块进行。 。 图.重组包膜中蛋白‘及人?/?编码基因质粒构建过程示意图.. ‘/ . 结果 .双质粒 疫苗体外检定结果 双质粒转染.细胞后 能检测到目的蛋白表达, 时蛋白表达达 最高值, 其中、.和吖的浓度分别为.,.,.腿几,, 右图。取质粒转染表达产物的 时蛋门表达?州“降趋势图 鉴定结果,对照组未转染细胞清和转染空载休均未盘测? 及处有特 何阳性反应条带,而 及分别在分质最为 异性反应条带图 左图。 鼍 ?;篇 窒募 警? ? ? ? 目 冰道 :量杯物. .十自目月. 及体外转染?细胞表们。物 分析,吲肢 圈.质粒 检测【右目结果 .根据基因编码的/融合蛋白的一级结构模拟出其空间结构。 表达一/融合蛋白的空间结构能够和天然的.、.空问结构很好的 对应起来,这表明个氨基酸的连接物能够保证表达的一和.蛋自在空 问折叠时互不影响,并能保证.和的生物活性区域充分暴露在融合蛋 的表面劁.。用.和?标准品作为对照,榆测转染细胞 清中的细胞冈了衍性实验结果表明圈 ,.和具仃生物学活性, 转染后 时上清中一和的活性分别为和 /,为榆测垃 高值,与相同样本柬源的检测清浓度的高峰值敛。第一章破质粒疽苗厦在体 电脉冲仅 的研制和检定 ? ? : ::聊 三? 。: ::删 ::瑚 : 表达产物的分于模拟幽及其表达产物的体外生物活性鉴定 / ?锄&, 州 黜口豫 目‰分别为表达的融台蛋自分模拟的目结构肚橙色/.粉 ’域,、分肌为然】红色&.色与./.融合虽自蓝色相麻部位 剐?对图。斟表达产物的活性盎 。 . 体内抑瘤实验结果表及图 验结果显示能显著地抑制细胞裸鼠移植瘤的生长。在低剂 剂量和高剂量组下,无实验动物死亡,也未见明显的体重减轻等毒性反 %、 % 人口底癌细胞裸鼠移植瘤的抑制率按瘤重计算分别为 。 ,其中中剂量与对照组比较,有显著性博士学位论文 表 对人口底癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用 疋出 . 图.不同时间点各实验组人口底癌细胞裸鼠移植瘤体积测量结果... . 介导的外源基因体内转染及其造成的炎症损伤 以绿色荧光蛋白及荧光素酶编码基因作为报告基因,观察上 述蛋白表达质粒经导入小鼠胫前肌后目的蛋白的表 达以及组织病理改变情况。结果显示,处理中央部位肌肉组织损伤较为严重, 可观察到明显肌细胞溶解、坏死及炎症的发生图.;而边缘区损伤较轻微, 第一幸双质粒痘苗及在体电脉冲仪的研制和捡定 期质粒转让成功并表选日的基因产物的肌细胞以该区域为主,可见染色 , 图 。转染天荧光信号为高峰并随时间的推移而运步衰减图 期间损失严重的巾央区域组织修复司时进行,至天肌肉组织基本恢复正常并 可观察到阳性纤维的出现,系细胞核置于中央的再生肌纤维图 。 ,经介导的的只忙小鼠局部组 转染小鼠实验结果图 ? 织荧光索酶活性为 ,而同期未经介导的对照组酶活性仅 为肚 ,组问相差个数量级,差异具非常显著性 ,。 慈 图. 介导肌注后不同时间小鼠冰冻切片组织病理变化检测结果 唔.. 龃 “目十自常组织日?幽:,分划为?损伤中央&边缘部位病?变情 . ,&丹别表小理目.&‰炎疰饿复&肌纤维生情况染色×