基因工程工具酶

nullnull 基 因 工 程 工 具 酶nullnull基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。 本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。 null基因工程工具酶 限制性内切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 DNA连接酶null限制性核酸内切酶(restriction enzyme)细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现限制性内切酶的分类限制性内切酶的命名限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的性质及切割特点限制性内切酶的反应条件限制性内切酶的应用null细菌的限制—修饰作用和限制性内切酶的发现 1、细胞的限制—修饰作用 ①50年代后Luria和Human(1952) Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象： Phageλ（k） 感染E.coli k不感染E .coli B【E .coli B 限制 λ（k）】 ②仍有少量λ(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对λ(K)进行了修饰。E.coli B修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰。nullnull2、细菌的限制—修饰系统 ①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。 ②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。 3、限制性内切酶的发现 ①1968年Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coli K中分离到另一限制性的内切酶。 1970年Smith (美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶Ⅱ。 ②限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。 ③1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。nullnull 限制性内切酶的分类： 目前已发现的限制酶有三大类：null限制性内切酶的命名EcoR IEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。null限制性内切酶的活性单位 50μl Buffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。（buffer：pH=8.0，50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl2 ，1mmol/L DTT或巯基乙醇，100μg BSA/ml）限制性内切酶的性质及切割特点 1、裂解产物均具有3′－羟基和5′－磷酸残基，5′P-N N…NN…NN-OH 3′。 2、识别序列及切点的高度专一。null3、有三种不同裂解方式： a. 平齐未端环形DNA:如 Hind Ⅲ、HpaⅡ、SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ。 b. 5′粘性末端5َ′G 5’A A T T C 3′ 3′C T T A A 5’ G 5َ′ 如EcolⅠc. 3′粘性末端如 PstⅠ5َ′ C T G C A G 3′ 3′ G A C G T C 5َ′ 同裂酶(isoschizomer)同裂酶(isoschizomer)1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种 或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstII CCGC GG SacII CCGC GG SmaI CCC GGG XmaI C CCGGG同 尾 酶同 尾 酶如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C null限制性内切酶的反应条件 1、底物 DNA a. DNA 纯度: RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。 b. DNA浓度: 〔DNA〕过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 在37℃下 15h 而 1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 在37℃下 1h c. 识别位点及邻近位点特异性序列 由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如： ①λDNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。 ②pBR322 DNA 有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。 ③XmaⅢ切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割 d. DNA二级/三级结构 超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。 e. 提取时混入杂质可改变识别特异性 如： 高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。null 2、反应系统因素 a. 缓冲液（无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近buffer） b. 金属离子 ① 如Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）则特异性改变。 ② 离子浓度，合适→激发酶活；不合适→抑制酶活。 c. 牛血清蛋白(BSA) BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65℃/5min除去。 e. 水质：无离子水，ddH2O，双蒸水。 3、星活性 识别特异性放宽，如GAATTC→AATT，为ECORI★。 造成星活性参数： 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二介阳离子，12%乙醇。 星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。nullLane 1:PUC 19质粒DNA  Lane 2:经EcoR I 酶切的酶切产物  Lane 3:质粒经Pvu II 酶切产物 Lane 4:质粒经Taq酶切产物质物 M:  Axygen 1Kb DNA LadderLane 1:质粒DNA    Lane 2:经EcoR I 酶切的 酶切产物 M:  Axygen 1Kb DNA Laddernull限制性内切酶的应用1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒3、构建物理图谱4、DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析7、基因定位，DNA同源性研究。null 1、大多数 E.coli 中含有两种可甲基化DNA的酶 dam 甲基化酶 Dcm 甲基化酶 dam 可将甲基引入 GATC 序列中的腺嘌呤N6位。 dcm 甲基化酶可将甲基引入 CCA/TGG 序列中的胞嘧啶残基甲基化。 甲基化酶 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同null2、制备细菌DNA时，应注意DNA在原细胞中的被修饰，选用无限制系统细菌(E.coli)或选用甲基化不敏感的同裂酶。3、用甲基化酶进行甲基化 a.对大多数Ⅱ型限制酶来说，都已分离出相应的甲基化酶(methylase)。 b.甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)已做为一种商品广泛应用。null c.甲基化酶的用途 1) 保护某些切点不被切割；对甲基化敏感的限制性内切酶 限制酶 　　　识别序列* 　　 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm BclⅠ TGATCA dam ClaⅠ GATCGAT dam EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm HphⅠ GGTGATC dam MboⅠ GATC dam NruⅠ GATCGCGA dam Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm SauFⅠ CC(A/T)GG dcm StuⅠ AGGCCTGG dcm TagⅠ GATCGA dam XbaⅠ TCTAGATC dam *下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列null 2) 配合连接子的使用，建立DNA片段粘性末端； 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切null ① DPNI是唯一识别GAm6TC的限制酶，而不降解GATC。 ② M.Taq1可使TCGA甲基化TCGAm6 TCGA + TCGA 或DNA中的 TCGATCGA序列。连接酶TCGATCGA M.Taql TCGAm6TCGAm6DPNI切点 3) 构建新的酶切位点 如： ③null4)封闭DNA链中某些识别位点，交叉保护通过修饰封闭多余的限制性切点。 如：一段DNA有二个BamHI识别位点，其中一个BamHI与修饰位点重叠 可通过修饰将此位点封闭。null  DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3 — OH末端聚合DNA链的一类酶。 特点： ①需模板(DNA或RNA)； ②需引物； ③聚合方向5′→3′； ④同时具有3′→5′和外切5′→3′外切作用。DNA聚合酶null种类： 目前已发现的和已开发的此类酶有以下几种： ①DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli) ②Klenow片段(E.coli) ③T４DNA聚合酶(T４Phage感染的E.coli) ④T７DNA聚合酶(T７Phage感染的E.coli) ⑤修饰的T７DNA聚合酶(测序酶) ⑥TaqDNA聚合酶(耐热)(Thermusaqraticus) ⑦DNA末端转移酶(小牛胸腺) ⑧反转录酶(依赖RNA)聚合酶 ①-⑥为依赖DNA的DNA聚合酶 ⑦为不依赖DNA的DNA聚合酶。 ⑧为依赖RNA的DNA聚合酶。null活性与用途 1、 E.coli DNA聚合酶I（polI） 来源：E.coli，由染色体DNA基因编码。商品上用的此酶来源于Phage NM964整合的溶源性E.coli。结构：一条多肽链，MW = 109，000 D。具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK)聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响nullE.coli DNA PolI 的延续性 DNA模板-引物类型 反应条件 延续性(碱基数) 切口 ColE1 37°C, 低盐 8 缺口 ColE1 37°C, 低盐 47 切口/缺口胸腺DNA 37°C, 低盐 24 poly) 5°C, 低盐 14 poly d(AT d(AT) 37°C, 低盐 188 poly d(AT) 5°C, 高盐 3用 途用 途1） 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段 2. klenow(E.coli) 2. klenow(E.coli) 来源：E.coli DNA PolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970) DNApolymerasel枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C 端 76，000 d Klenow活性 ５′→ ３′聚合 ３′→ 5′外切＋N 端 36，000 5′→３′外切 Jacobsen(1974),Joyce 和 Grindley,(1983)克隆此大片段。null用途： ①填补限制酶的5′-粘性末端为平齐末端：５′… C C ３′… G G A A T T５′… C C T T A A ３′ ３′ … G G A A T T ５′ ②末端标记 a. 平齐末端中用（α-32p) dNTP , 底物可标记 ３′末端 b. 对于３′粘性末端５′… A A ３′ ３′ … TT C C G G ５′５′… A A G G C C ３′ ３′ … T T C C G G ５′Klenow 在无底物时只进行３′— ５′外切；有底物存在时则聚合。 以上也称作交换标记，但此作用不如T4DNA聚合酶。null③在cDNA克隆中合成cDNA第二链。 ④DNA测序—末端终止法(Sanger 1977) ⑤通过3′→5′外切，平齐限制酶切产生的3′粘性末端(现在多用T４DNA polymersase) ⑥最早用于PCR聚合反应，现已用Taq酶取代。null3、T4DNA聚合酶 来源： T4Phage感染的E.coli结构：MW=114000d活性：① 5′→3′聚合反应；② 3′→5′外切活性对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍。null用途：补齐或末端标记， 同于Klenow② 3′-粘性末端的标记制备DNA探针,同 Klenow 末端标记b。③延伸结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物。① 填补或标记限制酶切后产生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端。null4、T7DNA聚合酶（测序酶） 来源：T7Phage感染的E.coli 结构：由2个蛋白亚基组成：a.T7phage gene5蛋白、外切 3→5′Ｎ末端 b. 宿主硫氧蛋白活性：5′→3′聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成 的DNA链长。故在DNA测序中有很大优越性 3′→5′外切活力(T７Phage gene5编码)是DNA 聚合酶I的 1000倍。null用途： ① 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列② 用填补或交换反应快速进行末端标记。③与T４DNApol一样，平齐粘性末端。④定点突变中互补链的合成。null5、修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶)来源：天然 T７DNAPolymerase 经修饰处理。结构：同T７聚合酶，用还原剂、分子氧、低浓度 Fe２＋与酶保温几天，可使PhageT7 gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中心失活(O- 修饰)。即：5′→3′聚合酶作用提高，持续性长。3′→ 5′外切作用下降99%以上。 已用基因工程方法生产出改进的测序酶2.0其已完全无外切酶活性。用途：①DNA序列分析，可读出较长的序列。②聚合能力高，可有效地将低水平dNTP(＜0.1μmol/L)掺入到被标记底物中。 ③填补末端标记5′-粘性末端的3′端。null6、Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus) 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：单亚基MW=94000d。活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切。用途：① PCR反应；② 测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。nullnullnull7、末端转移酶(不依赖模板的DNA聚合酶)来源：是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。 结构：MW=60，000d.活性： ① 催化dNTP掺入DNA 3′-羟末端，形成同聚物末端② 反应不需模板DNA，需Co2+。用途：① 克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。② 末端标记null切平反应和补平反应 null四种不同补平反应5’-GGATCC-3’ BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 3’-CCTAG G-5’ dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP 5’-GGATC 5’-GG 5’-GGA 5’-GGAT 3’-CCTAG 3’-CCTAG 3’-CCTAG 3’-CCTAG GATCC-3’ GATCC-3’ GATCC-3’ GATCC-3’ CTAGG-5’ GG-5’ AGG-5’ TAGG-5’ I S1 S1 S1 5’-GG CC-3’ 5’-GGA TCC-3’ 5’-GGAT ATCC-3’ 3’-CC GG-5’ 3’-CCT AGG-5’ 3’-CCTA TAGG-5’ II III Ⅳ null8、反转录酶 来源：商品反转录酶有两种①来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。②来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli。结构和活性：合成长cDNA M-MLV优于AMV.均无3′→5′核酸外切酶活性。用途：①合成cDNA克隆至载体中；②粘性末端补平、标记；③双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。nullRNA 聚合酶1、RNA聚合酶 来源：商品酶为①T7、T3RNA 聚合酶在E.coli中的克隆表达。②T7、T3、RNA 聚合酶在酵母中的克隆表达。③E.coli RNA聚合酶。酶活：DNA指导下的RNA合成，结合于启动子部位。转录无意义链(一)产生与有意义链相似(以U代替模板中T)的链。转录链为无意义链，负链(-)。不转录链为有意义链，正链(+)2、多聚(A)聚合酶(E.coli)  结构：MW=58000，一条多肽链。活性：催化RNA 3′末端加AMP。用途：①在RNA 3′末端加Poly(A)，以合成cDNA(Gethin等.1980)。②用32PATP标记RNA 3′末端。null3、鸟苷酸转移酶(Guanylytransferase)来源：牛痘病毒。活性：催化GTP转移GMP至5’PPP－—RNA的 5′末端。5’PPP-RNA + GTP 或5’PP――RNA。。ppiG5’PPP5’N――RNA用途：体外转录RNA产物加帽。null磷酸激酶和磷酸酶 磷酸激酶和磷酸酶分别催化核酸 5-OH 加 P 和去除 5′- P ： 5′p A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C p 5′ 5′HO A T T A G C ……… C C G T A A T C G ……… G G C OH 5′多核苷酸激酶磷酸甲酯酶 Phosphomonoesterase 应用：① 标记 5-末端。② 基因重组中，酶切后先去掉5′P，以防止自身重组(连接)，以提 高重组效率。③ 重组前磷酸化。商品酶：①T4多核苷酸激酶T4Polynucleotide kinase②碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 牛肠碱性磷酸酶(BAP)大肠杆菌磷酸酶(ClP)null磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性 磷酸激酶的交换反应null核酸酶外切核酸酶内切核酸酶 核糖核酸酶 nullds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口null 外切核酸酶单链 5′→ 3′和 3′→ 5′外切核酸酶。外切核酸酶Ⅶ(exovⅦ) 。＋ NMP应用：①基因组DNA中内含子的位置作图。②切除通过Poly(dA-dT)加尾插入到质粒载体中的DNA片段。null双链5′→ 3′末端外切酶 1. 入Phage外切核酸酶(入exo) 降解 5′-P的核苷酸，不降解 5′-OH核苷酸。如降解 PNNNN……,不降解 HONNN…应用：① 在双脱氧测序时，将dsDNA→ssDNA。② 平齐5′-粘性末端，便于末端转移酶加尾。2. T7 基因6外切核酸酶应用：降解5′-P DNA末端，也可降解5′-OH末端,与其它酶一起使DNA链变短。双链3′→5′外切酶外切核酸酶Ⅲ(exoⅢ)＋ NMP应用：①制备链特异性探针。②制备SSDNA用于双脱氧测序做为模板。null内切核酸酶Bal 核酸酶 同时具有内切酶活性的外切酶，也可降解RNA。既具有单链特异性，同时具有 双链特异性。Bal31 活性需Ca2+，也需Mg2+，反应液中加入EDTA，便可终止Ca2+ 活性，而不改变Mg2+ 浓度，所以在终止Bal31下不影响限制性酶活性。＋dNMP 或 rNMP＋S1 核酸酶对 SSDNA 有高度特异性。绿豆核酸酶与S1类似null核酸酶S1活性 null核酸酶Bal31的活性nullDNaseⅠ 1、来源： 牛胰2、结构：MW=37KD 为-糖蛋白3、活性：①水解位点：优先水解嘧啶5’P与一个核苷核３’的磷酸二酯键位点。A P G P C P T P C P G P T P A OH ↑ ↑ ↑ ↑②Mg2+存在下，随机切割DNA双链中的任一条。Mn2+存在时，切割双链。无RNase活性的DNaseⅠ处理：DNaseⅠ/0.1mol碘乙酸，0.15mol乙酸钠(pH5.3)55℃加热40min，+1molCaCl2至5mmol。4、用途：①切口平移时切口产生。②裂解双链DNA(Mn2+）。nullnull核糖核酸酶RNaseA 1、来源： 牛胰2、活性：RNA内切酶 无DNase的Rnase处理：用TE(Tris-HCl)溶解后(1mg/ml)煮沸10-30min，分小份存－20℃。3、应用：抑制：人类胚胎特异性抑制剂 Rnasin，钒氧核苷酸复合物。用蛋白酶处理可除去RNaseA。① 在制备DNA中除去RNA。② RNA测序。③ 除去DNA-RNA杂交链中的RNA。nullRNase H来源：E.coli活性：RNA 内切酶降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。应用：降解RNA-DNA中的mRNA，利于cDNA第二链合成。RAase T1来源：米曲霉活性：内切酶，特异降解G残基后的５’-磷酸二酯键。应用：RNA 测序 中间产物无环化的单核苷酸。null连接酶T4DNA连接酶 连接DNA末端，可连接平齐末端，所需酶是粘性末端连接的10-100倍。酶活单位用Weiss1Weiss单位=60个粘性末端单位E.coli连接酶活性：与 T4DNA 连接酶同，但不连接平齐末端。在非平端连接时，可代替 T4DNALigase 。酶活单位用Modrich-lehman1Modrich-lehman=6个WeissRNA 连接酶T4RNA 连接酶活性：在ATP存在下，可催化单链DNA或RNA连接。应用：① RNA3′末端放射性标记。② 增加 T4DNA ligase 的平端连接活性。练 习 题练 习 题1. 一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 将各限制酶位点绘制在DNA分子上。   2. 另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb   null3.下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRI—PstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的DNA不能除去 4. 假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？null5. 现有一研究者打算将一EcoRI DNA片段克隆到另一个DNA分子的BamHI位点以便DNA扩增，但扩增后的DNA分子又可用BamHI限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。 6. 一研究生要将一质粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一质粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此实验？  null7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示： 已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因编码区，现要将3kb的BamHI片段克隆到另一表达载体pB的BamHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？null8. 为了检测绿豆核酸酶对5’-端突起的单链DNA切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入pBR322的Apr基因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有Apr基因外，还含有Tcr基因)。ScaI XbaI片段 Tcr（当有外源DNA插入， 该基因失活） pBR322 AprTcrnull9. 某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI； Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRInull10. 一DNA分子中有一个SmaI识别位点(CCCGGG), 现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验? EcoRI BamHI HindIII BamHI SmaI SacI EcoRI PstI BamHI + E B P E SI Sm B H    11. 一研究者想在下列三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示, 要求获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列, 他应如何设计实验分离到所需的DNA分子? null  12. 如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种, 或由第一种变为第三种? GATC GATATC GATCGATC； TCGA TCGCGA TCGCGCGCGA； Sau3AI EcoRV ClaI TaqI REII BssHI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI，HaeII   13.下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一BamHI位点, 一研究者想用体外缺失或插入的办法使BamHI位点消除, 并获得如图所示的重组质粒，他应如何设计此实验? 假定密码子的增减对基因的抗性无任何影响。 Tcr