口腔黏膜角质化 白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用研究

口腔黏膜角质化 白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用研究 [摘要] 目的 研究白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用机制。 方法 将培养的口腔黏膜上皮角质细胞分别加入孢子型白色念珠菌(孢子组)和菌丝型白色念珠菌(菌丝组)，另将单独培养的口腔黏膜上皮角质细胞作为阴性对照组。比较各组对口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用，并观察白色念珠菌对口腔黏膜上皮角质细胞的凋亡和增殖作用。 结果 菌丝组黏附指数(7.63?1.39)显著高于孢子组(3.47?1.04)，差异有统计学意义(P < 0.05);菌丝组凋亡率[(3.49?0.4)%]显著高于孢子组[(2.07?0.15)%]和阴性对照组[(1.98?0.07)%]，差异有统计学意义(P < 0.05)，而孢子组和阴性对照组凋亡率相比差异无统计学意义(P > 0.05)。菌丝组G0/G1期细胞比例[(38.17?7.83)%]显著低于孢子组[(49.47?11.41)%]和阴性对照组[(57.71?9.39)%]，差异有统计学意义(P < 0.05);S期 1 [(8.54?4.03)%]、G2/M期[(20.18?9.59)%]细胞比例上 升，且显著高于孢子组[(6.47?2.73)%、(10.71?3.19)%] 和阴性对照组[(5.35?2.11)%、(12.38?4.35)%]，差异有 统计学意义(P < 0.05);PI[(42.79?18.73)%]明显高于 孢子组[(28.67?8.79)%]和阴性对照组[(26.87?7.64)%]， 差异有统计学意义(P < 0.05)，而孢子组和阴性对照组 PI相比差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 白色念珠 菌能够导致口腔黏膜上皮角质细胞发生凋亡和增殖周期改 变。 [关键词] 白色念珠菌;人口腔黏膜上皮角质细胞;细胞 凋亡;细胞周期 [中图分类号] R781.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210(2015)01(a)-0004-04 Study on the mechanism of Candida albicans on human buccal epithelial cells ZHANG Hui   YU Chengbo   ZHANG Beibei   YE Meihua   CAI Minqiu   XU Hongmiao   LIN Minli Department of Stomatology， Wenling Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College， Zhejiang Province， 2 Wenzhou   317500， China [Abstract] Objective To explore the mechanism of Candida albicans on human buccal epithelial cells. Methods The oral mucosa keratinocyte cultures were added to spore type of Candida albicans (spores group) and hyphae of Candida albicans (mycelium group)， oral mucosal epithelial cells cultured alone as negative control group. Compared adhesion effect of oral mucosal epithelial cells in each group， and observed the apoptosis and proliferation of Candida albicans to buccal epithelial cells. Results Adhesion index of mycelium group (7.63?1.39) was significantly higher than spore group (3.47?1.04)， with statistically significant difference (P < 0.05); the apoptosis rate [(3.49?0.4)%] was significantly higher than that in spores group [(2.07?0.15)%] and the control group ([1.98?0.07)%]， with statistically significant difference (P < 0.05)， while the spores group and the control group had no significant difference (P > 0.05). The proportion of phase G0/G1 in mycelium group [(38.17?7.83)%] was significantly lower than that of spore group [(49.47?11.41)%] and the control group [(57.71?9.39)%]， with statistically significant difference (P < 0.05); the 3 proportion of phase S [(8.54?4.03)%] and phase G2/M [(20.18?9.59)%] increased， significantly higher than those of the spores group [(6.47?2.73)%， (10.71?3.19)%] and the control group [(5.35?2.11)%， (12.38?4.35)%]， with statistically significant difference (P < 0.05); PI [(42.79?18.73)%] was significantly higher than spore group [(28.67?8.79)%] and the control group [(26.87?7.64)%] ， with statistically significant difference (P < 0.05)， while the spores group and the control group had no significant difference (P > 0.05). Conclusion Candida albicans can cause oral mucosa keratinocyte apoptosis and proliferation cycle change. [Key words] Candida albicans; Human oral mucosal epithelial cells; Apoptosis; Cell cycle 白色念珠菌(Canidia albicans)是一种常见的条件致 病菌[1-2]，正常情况下白色念珠菌不引起疾病，与机体共生， 机体发生白色念珠菌感染的主要原因是正常的防御功能受 到损害。白色念珠菌普遍存在于人体中，调查显示[3]，口腔 中白色念珠菌带菌率最高，约为85%。近年来大量广谱抗生 素以及免疫抑制剂的使用导致菌群失调和机体免疫力降低， 使得非致病性白色念珠菌转化为条件致病菌而引起各组织 感染。研究显示[4]，口腔白色念珠菌感染属于慢性感染，难 以彻底根治，且病情容易反复发作，给患者的日常生活造成 4 严重影响。关于白色念珠菌的致病机制目前仍无明确结论，有报道称[5]，黏附作用在白色念珠菌定植、侵袭中发挥着重要作用。口腔黏膜上皮角质细胞是口腔防御的主要物质基础，也是白色念珠菌侵袭的主要靶细胞，但是白色念珠菌是如何侵袭口腔黏膜上皮角质细胞并产生致病作用，目前仍未见相关报道。本研究通过分析白色念珠菌对口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用以及对增殖和凋亡的影响，以期为丰富临床治疗提供理论基础，现将研究成果报道如下: 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1 材料与试剂 白色念珠菌 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 菌株(ATCC90029)购自南京便诊生物科技有限公司，人口腔黏膜上皮角质细胞购自中国医学科学院;沙堡(4%)葡萄糖琼脂培养基(SDA)购自广州市齐云生物技术有限公司;其他相关仪器和试剂均由温州医学院附属温岭医院实验室提供。 1.2 方法 1.2.1 白色念珠菌培养  将ATCC90029白色念珠菌标准菌株培养于沙堡培养基中，转种3次后配成菌悬液，浓度设定为3×105 CFU/mL。孢子型白色念珠菌:将白色念珠菌接种于酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养基中37?培养至长出白色乳状菌落，将菌落再转种于含YPD培养基的离心管中，37?孵育18 h。菌丝型白色念珠菌:将白色念珠菌接种 5 于pH 6.0、含10%磷酸盐缓冲液(PBS)的RPMI 1640培养基中，37?孵育3,5 h即诱导出菌丝型白色念珠菌。 1.2.2 口腔黏膜上皮角质细胞培养  常规细胞传代培养，选择对数生长期的角质细胞，用含0.02%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的胰蛋白酶(0.25%)消化，将细胞收集并离心，弃去上清液，加入预先配置的冻存液，将细胞吹打混匀。-80?保存待用。 1.2.3 实验分组  口腔黏膜上皮角质细胞在培养瓶中培养48 h，将细胞贴壁制成单层细胞，弃去培养液后用PBS冲洗3次。将加入菌丝型白色念珠菌的作为菌丝组，加入孢子型白色念珠菌的作为孢子组，单独培养的口腔黏膜上皮角质细胞作为阴性对照组。 1.2.4 黏附试验  生长期口腔黏膜上皮角质细胞用胰蛋白酶消化，将孢子型、菌丝型白色念珠菌分别与口腔黏膜上皮角质细胞共同培养48 h，用滤膜收集口腔黏膜上皮角质细胞，再用PBS洗滤3次，收集悬液离心，并制成涂片;待风干后进行染色，电镜下观测黏附现象。随机选择100个口腔黏膜上皮角质细胞，统计白色念珠菌总数，并计算黏附指数。黏附指数=黏附白色念珠菌数量/细胞总数。所有实验平行测量3次，取3次均值。 1.2.5 细胞凋亡检测  生长期口腔黏膜上皮角质细胞用胰蛋白酶消化，将不同 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 型白色念珠菌加入培养瓶 6 中感染，并于CO2培养箱中培养48 h，然后胰蛋白酶消化，再用PBS冲洗3次，离心弃上清液。加入10 μL异硫氰酸荧光素混匀，室温避光反应20 min;再加入5 μL碘化丙啶后，采用流式细胞仪上机检测，计算细胞凋亡率，并用软件分析G0/G1期、S期、G2/M期细胞百分数。上述操作平行重复3次，取均值。增殖指数(PI)=[(S+G2/M)/G0/G1+S+G2/M]×100%。 1.3统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数?标准差(x?s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 各组黏附指数与凋亡率比较 菌丝组黏附指数显著高于孢子组(P < 0.05);菌丝组凋亡率显著高于孢子组和阴性对照组(P < 0.05)，而孢子组和阴性对照组凋亡率相比差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。 表1   各组黏附指数与凋亡率比较(x?s) 注:与孢子组比较，aP 7