生殖发育毒性作用及其试验与评价

特殊毒性试验及其评价第一节致突变作用及其试验方法与评价第二节生殖发育毒性作用及其试验与评价第三节致癌作用及其试验方法与评价一、生殖毒性试验与评定二、发育毒性试验与评定第二节生殖发育毒性及其试验与评价方法一、生殖毒性试验与评定外来化合物对生殖过程的损害作用，即生殖毒性。生殖毒性可发生于妊娠期，也可发生于妊娠前期和哺乳期。生殖毒性试验主要研究外来化合物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害及其评定。过去也称为繁殖试验。生殖毒性试验的目的在于了解外源化学物及其代谢产物对机体成年哺乳动物的生殖功能和生育力的影响。多代繁殖试验在整个生命期内接触受试化学物，更符合人类实际生活中长期低剂量接触食品添加剂、微量重金属、农药及环境污染物的情况。（1）试验方法原则生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。一般设三个剂量组，另设对照组。最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。动物接触受试物的方式应参照人类实际接触途径。一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取；也可采用灌胃或胶囊法。利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各16～20只，或雌性16～20只，雄性8～10只。（2）试验方法①三代两窝生殖试验大鼠断奶或出生8周后，开始喂受试物或以其它方式与受试物接触，共进行8～12周，即直到性发育成熟，相当出生后4个月左右。每周至少称体重一次， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 进食量并观察有无中毒症状或死亡。将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比例为1︰1或2︰1，直到受孕或进行3周为止。雌鼠受孕后即单笼饲养，继续接触受试物。交配3周后，如仍未受孕，则停止交配，并进行生殖器官病理学检查。确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片，检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共生出仔鼠两窝，分别为F1a和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8～12周，直到性发育成熟，选出雌雄各16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a，F2a断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b断奶后，将F1b淘汰。F2b交配处理方法与F1b相同。但F2b也可只交配一次，所产仔鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。2．两代一窝和一代一窝生殖试验近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一窝试验法。两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同，但只进行到第二代F2，每代只交配一窝。两代一窝生殖试验在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部生育繁殖过程，可观察下列4个指标：1．受孕率反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况。受孕率=————————×100%妊娠雌性动物数交配雌性动物数（三）观察指标2．正常分娩率反映雌性动物妊娠过程是否受到影响。正常分娩率=————————×100%正常分娩雌性动物数妊娠动物数3．幼仔出生存活率反映雌性动物分娩过程是否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在出生4天内死亡。幼仔出生存活率=———————————×100%出生后4天存活幼仔数分娩时出生幼仔数4．幼仔哺乳成活率反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力。幼仔哺乳成活率=—————————21天断奶幼仔存活数出生后4天幼仔存活数×100%（四）结果判定将试验组动物各项观察指标统计结果与对照组动物进行比较，如试验动物在交配、妊娠、幼仔存活、幼仔发育（哺育）等方面受到影响，则说明受试物对动物繁殖功能有损害作用。二、发育毒性试验与评定1.基本概念发育毒性指出生前经父体和（或）母体接触外源理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用，包括结构畸形、生长迟缓、功能障碍及死亡。能造成发育毒性的物质称为发育毒物。畸形：指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷。致畸性和致畸作用：均指在妊娠期（出生前）接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用。变异：是由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或由于分化改变而引起的中途歧异。2.发育毒性的表现①生长迟缓即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下，较正常的发育过程缓慢。②致畸作用由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。③功能不全或异常即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。④胚胎或胎仔致死作用某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增加。发育毒性研究的目的是通过计数胚胎或胎仔吸收或死亡数，测量胎仔的重量和性别比，检查外观、内脏和骨骼的形态，来识别受试物有无对胚胎或胎仔的致死、致畸或其他毒性作用。最佳联合 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是对成年动物进行染毒并包括子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段。观察期应贯穿一个完整的生命周期，以检测近、远期效应。最常选用的方案为三阶段试验。三段生殖试验图解Ⅰ生育力和早期胚胎发育毒性试验Ⅱ胚体—胎体毒性试验（致畸试验）Ⅲ出生前后发育毒性试验I阶段试验雌雄交配前-受孕-雌性受精-雌性着床期间染毒研究对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、受精、着床前的发育和着床的影响Ⅱ阶段试验从着床到硬腭闭合期间染毒研究对成年雌性生殖功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性*硬腭闭合是破坏了软腭5对肌相交的拱形结构,呈束状沿裂隙边缘附着在硬腭后缘,中断了腭咽部完整的肌环,无法形成“腭咽闭合”,口鼻腔相通,同时也影响咽鼓管功能,导致吸吮、语音、听力等多种功能障碍。Ⅲ阶段试验从着床到幼仔断乳期间对孕（乳）母染毒从着床到子代性成熟的母体生殖毒性（妊娠、分娩和哺乳）和子代的发育毒性（胚胎、胎儿生长发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的生长发育，独立生活能力和性功能成熟）人、大鼠和家兔的致畸作用关键期的比较，短线表示“靶窗”3.发育毒性作用评价发育毒性主要表现为致畸作用，所以发育毒性作用评价主要是评价受试物的致畸作用。通过致畸试验可以确定一种受试物是否具有致畸作用。致畸试验是检查受试外源化学物能否通过妊娠母体引起胚胎毒性或后代畸形的动物试验。胚胎在器官形成期，可因受到化学物或放射性物质的作用，使细胞分化、器官形成和正常发育受到阻滞，以致出现胎仔器官的器质性缺陷而呈现畸形。1.母体效应:受试物对母体产生了损害作用，从而影响了正常妊娠，而不是对胚胎的直接损害。2.胚胎效应:受试物对胚胎的直接损害作用。3.出生前胎儿效应:出生胎儿出现外表或内脏畸形。4.出生后效应:引起子代的生理功能或生理结构的缺陷。如后天生长发育或生殖功能受影响。致畸作用包括：*受试动物接触外源化学物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予，雌鼠妊娠的第7～15天染毒，常用灌胃方式。试验期间每2～3天称取孕鼠体重。通过体重变化可观察受试动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕鼠的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。传统常规致畸试验（1）动物选择（2）剂量分组（3）动物交配处理（4）胎仔检查（5）数据处理（6）结果评定（1）动物选择致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则（食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉）外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数；而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。（2）剂量分组致畸试验中剂量分组的一般原则是一方面要求出最大无作用剂量，以及引起致畸的阈剂量，同时还要保持母体生育能力，不致母体大批流产和过多胚胎死亡，也应避免较多母体死亡。高剂量组：LD50的1/5或1/3。原则是引起母体轻度中毒，死亡率<10%;低剂量组：LD50的1/30～1/100。原则是不引起母体的任何中毒症状。中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。原则是只引起母体极轻微毒性反应。或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量。*（3）动物交配处理将性成熟雌雄动物按雌雄l︰1或2︰1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。试验期间每2～3天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。（4）胎仔检查鼠类有食畸形胎仔的习性，应在预期分娩前1d～2d处死母鼠进行检查。一般大鼠在受孕后第19～20d，小鼠第18～19d。剖检前称量并记录母鼠最终体重。常采用颈椎脱臼法或断头处死法处死动物。从腹中线剖腹，暴露子宫和卵巢，为胎仔检查做准备。活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。表7-3常见的外观畸形 头部 躯干 四肢 头部 躯干 四肢 无脑脑鼓出小头颜面裂开眼 脊柱裂脊髓鼓出胸骨裂腹裂锁肛 前或后肢形成不全多指(趾)少指(趾)畸形指(趾)并指(趾) 单鼻孔无耳无鄂或小鄂兔唇无颌或小颌 卷尾短尾无尾 短指(趾)表7-4常见的内脏畸形 头部 胸部 腹部 嗅球发育不全无脑脑室扩张脑室积液无眼球小眼球鼻中隔缺损 左心位右大动脉弓心房(室)中隔缺陷食管闭锁肺发育不全肺叶融合膈疝 肝分叶异常无肾肾积水马蹄肾或不对称移位输尿管积水无膀胱无睾丸或无卵巢、子宫，睾丸发育不全(单侧或双侧)表7-5常见的骨骼畸形 部位 畸形及特征 颅骨枕骨颈椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨尾椎骨盘骨 缺损、骨化迟缓(表现为囟门过大)缺损、缺失缺损、椎弓不连续、骨化迟缓缺损或消失、骨化迟缓、点状或不到正常的1/2多肋(正常大、小鼠有13对肋骨)、少肋、短肋、分叉肋、波状肋缺失、分裂变形多骨、缺失缺失缺失、椎弓不连续、融合表7-6致畸试验记录内容 动物交配给受试物期 解剖检查时 胎仔检查 动物编号动物种、品系交配时周龄确认受孕临床症状进食进水量受试物及溶剂剂量给样途径给样期限 母体解剖所见卵巢重量黄体数着床数胎盘重量胎仔子宫内位置死胎数活胎数胎仔重 体表检查骨骼检查内脏检查（5）数据处理在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一个畸形；如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。计算时还要对剂量效应（反应）关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照组结果进行比较。①活产幼仔平均畸形出现数：即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。活产幼仔平均畸形出现数=—————————畸形总数活产幼仔总数②畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。出现畸形的胎仔总数畸胎出现率=———————————×100%活产胎仔总数③母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算。出现畸胎的母体数母体畸胎出现率=———————————×100%妊娠母体数以上结果，经统计学处理后，若试验组母体畸胎出现率高于对照组，活胎仔畸形出现率显著高于对照组，而且畸形的出现具有剂量-效应关系时，才能判定外源化学物对受试动物具有致畸作用。（6）结果判定致畸结果分析母体LD50致畸指数=最小致畸量评价：致畸指数<10,为不致畸；致畸指数10～100，为致畸物；致畸指数>100,为强致畸物。致畸危险指数=最大不致畸剂量/最大可能摄入量评价：致畸危险指数>300,说明致畸危险性小；致畸危险指数100～300，为中等致畸危险性；致畸危险指数<100,为致畸危险性较大。*（7）致畸物分级标准 级别 分级依据 对人类危险性 1 已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷 已证实对人致畸 2A 对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系 对人可能致畸 2B 动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料 对人可能致畸 3 尚无结论性肯定致畸证据或资料不足 可以认为对人无致畸作用，但应继续研究 4 动物试验阴性，人群调查结果未发现致畸 对人无致畸作用*硬腭闭合是破坏了软腭5对肌相交的拱形结构,呈束状沿裂隙边缘附着在硬腭后缘,中断了腭咽部完整的肌环,无法形成“腭咽闭合”,口鼻腔相通,同时也影响咽鼓管功能,导致吸吮、语音、听力等多种功能障碍。***