一种改进的荧光定量PCR标准曲线法的建立

空堡捡墅医堂苤查!鲤!生!旦筮!!鲞箜!翅￡!边』!尘丛鲤：』!塑!塑!：!丛!!：盟!：鱼·687·．新技术与新方法．一种改进的荧光定量PCR标准曲线法的建立彭瑾瑜吴丁兰钟惟德付艳艳朱彦博常弘【摘要】目的对常规实时荧光定量PCR(RT—PCR)的标准曲线法进行改进，以建立一种更为准确的RT—PCR的标准曲线定量法。方法通过构建B·actin、KLKI1的质粒DNA标准品，以B．actin质粒DNA为正常对照，制作内参基因和目的基因的标准曲线，获得各自的扩增曲线。RT—PCR检测两种基因在恶性前列腺组织细胞LNCAP中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达，并将改进的标准曲线法与常规的标准曲线法分别对B-actin／KLKll实时定量PCR的结果进行分析，分析两种方法的差异，以衡量新方法的准确性。结果所得p—actin和KLKll的标准曲线线性相关性良好(p—actin砰=0．991，KLKlI砰=0．992)，但两种基因的扩增效率有差异(B-actin123％，KLKll99％)。两种不同的标准曲线法处理后得到不同的结果：常用标准曲线法结果显示KLKll在LNCAP中有表达下调，而改进的标准曲线法得出KLKll在LNCAP中上调4．46倍。目的基因与内参基因的扩增效率差异有统计学意义(t=4．829，P<0．05)。结论与常规的绝对定量法比较，改进的标准曲线法避免了因默认目的基因与内参基因有相同的扩增效率而导致的错误，是一种更为准确的荧光定量PCR分析方法。【关键词】聚合酶链反应；核酸扩增技术；荧光光度测定法；荧光染料；RNA，信使AnadvancestandardCBIWemethodinfluorescencereal-runePCRPENGJin—yu‘．WUDing．1an。ZHONG耽i·如，FuYan—yan，ZHUYan-bo，c黝ⅣG胁晦+DepartmentofLifeSciences，SunYat一5eggUniversity。Guangzhou510275．ChinaCorrespondingauthor：CHANGHong。Email：changh@mailsys．-edu．en【Abstract】0bjectiveToestablishastandardcurvemethodwithmoreaccuracyemployedinfluorescencereal．timePCR(RT．PCR)a8aalternationofthegeneralmethod．nethotisB．actinandKLKllplasmidDNAforquantitativestandardcurvewereconstructedinourstudy，andPlasmidsofB．actinWaSemployedasaintemalcontr01．AfterserialdilutiontheseplasmidwereusedasDNAstandardtoobtainedslope．ExpressionofthesetwogenesinmalignantprostatecancercelllineLNCAPweretestedbyreal．timePCR．andweanalyzedtheRT．PCRresultswithtwodifferentmethodsandcomparedtheiraccuracy．ResultsThestandardscurvesmadefromtheselinearDNAstandardsshowedgoodlinearityfR2=0．991and0．992forp-actinandKLKl1standardsgraphs)，butalsodisplayedadiscrepancyintheirPCRefficiency(B—actin123％andKLKll99％)．鸭ereweredifferentresultsaftertwodifferentstandcurveanalyticalmethod：theexpressionofKLKl1mRNAinLNCAPWaNdownregulatedingeneralstandardcurvemethod．Inthenewanalyticalmethod，howerer，KLKllupregulatedfor4．46．f01d．Andtherewasasignificantdifferencebetweenaplificationefficiencyoftargtgeneandinternalcontrolgene(t=4．829，P<0．c15)．CondusiomComparedwithgeneralstandardcurvemethod．thenewadvancedstandardcurvemethoddescribedhereavoidsanerrorwhichconsidersthereisidenticalamplificationefficiencybetweentargetgeneandinternalreferencegene．ItiSconsideredtobeamorecorrectanalyticalmethodinfluorescencereal—timePCR．【Keywords】Polymerasechainreaction；Nucleicacidamplificationtechniques；Fluorophotometry；Fluorescentdyes；RNA，messenger定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR(real—timePCR，RT—PCR)是通过连续监测荧光信号强弱的变化来实时测定特异性产物的量，即进行“实时”检测，可以在PCR反应仍在指数扩增范围内检测反应作者单位：510275广州。中山大学生命科学学院(彭瑾瑜、吴丁兰、付艳艳、朱彦博、常弘)；广州市第一人民医院泌尿外科(钟惟德)通讯作者：常弘，电子信箱：changh@mail．sysu．edu．ca产物的量。这克服了传统PCR终点法定量PCR产物的不足，使准确定量RNA成为现实¨引。因此，实时荧光定量PCR因其方法操作简便、产出率高，且兼具高敏感度和可信的特异度而广受青睐∞1。实时定量PCR的分析方法有两类：“相对定量”和“绝对定量”口-。绝对定量其实也不是完全的“绝对”，因为无论是何种来源的标本或者无论怎么精细检测，都无法弄清一特定样本中到底有多少拷生堡捡验匡堂苤壹!嫂!生!旦筮!!鲞筮!塑g丛!!坠!丛鲤：』!塑!螋!：!!!：!!：塑垒!贝的“已知模板”。更合适的叫法为“标准曲线定量”。最常用的标准是含靶基因的克隆质粒，分光光度计定量后，序列稀释而得出标准曲线。目前国内大部分研究工作者在进行RT．PCR实验时，只是对内参基因制作标准曲线，目的基因的量则从内参基因的标准曲线上得到。这种方法默认了目的基因与内参基因有相同的扩增效率。然而，实际上并非如此，因为即使目的基因相同，而引物不同或PCR条件不同时，其扩增效率都会存在差异，那就更不用说扩增不同的目的基因了。因此。对于某一目的基因，只要选择的引物不同，或即使引物相同，PCR条件不同，都会制作出不同的标准曲线。本研究针对目前国内常用标准曲线法时存在着的一些不足，在原有的标准曲线法的基础上加以改进，建立了一种更为准确的RT．PCR的标准曲线定量法，使得研究所得的结果更为可信。材料与方法一、新的标准曲线法1．目前国内常用的标准曲线法的数据处理方法是建立标准曲线，直接计算样本中每个基因的模板浓度。计算靶基因相对表达浓度。以p肌动蛋白基因([3-aetin)为内参基因，靶基因相对值=靶基因的模板浓度×(p—actin平均浓度／样本中p．actin的浓度)。这使各样本的B—actin模板浓度一致，从而实现样本间的可比性。以正常组织为参照样本，计算样本中每个靶基因与参照样本对应基因的相对表达值的比值。2．本研究建立的标准曲线法，用软件导入内参基因的标准曲线，将各样品的内参基因循环阈值(Ct值)在其标准曲线上进行表达量定量，并以对照为基准，求出“相对值”。制作各目的基因的标准曲线，将不同样品目的基因的Ct值在目的基因的标准曲线上进行不同样品的目的基因的表达量定量，再用这个定量结果除以刚才得到的“相对值”，对反应使用的RNA量的误差进行校正得到校正后的RNA的定量结果。再以正常样本中的基因表达量为基准，求出病例样品中目的基因mRNA表达量的相对值。二、B—aetin／KLKllmRNA表达相对定量1．B—actin／KLKl1mRNA的SYBRGREENIRT—PCR反应：分别构建B—actin、KLKll的质粒DNA，以B—actin质粒DNA为正常对照。按10倍梯度进行稀释质粒样品，以103～108拷贝／斗l浓度的标准模板系列作为标准品稀释，进行RT—PCR反应，制作标准曲线。荧光定量PCR仪为ABI7900(美国ABI公司)；用荧光染料SYBRGreenI(日本TOYOBO公司)方法PCR扩增。2．B—actin／KLKl1mRNA表达的相对定量：采用国内常用的标准曲线法和本研究建立的标准曲线法分别对B—aetin／KLKl1实时定量PCR的结果进行分析，计算它们之间的差异，以衡量新方法的准确性。三、统计学分析荧光定量PCR结果用SDS2．0软件分析计算ct值和样本模板浓度，并标准化计算样本数据，利用Excle软件进行两样本均数比较的t检验。以P<0．05为差异有统计学意义。结果1．绘制标准曲线：根据B-actin／KLKll的质粒DNA浓度梯度实验结果与ct值关系，用软件SDS2．0输出标准曲线(图1)，图中各标准曲线线性相关性良好，回归系数都大于0．99，符合实验要求。^6u迫厦瞬姆ooV靼膣旨据KLKI／的DNA浓度(拷贝／lnl)o注：a图为KLKll的RT—PCR标准曲线，b图为3-aetin的RT·PCR标准曲线图lKLKll、B—actin的RT—PCR标准曲线2．2种标准曲线法的荧光定量RT．PCR的结果比较：由于扩增效率E=10‘V斜翱一1，所以目的基因虫堡捡堕匿堂盘查!塑!生垒月筮!!鲞筮鱼翅g堑!』!坐丛型：』!塑!鲤!：!些!!：塑!：垒的扩增效率可以由标准曲线的斜率间接代替。从图1可以得知，B．actin和KLKll的标准曲线斜率差异大(B—actin123％，KLKll99％)。常规方法的荧光定量RT—PCR3次重复实验结果显示，KLKl1在恶性前列腺组织细胞(LNCAP)中的表达分别为3439、7061、3987拷贝／斗l。面±s为(4829±l952)拷贝／山。新方法的荧光定量RT—PCR3次重复实验结果显示，KLKll在LNCAP的表达分别为94992、175936、107825拷贝／¨l。面±s为(126251±43504)拷贝／斗l。3．结果分析：使用Excle软件进行统计学分析，方差分析结果，F=0．004019，表明方差不齐(新方法所得结果的标准差：43504．47，常规方法所得结果的标准差：1952．117)。采用t检验(t=4．829，t09，=2．920)，结果得P=0．03689(双侧概率)，故认为用2种不同的处理方法所得到的2组结果差异有统计学意义(尸<0．05)。讨论目前国内大部分研究工作者进行RT—PCR时多采用相对定量法。即样本RNA中的基因数与对照基因相比较，靶基因的Ct值减去对照基因的ct值，得到盯ct。此方法操作简单省时，但是进行相对定量的前提是，首先要假定选定的对照基因在研究样本中的拷贝数和表达水平不发生变化，以及靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致。且PCR扩增效率设定为1，而实际上PCR的扩增效率难以达到l，目的基因和参照基因的扩增效率也不一定相同，这就使定量结果很不准确MJ。本研究使用外参照物的定量PCR的方法，并对标准曲线的分析方法进行改进，比较2种不同的标准曲线法处理得到了不同的结果：(1)常用标准曲线法结果显示，KLKll在LNCAP中有表达是下调的，而实际上已有大量的研究 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ，Scorilas等∞剖运用RT—PCR的方法，分别对64例、74例前列腺癌、前列腺增生样本、正常前列腺组织以及前列腺癌细胞株4组样本进行分析，得出结论KLKll在前列腺癌中的表达比前列腺增生中明显上调；而我们运用改进的标准曲线法得出KLKll在LNCAP中上调4．46倍。(2)从基因的扩增来看，尽管B．actin、KLKll是同时，同一反应条件，并在同一台定量PCR仪上进行扩增的，但是由于选择的引物不同，所扩增的目的基因不同，其扩增效率并不是一致的。从标准曲线图中我们可以得知，B．actin、KLKll的标准曲线斜率分别是：一2．8676、一3．3464。得知KLKll与B—actin基因的扩增效率偏差大，以至于用常规的标准曲线法得到了一个错误的结论。在实时定量中，将目的基因和内参基因都做成标准品，系列稀释后用于构建各自的标准曲线，即可获得各自的扩增斜率。这就避免了因默认目的基因与内参基因有相同的扩增效率的误差而带来的错误结果。但是在实时荧光定量PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果难以对比。此外，用实时荧光定量RT—PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录效率的限制。而在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键p。⋯。参考文献『1]BustinSA．AbsolutequantificationofmRNAusingreal．timel'everlmtranscriptionpolymerasechainreactionassays．JMolEndocrin01．2000．25：169—193．[2]GiuliettiA。OverberghL，ValckxD。eta1．Anoverviewofreal．timequantitativePCR：applicationstoquantifycytokinegeneexpression．Methods，2001．25：386401．[3]deKokJB，RuersTJ，vanMuijenGN，eta1．Real—timequantificationofhumantelomeraserevemetranscriptasemRNAintumorsandhealthytissues．ClinChem，2000．46：313-318．[4]张燕，沈茜．一种快速构建cRNA标准曲线检测基因表达方法的建屯．生物化学与生物物理进展，2003，30：474-477．[5]张弛宇，徐顺高，黄新祥．一种新颖简便的荧光实时RT—PCR相对定量方法的建立．生物化学与生物物理进展，2005，32：883-888．[6]Sc耐1asA，GregorakisAK．mRNAexpressionanalysisofhumankallikrein11(KLKll)maybeusefulinthediscriminationofbenignprostatichyperplasiafromprostatecancerafterneedleprostatebiopsy．BiolChem．2006．387：789-793．[7]NakamuraT，StephanC，ScorilasA，eta1．Quantitativeanalysisofhippostasin／KLKl1geneexpressionincancerousandnoncancerousprostatictissues．Urology，2003，61：1042—1046．[8]NakamuraT，MitsuiS，OkuiA，eta1．Alternativesplicingisoformsofhippostasin(PRSs20／KLKll)inprostatecancercelllines．Prostate。200l。49：72-78．[9]WangX，LiX，CurrieRW，eta1．Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontoquantitateinducedexpressionofinterleukin．1betamRNAinischemicbraintolerance．JNeurosciRes．2000．59：238-246．『10]MoodyA。SellersS，BumsteadN．MeasuringinfectiousbursaldiseasevirusRNAinbloodbymultiplexreal—timequantitativeRT．PCR．JVirolMethods，2000，85：55-64．(收稿日期：2007-06-06)(本文编辑：唐栋)