基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术

基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑技术［摘要］Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)—样可用于各种复杂基因组的编辑。该系统在crRNA的指导下，使核酸酶Cas识别并降解外源DNA，其中，□型CRISPR-Cas系统最为简单，仅包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA：crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术的核心为将tracrRNA:crRNA 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 为引导RNA，在引导RNA的指导下Cas9定位于特定的DNA序列上，进行DNA双链的切割，实现基因组的定向编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDel突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失．由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。［关键词］:CRISPR-Cas9系统；基因组编辑技术；核酸内切酶简介近年来，基因组编辑技术(genomeengineeringtechnologies)的快速发展为生物学研究带来了新纪元。与传统的基因克隆技术不同，基因组编辑技术可直接在基因组上进行DNA序列的敲除、插入、定点突变以及组合编辑等，实现基因功能与调控元件的系统研究，在工业生物工程等方面具有广阔的应用前景。早期，基因组编辑技术主要利用同源重组介导的打靶技术，但由于效率较低(10-6〜10-9),极大地限制了其应用。为解决这一难题，一系列人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术被开发，可通过在基因组特定位置上形成DNA双链断裂(DNAdoublestrandbreak，DSB)，借助于细胞自身的修复系统如非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHRJ)或同源重组(homologydirectedrepair，HDR)，从而实现在不同生物与细胞类型中有效的定点基因组编辑。目前，已有4种不同的人工核酸内切酶应用于基因组编辑:巨核酶技术(Meganucleases)、锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，ZFN)与RNA靶向DNA内切酶Cas9。[1]CRISPR研究历史1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列[2]，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年，科学家将其正式命名为clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)[3-5].因为缺乏病毒和质粒的序列信息，初期对CRISPR的研究进展缓慢，其行使的确切功能一直未能阐明．2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。2006年美国研究小组通过生物信息分析预测，CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能[6].但这些都只是假设.2007年，Barrangou等[7]首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵.2008年，Marraffini等[8]又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能，由此科学家们揭开了研究CRISPR系统作用机制的序幕。之后研究人员很快发现CRISPR系统在食品发酵工业和医学中的潜在价值，使其成为研究的热点。[9]CRISPR-Cas9系统的作用机制Crispr/cas系统是很多细菌和古生菌的一种获得性免疫系统，在已经完成测序的细菌中占40%古生菌中占90%，它通过CRISPR对入侵的外源核酸分子或者病毒进行特异性地识别并用CAS蛋白对其切割消化，从而达到对自身的免疫性保护。CRISPR是一段特殊的DNA重复序列，长度通常为21~47个碱基，可变的间隔序列为26〜72个碱基。Cas存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。在细菌和古生菌中Crispr/cas系统主要分为三种类型，根据核心元件和序列的不同又分为约10种亚型。菌体通过摄取， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达以及干涉三个基本过程发挥免疫过程。简单地说就是病毒或核酸分子入侵细菌，细菌将其编辑插入到自身的基因组CRISPR位点附近，在转录表达阶段，CRISPR间隔重复序列被转录成不成熟的前体crRNA（pre-crRNAs）。pre-crRNAs被进一步剪接加工形成成熟的小的crRNAs,有一段间隔序列两边被重复序列包围。在干涉阶段,crRNA和CAS蛋白结合形成一个大的效应复合物，当病毒或核酸再次入侵时，crRNAs就会通过碱基配对将CAS蛋白带到互补区，诱导基因发生位点特异性的断裂，从而阻断了病毒在细胞内的扩增。在不同类型的Crispr/cas系统中，效应核蛋白体（RNP）的组装和功能不同，I型系统中crRNAs被组装到一个称为Cascade的复合物中，由CAS3引起DNA双链断裂。三型系统中RNP复合物中包括CasRAMP（Cmr或者Csm）蛋白，在体外crRNAs识别和切割合成的RNA，也可在体内切割双链DNA。现在应用最广的是II型Crispr/cas系统，它的组装简单仅仅需要一个Cas9核酶。最近Cas9和sgRNA组成的复合物的晶体结构已经被解析出来，其造成DNA双链断裂的机制进一步得到证实。SJ+CutsitecrFtfMATnpttenp^tonindiCRISPR—刑証a/辆iwI彳卜|InvadingD4MA«hiiv^g*CRISPR-Cas9系统工作原理模式图最近Malietal.改造了酿脓链球菌II型Crispr/cas系统称之为Crispr/cas9系统，该系统由gRNA和人类编码子最优的Cas9核酶形成RNA和Cas9蛋白的复合物，在应用中我们将靶序列插入到Crispr位点中，它被进一步转录加工形成sgRNA，sgRNA识别并结合靶位点将Cas9蛋白带到PAM位点上游的DNA片段上，由Cas9蛋白的两个亚基分别切割互补链和非互补链，引起双链断裂。CRISPR/Cas9系统可通过简单的转染技术将其转进各种不同的细胞系中从而改造不同的细胞。其应用简单便捷，易于操作，成为一种强大的基因修饰工具[7]。Crispr-cas9系统的应用展望和TALEN和ZFN相比，Crispr-cas9系统有很多优点也有一些缺点。和TALEN和ZFNs不同，Crispr/cas9系统是利用碱基配对来识别靶点，而Cas9核酶是一致的，因此只需要设计出靶基因的gRNA就可以了。因此Crispr-cas9系统的设计简单便捷，易于筛选。Crispr-cas9系统的应用也更加广泛，它可用于各种细胞还可同时靶向多个基因或者同一基因的不同位点。而且通过突变Cas9的一个酶切活性位点可以提高细胞的同源重组率，提高targetin效率。如果将Cas9的酶切活性位点全部缺失突变，融合表达cas9和某些转录因子，可以诱导或抑制靶基因的转录表达，该技术被称为CRISPR干扰技术(CRISPRi)。衡量一项技术的研究应用前景时，效率和脱靶率是一项重要指标，在已发表的应用Crispr-cas9系统的文献中，Crispr-cas9系统和ZFN以及TALEN的效率相近，但是Cas9对碱基错配有很大的包容性，造成了该系统的高脱靶率。由于该技术研究发展的时间还比较短，进一步的研究很可能会提高它的打靶效率降低其脱靶效率。在接下来的研究中该系统的转运载体的研究也会进一步提高其应用[10-11]参考文献CapercchiMR.Alteringthegenomebyhomologousrecombination[J].Science,1989,244(4910)：1288-1292.IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,etal.Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduct.JBacteriol,1987,169(12):5429-5433.JansenR,vanEmbdenJD,GaastraW,etal.Identificationofanovelfamilyofsequencerepeatsamongprokaryotes.Omics:aJournalofIntegrativeBiology,2002,6(1):23-33.MojicaFJ,FerrerC,JuezG,etal.LongstretchesofshorttandemrepeatsarepresentinthelargestrepliconsofthearchaeaHaloferaxmediterraneiandHaloferaxvolcaniiandcouldbeinvolvedinrepliconpartitioning.MolMicrobiol,1995,17(1):85-93.JansenR,EmbdenJD,GaastraW,etal.IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes.MolMicrobiol,2002,43(6):1565-1575.MakarovaKS,GrishinNV,ShabalinaSA,etal.AputativeRNA-interference-basedimmunesysteminprokaryotes:computationalanalysisofthepredictedenzymaticmachinery,functionalanalogieswitheukaryoticRNAi,andhypotheticalmechanismsofaction.BiolDirect,2006,1:7.BarrangouR,FremauxC,DeveauH,etal.CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes.Science,2007,315(5819):1709-1712.MarraffiniLA,SontheimerEJ.CRISPRinterferencelimitshorizontalgenetransferinstaphylococcibytargetingDNA.Science,2008,322(5909):1843-1845.郑小梅，张晓立,于建东，郑平，孙际宾.CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展.生物技术进展,2015年第5卷第1期(1-9).方锐，畅飞，孙照霖，李宁，孟庆勇CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术.ProgressinBiochemistryandBiophysics2013,40(8):691-702.刘志国.CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展.畜牧兽医学