菌膜在原发舍格伦综合症发病中作用的实验研究

菌膜在原发舍格伦综合症发病中作用的实验研究 , ,;,,,,, ’,?校代,,,,; ，，临,,) 学 ‰ ?,,,,,, 四川大学 口腔医学博士专业学位论文 茼膜在原发分格伦 题目 综合症发病中作用的实验研究 作 者 何 巍 专 业 口腔临床医学 指导教师姓名 李龙江教授 ,,,,,, 四川大学华西。腔医学院博士学位论文, 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别中以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文是本人在四川，大学读书期问在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解四川大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权四川大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段学位论文作者签名:签字日期:疗年年学位论文作者毕业后去向:莉衍置季一,研冠工作单位:却珂《一稍,也 联系方式:,:;石吵铅?二，通讯地址:辫‘,,‘衣窒,炙多醣,呈 邮政编码:甜螂上,， 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 英文缩略词表缩略词 英文全称 中文名称,, ,,,,,,,’, ,,,,,,,, 舍格伦综合征,,, ,,, ;,,,,,,,,,, 泛细胞角蛋白,, 链霉菌卵白素过氧化 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 物酶,， ,,,,,,,, ,,,,, 标记指数,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, 牛血清白蛋白,,，,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, 酶联免疫吸附试验,, ,,,,;,, ,,,,,,, 吸光度,?, 四唑蓝比色试验 ,,(,(,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,〕)一,，,一 ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;;,,,,,,, 细胞外多糖,, ,,,,,,, ,,,,,,, 菌膜病,, ;,,,,; ,,,,,,,, 肺囊性纤维化,,, ,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,,,, 弥漫性泛支气管炎,,, ,,,,, ,,,;,;,,, ,,,,,,, 人类白细胞抗原系统,,,,,,, ,,,,,,,’, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, 自身抗原,,(,,),,(,，,, ,,,,,,,’, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, 自身抗原,,,(,,),,(,,,,, ,,,,,,’, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, 自身抗原,,(,,,)，,,,, ,,,,, ;,,, ,,,,,,, ,, 岛状细胞抗原,,,,,,—, ,,,,,, ,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,(, 人类自细胞病毒一, 四川大学华西口腔医学院博士学位论文 菌膜在原发合格伦综合征发病中 作用的实验研究 博士研究生:何巍 导 师:李龙江教授 中文摘要 研究目的:明确细菌菌膜与原发,,的发病关系，通过研究菌膜成分藻酸盐诱发的免疫反应对正常腮腺腺细胞的作用探讨原发,,发病机理，采用藻酸盐诱发人类原发,, ，，缶床表现的动物模型。 研究方法:首先分离获取成活率高且保持功能的腮腺腺细胞，采用改良,,,,培养基进行腮腺腺细胞的原代及传代培养，观察腮腺腺细胞生长状况，透射电镜观察腮腺腺细胞的超微结构，利用细胞免疫组化法检测细胞中泛角蛋白、,; 一淀粉酶蛋白和肌动蛋白的表达情况以鉴定细胞来源，并且分别检测,一淀粉酶蛋白在不同代次腺细胞中的表达情况判断其分泌功能。 将藻酸盐(,,,,,,,,)与,,,偶连形成具有较强免疫原性的,,,,,,,,—,,,交联物免疫兔，按抗原量,(,,,,,,接种于新西兰白兔皮内，间隔,,,加强免疫,次，共加强,次后，利用间接,,，,,法检测藻酸盐抗体效价;将原代培养的兔腮腺腺细胞按,,‘个,,,接种到,,孔板上，置入细胞培养箱继续培养,,，分为,组:,空白对照组、,牛血清白蛋白组、,藻酸盐组、,抗藻酸盐血清组和,抗藻酸盐血清，藻酸盐组，分别加入,,,、牛血清白蛋白、藻酸盐或(和)新鲜抗藻酸盐血清继续培养，分别于,,、,,、,,,和,,,不同的时间点，取出,,孔培养板，采用,,,法检,,组腮腺腺细胞增殖情况; 四川大学华西口腔医学院博士学位论文倒置相差光学显微镜观察不同组腮腺腺细胞生长、形态和结构变化;扫描电镜观察,组腺细胞超微结构的改变。 动物试验采用已获藻酸盐免疫的新蓖兰白兔,,只，随机分为,,、,,两组，,,、,,组各为,只正常新西兰白兔作为平行对照组，间隔,,经腮腺导管灌注藻酸盐，分别于灌注前、灌注,次(,,、,,组)和,,次(,,、,,组)检测类似于人类,,在唾液量、施墨实验(,;,,,,,, ,,,,)、,淋巴细胞亚群、腮腺造影和组织病理等方面的改变。 研究结果:体外培养腮腺腺细胞具有一定的增殖能力，可传,代，存活,,以上:透射电镜下腺细胞表面可见到微绒毛、胞浆皱褶和细胞顶部的酶原颗粒，胞核大卵圆形，胞质内见线粒体和粗面内质网;免疫组化染色显示培养腮腺腺细胞特异性抗体泛角蛋白及,一淀粉酶蛋白染色强阳性(，，，)，胞膜和(或)胞浆内可见棕黄色点状分布的颗粒;肌动蛋白染色阴性(一):测定培养腮腺腺细胞,一淀粉酶的表达水平，不同代次腺细胞,;一淀粉酶的表达水平不同，在,代细胞中的表达水平依次是,,(,,，,,,，,,(,,和,(,,，原代细胞到第,代强度随传代次数的增加而逐渐减弱，原代和第,代细胞的?一淀粉酶的表达强度均较高并且可维持一定水平，两者无差异(侈,(,,)。第,代细胞的,,一淀粉酶水平明显低于原代和第,代，与,者差异显著(,,,(,,)，第,代基本测不到,一淀粉酶的表达。所得结果说明原代和传代培养第,代腮腺腺细胞保持良好的增殖能力和分泌功能。 ,,,,,,,,—,,,交联物免疫兔约,,天后，采用间接,,，,,法测得抗藻酸盐血清的效价可达到,:,,,。并测定抗藻酸盐血清和藻酸盐,者适宜反应浓度:藻酸盐为,, , ,,,,，抗藻酸盐血清的稀释 四川大学华西口腔医学院博士学位论文度为,:,,,。,,,法分别检测在,,、,,、,,,和,,,时间检测,、,、,、,、,组中腮腺腺细胞增殖情况的结果显示:在,,、,,、,,,检测,、,、;、,、,组的,,值，组间均无差异(,,,(,,);在,,,点，,组与,、,、,、,组差异显著(,,,(,,)，说明抗藻酸盐血清和藻酸盐免疫反应,,,出现对腺细胞的增殖有显著的抑制。倒置相差光学显微镜下观察,、,、,、,组腺细胞的生长和形态未见异常，,组在,,,时间点和,,,点可观察到个别腺细胞表面有破裂，胞浆外溢，细胞形态不完整:扫描电镜观察,组在,,点即有个别腺细胞胞膜有破裂，呈圆孔形，细胞的轮廓仍清晰完整;,,,可见破裂细胞数增多，且细胞膜上破裂孔增多变大。,,,可见细胞的形态不完整，有较大范围胞膜破裂，细胞崩解，说明这种免疫反应直接攻击正常腮腺腺细胞的胞膜，导致胞膜破裂，腺细胞功能丧失。 分别在灌注 前、灌注,次和,,次检测实验组和对照组的唾液量、施墨实验和,淋巴细胞亚群的变化:灌注,次和,,次唾液量明显低于灌注前和对照组，差异显著(,,(,,)，而且，灌注,,次组唾液量明显少于灌注,次组，差异显著(,,,(,,)，说明腮腺灌注藻酸盐后，其唾液量减少。并随着灌注次数的增多，腮腺组织的破坏加重，腮腺的分泌功能丧失越多;,;,,,,,, ,,,,在,,、,,、,,、,,组中均无差异(易,(,,)，提示泪腺功能正常;灌注前,,组和,,组的,,,值明显高于对照组差异显著(,,,(,,);,,,,,,,的值在灌注前也明显大于对照组，差异有显著性(欠,(,,)，说明机体获得藻酸盐免疫后就已经表现出免疫功能的改变，主要是,,,细胞增多，,,,,,,,比值增大，获免疫后细胞免疫功能增强;经腮腺导管灌注藻酸盐,次后，,组的,,,的值增大，与灌注前和对照 四川大学华西口腔医学院博士学位论文组均有显著差异(,,,(,,);而,,,则无明显变化，,,,,,,,的比值明显较灌注前减小，差异也有显著性(,,(,,):而与对照组无差异(,,,(,,)。从这组结果可以得出，灌注,次藻酸盐后，主要是,,,的值发生变化，增大明显，导致,,,,,,,的比值回落，但是,,,和,,,的值均高于正常，显示免疫功能紊乱;灌注,,次后，,,,的变化不明显，,,,仍有上调，导致,,,,,,,比值变小，与灌注前、灌注,次和对照组均有差异(,,,(,,)。说明机体的免疫功能减低，而,,,和,,,却仍高于正常对照组，提示机体免疫功能紊乱的程度加重。 腮腺造影的结果显示灌注的次数不同其影像也不同:灌注,次主要表现为主导管周围呈羽毛状改变，而腺体未见异常;灌注,,次后腮腺造影可见导管增粗、末梢分枝导管有点状、球状影像，腺体部有充盈缺损。组织病理,,染色结果也和灌注次数有关，,，组(灌注,次)腮腺组织切片可见，腺体内与导管周围有大量的致敏细胞、炎症细胞和少量淋巴细胞浸润，组织表现为变态反应象，可见肥大细胞和单核细胞，腺泡正常结构混乱，腺泡坏死，有大量嗜酸性无定形物质，导管上皮增生，肌上皮岛形成，没有见到纤维结缔组织，收集的唾液量也较对照组明显减少，说明腺体组织受到藻酸盐免疫反应作用后腺体组织破坏，分泌功能降低:,,组(灌注,,次)腮腺组织以腺泡萎缩和淋巴细胞浸润为主要征象，有大量嗜酸性无定形物质，大片的腺泡呈空泡样，正常的腺泡结构消失，腺管增粗，有少量淋巴细胞包绕在腺组织周围，腺体组织破坏的程度更加严重，大部分腺体分泌功能丧失，测得的唾液量也较灌注,次的量有明显减少，以上影像学结果、病理学结果和腺体分泌功能检测所反映的病理过程基本是吻合一致的， 四川大学华西口腔医学院博士学位论文腮腺组织受到的损害随着灌注次数的增加而加重。 结论:藻酸盐在兔腮腺中的免疫反应所造成的损害类似于人类原发,,腮腺的临床表现，证实了菌膜的主要成分藻酸盐可能是原发,,发病的原因;藻酸盐诱发的免疫反应直接攻击正常腮腺腺细胞的胞膜，导致细胞膜破裂，可能是原发,,的发病机理。关键词:兔;原发,,;藻酸盐;腮腺:免疫反应 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ，啊,,,,;, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,, ,, ,,;,,,,, ,,,,,,,: ,,,,, ,、，,,, : ,,,,(,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,:,, ,,,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,, ,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,;,,,, ;,,, ,,,,,,,;,, ,,, ,, ,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,( ,,,,,,,:,,,,,, ,,,,,,, ,;,,,, ;,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,, ,,,’,,,,,, ,, ;,,,,,,, ;,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ;,,,,,,, ,,;,,,;,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,;,,,, ,,;,,,;,,,;,,,(,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,, ,,,,,, ,;,,,, ;,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,;,,,,;,, ,, ,,;,, ,,,,,？,,;,,, ,,;,,,,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,( ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,,?,,,(, ,,,,,,),,, ,,一,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,,，,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,(,,,,,;,),,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,;,?, ;,,,, ,,,, ;,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,, 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不清，研究证实其体液免疫增高而细胞免疫降低，血清中可分离出,种自身抗体:,种抗涎腺导管抗体和,种非特异性抗体即,,—,抗体、,,—,抗体和,,—;抗体。尤其,淋巴细胞表现极其活跃，在感染的,,腮腺组织中有,,,,记忆,细胞聚集，其外周血中的,,,,记忆,细胞明显减少。另外，凋亡也是目前研究的热点，,,的腺细胞体外培养加肿瘤坏死因子,诱导凋亡，发现,,(,,(,,)、,,—,,(,,)在凋亡过程中由细胞内到细胞膜表面的分布的现象，说明,,是自身抗体在细胞外直接攻击核酸或蛋白质复合体的结果，自身抗原如何逃避免疫耐受可能与细胞的凋亡有关，诱导的凋亡细胞自身抗原在细胞膜表面的表达，构成了自身免疫反应发病机制的基础。但我们知道，凋亡不会引发周围组织发生炎症或免疫反应，是在什么启动原因下使细胞膜和核膜破裂产生自身抗原并诱发机体自身免疫反应，造成免疫调节紊乱尚不清楚。 回顾,,的临床病理过程，发现腮腺的慢性感染常常与之伴行，而,,又在临床表现和病理上与慢性复发性腮腺炎有显著的不同，有学者将这种发生在,,前的慢性化脓性腮腺炎称为,,亚临床型，,者之间的相关性和区别都很明显，但一直没有较为合理的理论解释。近来有关细菌菌膜(,,;,,,,,, ,,,,,,,)的研究结果颇受关注，菌膜是细菌在不利的生长环境下产生藻酸盐多糖使细 ,, 四川大学华西口腔医学院博士学位论文菌互相粘连形成膜状物附着于瘸灶的表面或粘膜上。菌膜对人体的致病性表现在两方面:第一，菌膜释放浮游菌造成顽固的慢性感染急性发作，如慢性支气管炎急性发作。第二，藻酸盐会导致对机体有害的变态免疫性疾病。已有研究证实，藻酸盐具有抗原性，能刺激机体产生抗体，其抗原过剩，所形成的免疫复合物可大量沉着于组织中，免疫复合物,;端与中性白细胞结合，使白细胞溶解，其溶解产物造成组织的破坏。我们的前期研究已证实慢性腮腺炎的腺体内有大量菌膜菌存在，慢性腮腺炎的顽固性反复急性发作的临床表现与菌膜引发的菌膜病有关。而且临床上可见慢性腮腺炎长期反复发作最终导致口干、眼干等,,的症状。由此推断，腮腺内的菌膜是否与,,的发病有关,原因可能是菌膜的成分藻酸盐会导致对腺体有害的自身免疫性疾病，破坏腺细胞和其它正常组织，表现出,,的复杂临床症状。目前，有关菌膜引发慢性炎症和免疫变态反应相关疾病的研究已有很多报道，但其与,,病因的研究未见国内、外文献报道。因此，本研究拟于通过藻酸盐诱发免疫反应对正常腮腺细胞作用的体外实验研究模拟细菌菌膜在腮腺组织内的免疫反应，采用,,,法和 璧缇倒鄄於匀 傧赴 淖饔茫 教执嬖谟谌 倌诘南妇 ざ匀 傧赴 斐伤鹕艘约八鹕嘶 啤植捎迷逅嵫喂嘧? 儆辗?螅蠖 锬,吞教窒妇 た赡苁牵樱拥姆?? 蛑 灰约埃螅臃?』 疲 俅蔡峁??蛑瘟频囊谰荨?四川大学华西口腔医学院博士学位论文 实验一勉腮腺腺细胞的原代培养和鉴定 获取腮腺腺细胞并对其研究是探讨腮腺疾病的主要途径，过去关于腮腺结构、生理、病理的研究，主要以动物模型进行，其结果常常由于体内诸多因素的影响而变得不确定，重复性差，结果的可信度不高。利用体外培养腮腺腺细胞来作为对象进行研究，可避免这些缺点，使研究简单化，结果的重复率高、更具有科学研究价值。目前，尚缺少分离、培养涎腺腺细胞的成熟方法，本试验拟选用兔的腮腺进行先细胞体外培养，以期获得足量的、有功能的腮腺腺细胞。材料与方法,实验材料,(,实验动物:,周龄的新西兰白兔(体重,,,—,,,,)，郑州大学医学院实验动物中心提供。,(,器械:眼科剪，眼科镊,(,试剂及仪器:胎牛血清、,,’,，, ，,,(,,(,:,)培养液，,,,;,公司产品;胶原酶、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、?(淀粉酶多克隆抗体(,,,,,,,,,)、,,,,,公司产品; 泛细胞角蛋白,,,,,;,,,,,,,,,, ,,,)单克隆抗体、肌动蛋白(,;,,,)单克隆抗体、,,,呈色试剂盒，博士德公司产品，,,,,细胞培养瓶:相差倒置显微镜;,,,,;,,,,,,型透射电镜:,,,孵箱。保 锤牧迹模停牛团嘌 海海模停牛停 埔唬保玻ǎ保海保 保埃ィ洹?, 澹?,, 四川大学华西口腔医学院博士学位论文加入以下成分 胰岛素 ,,,,,, 转铁蛋白 ,,,,,, 表皮生长因子 ,,,,,,, 氢化考的松 ,,,,,,,, 异丙肾上腺素,,,,,, 霍乱毒素 , ,,,,,〕 青霉素、链霉素 ,,,实验方法,(,兔腮腺腺细胞原代培养方法,(,,,取材:将日本大耳白兔麻醉(肌注氯胺酮,,,,,,,体重)，消毒，无菌条件下切取双侧腮腺组织，,,,,,液清洗，置器皿中，用眼科剪、镊仔细去除包膜、血管及结缔组织。,(,(,剪切:将处理过的腮膝组织放入小瓶里，以锐利眼科剪反复剪切，使成为,珊,小的组织块。,。,(,消化分散: 把剪切后的组织小块移置三角烧瓶中，加入,(,,,胶原酶，置,,?温箱中消化约,,,,,,。,(,(,收集细胞:取,,,,离心管，加入,,,,培养液，以吸管将消化的细胞悬液缓慢、轻巧地移加于离心管的培养液上面，放在,,?培养箱中静置,,,,,，待其自然沉降后，收集其下层,,,的细胞沉降物。,,,—,,,,,,,离心,,,,,，再悬浮于培养液中，并作细胞记数。,(,(,接种:将所得的细胞悬液，以, , ,,,个细胞,,,的浓度接种于,,,,一次性塑料培养瓶中，置,,。,培养箱培养。约,—,天更换培养液。 四川大学华西口腔医学院博士学位论文,(,(,传代:原代细胞培养,—,天，可见细胞大量生长，基本长满全瓶，即可进行传代培养。,(,生长曲线的绘制,(,(,取材、剪切、消化和收集腮腺细胞同上,(,(,调节细胞密度:小心加入培养液，用吸管反复轻柔吹打，混匀后，在移入大三角瓶中，血细胞记数板记数，调节细胞密度为,×,,,个细胞,,,。,(,(,按,×,,,个细胞,,,接种于,,,,培养瓶中，每组,个培养瓶，共,组，每日取,组经酶消化、离心、细胞记数后，以平均值为实际细胞数。,(,(,将不同时间点所得不同的细胞数记录在以时间和细胞数坐标图上，绘制出细胞生长曲线。,(, ,,免疫组化法,(,(,吸去培养液，,,,缓冲液洗涤,遍，每次,,,,。,(,(, ,,多聚甲醛固定,,,,,，再用,,,缓冲液洗涤,遍，每次,,,,。,(,(, ,,,。,:孵育.