淀粉酶活力的测定 一、目的 学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。 二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使黄色3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用
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浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 萌发的小麦种子（芽长约1cm）或相关含有淀粉酶的有机体 注：【本实验以萌发的小麦种子为例】 2．仪器 （1）离心机 （2）离心管 （3）研钵 （4）电炉 （5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1 （6）恒温水浴 （7）20mL具塞刻度试管×13 （8）试管架 （9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 （10）分光光度计 3．试剂（均为
分析
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纯） （1） 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 （2） 3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。 （3） 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。 （4） 1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 四、操作步骤 1．麦芽糖标准曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂： 表1 麦芽糖标准曲线制作 麦芽糖标准液（mL） 蒸馏水（mL） 麦芽糖含量（mg） 3,5-二硝基水杨酸（mL） 1 0 2.0 0 2.0 2 0.2 1.8 0.2 2.0 3 0.6 1.4 0.6 2.0 4 1.0 1.0 1.0 2.0 5 1.4 0.6 1.4 2.0 6 1.8 0.2 1.8 2.0 7 2.0 0 2.0 2.0 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2．淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。 3．酶活力的测定 取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。 表2 酶活力测定取样表 操 作 项 目 α‑淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定 编号 Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6 淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min，冷却 淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0 3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0 0 预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min 3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0 将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。 五、结果计算 计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力Aa，淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖含量毫克数（mg/g・min）表示。 Aa=Ca・Vt・Fw・t・V1・(18-1) 计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。 At=Ct・Vt・Fw・t・V1 β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力 注： ① A：淀粉酶活性，Aa为α-淀粉酶活性，At为淀粉酶总活性，主要是α，β-淀粉酶的活性； ② Ca：α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量； ③ Ct：α，β-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量； ④ V1：显色所用酶液体积； ⑤ t：酶作用时间（min）； ⑥ Vt：样品稀释液总体积（α-淀粉酶为50ml，α+β-淀粉酶为500ml）； ⑦ Fw：样品鲜重。
浙公网安备 33021202002483