null生物技术专业系统实验（四）
—酶（蛋白质）
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
实验VI生物技术专业系统实验（四）
—酶（蛋白质）工程实验VI六、脲酶米氏常数（Km值）
简易测定 六、脲酶米氏常数（Km值）
简易测定 null1.目的意义 2.实验原理
3.仪器设备 4.实验方法
5.实验报告 6.思考题
1.目的意义1.目的意义 1913年，由Michaelis L.和Menten M.在前人研究的基础上提出的米氏方程（Michaelis-Menten Equation）是酶学中
表
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示一个酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。 1925年，经过Briggs和Haldane修正后，提出更有普遍意义的酶促反应速度方程，如下所示：、null其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V的单位相同, mol·L-1·min-1）； [S]为底物浓度（mol·L-1）；Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图： 米氏常数的意义米氏常数的意义由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。
因此,米氏常数的单位为mol·L-1。
不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。
Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。
通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶最佳底物，即天然底物。2.实验原理2.实验原理底物浓度对酶促反应的影响
在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：
在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。
当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。null 酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：null 用1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值，斜率为Km/Vmax。如图所示：Km=-1/x3.仪器设备3.仪器设备3.1 试剂
大豆粉。
脲酶液：取大豆粉2g移入250ml三角烧瓶，加30%酒精100ml，连续搅动15min，室温下静止1-4h，离心或脱脂棉过滤，收上清备用（上清液需清亮、透明）。
30%酒精。
0.1 mol·L-1脲液：取尿素0.6g定容至100ml。然后分别稀释至1/20、1/30、1/40、1/50 mol·L-1系列液。100g·L-1
1/15 mol·L-1PB（磷酸盐缓冲液，pH7.0）。
100g·L-1硫酸锌。
100g·L-1酒石酸钾钠。
null纳氏试剂：
分别溶解3.5g氯化高汞（HgCl2）于20ml热蒸馏水，10g碘化钾于5ml水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70ml 30%KOH，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜。倾出上清液贮存于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。
显色液：
将100g·L-1酒石酸钾钠和纳氏试剂按1：2混合即成显色液（临用前混合）null3.2 器材
15ml 大试管20支
1ml 移液管2支
5ml 移液管2支
10ml 移液管2支
200ml 烧杯2个
100ml 烧杯2个
玻棒 1支
双蒸水1瓶（50ml）
比色皿1套（4个）、玻璃皿1套、洗瓶1个
吸耳球 1个
恒温水浴锅1台
试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl移液器各1支；
小号、中号、大号枪头各1盒（需灭菌）
旋涡混合器1套（置于每组桌上）4.实验方法4.实验方法取一定量的酶（稀释为10-5倍）；
加入各种不同浓度的底物（如表所示）；
在一定时间内测定产物的量（15min）；
建立x，y轴，作图，建立回归方程；
在Y=1/2Vmax时，求其x（即[S]）→Km；4.1 测定—取5支试管，分别标记1-5号，按照下表操作。4.1 测定—取5支试管，分别标记1-5号，按照下表操作。迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。4.2 数据处理4.2 数据处理
各管在420nm测定OD420nm值。
由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比，反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。
测定所用单位为Km单位g·L-1 。
由1/A对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化可溶性淀粉溶解的米氏常数Km和最大反应速度Vmax。
5.实验报告5.实验报告5.1 根据所得数据填写实验报告表
5.2 讨论
6.思考题6.思考题 1.在测定酶催化反应的米氏常数Km时和最大反应速度Vmax时，应如何选择底物浓度范围？
2.为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数，而Vmax却不是？
3.米氏常数Km值的物理学意义和生物学意义是什么？null周艳梅：15087022104
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