显微注射实验操作

显微注射实验操作 显微注射实验操作 Miffy (2011-01-25 14:11:09)    　　（1）导入DNA的制备：显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。 　　DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。 　　导入DNA的制备程序如下： 　　1） 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。 　　2） 为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。 　　3） 切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。 　　4） 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。 　　5） -200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。 　　6） 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。 　　7） 按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。 　　8） 注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制 　　9） 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度 　　10） 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/?l. 　　（2） 器械准备 　　[注射针的制作] 　　注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。 　　[持卵管制作] 　　为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。 　　[洗卵管制作] 　　1） 点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。 　　2） 当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200?l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。 　　3） 为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。 　　4） 解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。 　　[移卵管的制作] 　　用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150?m(150-160?m)，直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。管口要平且要钝化。 　　[凹玻片的准备] 　　必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下： 　　1） 在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。 　　2） 覆盖矿物油的作用：防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态； 　　固定M2溶液液滴。 　　3） 从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓，并且保证受精卵有足够空间自由移动，用持卵器将卵汇聚到一起，移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。 　　[显微注射设备] 　　显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测，显微镜两侧各置一台显微操作仪，一侧接持卵管，另一侧接注射针，可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器，通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后，进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统（major instruments.co.Ltd）等，具体操作程序按其说明书严格进行。 　　（3）注射针内DNA的装载 　　把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中，溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端，距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。 　　（4）受精卵的显微注射 　　受精卵的显微注射过程相对简单，制作大量样品过程中，为保证显微注射量的一致性，必须通过大量反复有效的练习才可以成功。 　　1） 置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。 　　2） 调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。 　　3） 挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。 　　4） 如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。 　　5） 移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。 　　6） 对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。 　　7） 维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。 　　8） 保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下： 　　① 注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。 　　② 一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。 　　③ 注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。 　　④ 若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。 　　9） 用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。 　　5．受精卵的输卵管转移 　　（1）受精卵的输卵管注射 　　1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。 　　2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。 　　4） 用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。 　　5） 手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。 　　6） 轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。 　　7） 用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。 　　8） 一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。 　　9） 在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。 　　10） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。 　　10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。 　　11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。 　　12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。 　　（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。 　　处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。 　　手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。