里氏木霉（Trichoderma_reesei）产纤维素酶液态发酵条件的研究

里氏木霉(Trichoderma reesei)产纤维素酶液态发酵条件的研究 胡彩静 代淑梅 李秋园 (唐山市冀 东溶剂有限公司生物技术研发 中心 ，唐山 ，063030) 摘 要 对纤维素酶高产菌株里 氏木霉(Trichoderma reesei)ZU一03产 纤维素酶 的液态发酵条件 进行 了研 究，确 定 了适 宜的培 养基配方和最佳发酵工 艺条件 。最优培养基 配方及发 酵条件为 ：培养基 起始 pH 4．5，C 8：1，纸 浆浓度 30 g ，培养温度 28℃，接种量 10％(v )，摇床转速 150 r／min，培养时间4 d。在此优化发酵条件下，摇 瓶发 酵液 中的纤维素酶 FPA活力达 l1．67 IU／inL，比初始 发酵条件 下酶 活力提 高近 3倍 。 同样在 此优 化条件 下还进 行 了5 rn0罐 的中试 ，FPA活力达 8．62 Iu L。 关键词 里 氏木霉 ，纤维素酶 ，发酵条件 ，优化 纤维素酶的来源十分广泛 ，其 中来 自微生物的有 真菌 、细菌，还有放线菌 。迄今为止 ，产纤维素酶能力 最强的微生物是木霉属的菌种 ，最常用的是里 氏木霉 (T．reesei)。目前 ，我国对里氏木霉产酶的研究报道 较多 ，许多学者对影响里 氏木霉液态深层发酵产酶的 诸多条件进行了深入的研究，并不同程度地提高了酶 活[卜6l。 本研究选用纤维素酶高产菌株里氏木霉 ZU一03， 通过对培养基中碳源组成等培养条件的优化，来提高 纤维素酶的产率，降低产酶成 本，并将优化结果扩大 到中试水平。 1 实验材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1．1 实验材料 1．1．1 菌 种 里氏木霉 (Trichoderma reesei)ZU一03，来 自美国 普渡大学 (Purdue University)可再生 资源 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 实验 室 ，为纤维素酶生产菌种。 将菌种移接到 PDA斜面上 ，30℃培养 7 d后 ，于 4℃冰箱中保存备用。斜面菌种每月转接 1次。 1．1．2 斜面种子培养基 PDA培养基 ：马铃 薯去皮后，切碎 煮沸 30 min， 然后用双层纱布过滤 ，滤液内加入葡萄糖及琼脂，融 化后补充水至要求体积。 1．1．3 液体种子培养基 葡萄糖 10 g／L，蛋 白胨 1 g／L，营养盐 溶液 50 mL／L，Mandels微量元素盐溶液 1 mL／L，1．0 mol／L 醋酸缓 冲 液 调 pH 4．8。营 养盐 溶 液 组 成 (g／L)： (NH4)2SO4 14，KH2P04 20，CaCI2。2H2O 4，MgSO4 第 一作 者：学士 ，工程 师。 收稿 日期 ：2005—05—04，改 回日期 ：2005 08—10 1．5。 1．1．4 摇瓶产酶培养基 葡萄糖 5 g／L，蛋 白胨 1 g／L，Mandels微量元素 盐溶液 1．0 mL／L，吐温 80 1．0 mL／L，用 H2SO4调 pH。产酶用碳源 品种及浓度根据实验需 要而定，营 养盐的加量按一定的 C／N加入。营养盐与微量元素 盐溶液的组成同种子培养基。 上述培养基在 121℃下湿热灭菌 30 min。 1．1．5 5 m3通气罐产酶培养基 使用外购的废纸浆 ，加水在配料槽配成固形物为 3％的发酵液 ，用 H2S04中和至 pH 4．5。营养盐的加 量按 C =8：1加入。营养盐与微量元 素盐溶液 的 组成同上。 上述培养基在 121℃下湿热灭菌 60 rain。 1．2 实验 方法 1．2．1 种 子制 备 在装有 50 mL液体种子培养基的 250 mL三角 瓶中，用孢子接种器在里氏木霉斜面种子上挑取 1环 孢子，在 30℃，150 r／min摇床上培养 2 d，作为液体 种子。 1．2．2 摇瓶发酵培养 按一定的接种量接入盛有 100 mL产酶培养 基 的500 mL三角瓶中，在回转式摇床中培养 2～7 d， 每个做 2个平行样 。 1．2．3 5m 通气罐发酵培养 1．2．3．1 发酵流程 斜面菌种一 液体菌种一种子罐一发酵罐一发酵 液一 粗酶 液一 浓 缩提 纯 1．2．3．2 5m 通气罐发酵 将培养 48 h的液体种子，按 10％种量接种于发 酵培养基中，装液量为通气罐容积的 70％，于 28℃培 Q 箜蔓 !鲞蔓!塑 篁蔓 ! 塑2f 45 维普资讯 http://www.cqvip.com F()0D AND FERMENTATION INDUSTRIES 养 ，控制通气量为 0．2～1 vvm，用调频装置调整转速 为 120～150 r／min，并通过流加 2 mol／L NI-hOH控 制发酵液 pH大于 4．0；通过控制风量和转速 ，保持适 当的溶氧饱和度 ，并通过流加消泡剂控制发酵过程 中 形成的泡沫。发酵过程 中每 4 h 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 1次各项生化 指标 ，包括 还原糖浓度 、菌体生长情况 、pH值 、酶活 等。当发酵液 pH不再下降或回升 ，并伴随发酵液粘 度明显降低 ，作 为终止发酵 的依据。发酵结束时 ，发 酵液经板框分离 ，滤液用泵打至超滤浓缩 岗位进行浓 缩提纯。 1．2．4 酶液制备 将所得发酵液经 3 500 r／min离心约 10 min，除 去固形物和菌体后 ，上清液即为粗酶液。 1．2．5 总糖 测 定 用 3，5一二硝基水杨酸法(DNS法)【 。 1．2．6 滤纸酶活(FPA)测定 按照 IUPAC推荐 的国际 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 方法测定 ，以 IU／ mL表示。1个滤纸酶活力 国际单位 (FPIU)等于酶 促反应中每小时生成 1．0 t~mol葡萄糖的酶量。 1．2．7 羧甲基纤维素酶活(CMC)测定 在试管中加入 1 mL用 0．05 mol／l醋酸缓冲液 配置的 1％浓度的羧 甲基纤维素钠 ，再加入 0．5 mL 适当稀释的酶液 ，于 50℃水浴 中反应 10 min。加入 3 mL DNS试剂 ，煮沸 8 min(从水沸腾算起 )，冷却后加 水至 25 mL，充分摇匀 ，在 540 nm处测定吸光值。根 据事先做 出的葡萄糖标准 曲线算出反应生成 的糖量 (mg)，并计算酶活力 ： CMC(U／mL)：堑 塑 V V为所吸样品的体积(mL)。 葡萄糖标准曲线的制作同 1．2．5。 2 结果与讨论 2．1 接种量对产酶的影响 以不同量的液体种子接种于 1％木糖渣产酶液 ， 于 30~C培养 ，结果见表 1。结果表明 ，接种量 以 10％ 最好 ，此时产生的纤维素酶活力最高。 表 1 不 同接种量对产酶 的影响 2．2 培养温度对产酶的影响 46 1 2—005Vo1．31 No—．9(Total 213) 按 10％接种量接种里 氏木霉液体 种子后 ，分别 选用 25、28、31℃及 35℃ 四个温度对 1％木糖渣产酶 培养基进行产酶培养 ，结果见表 2。从表 2结果可 以 发现 ，纤 维素 酶 的产生 与培养 温度 有较 大 的关 系 ， 28℃是产酶的最佳温度 ；温度低时 ，产酶周期延长。 但 28℃并不是 菌体生长的最佳温度，里 氏木霉最佳 的生长温度为 30～31℃。 表 2 不同培养温度对里 氏木霉生产纤维素酶 的影响 2．3 培养基起始 pit对产酶的影响 用 H2SO4调节 培养 基 的初始 pH分 别 为 4．0、 4．5、4．8(里 氏木霉产纤维 素酶 的最佳 pH[ ])、5．0、 5．5、6．0，在 28℃进行产酶实验 ，结果见表 3。 表 3 培养基初始 pH对里氏木霉产纤维素酶的影响 由表 3可见 ，在初始 pH4．0～5．5范围之 内，里 氏木霉产纤维素酶较为稳定 ，但 pH较低时产酶周期 延长 ，当 pH为 4．5时产酶最高。 2．4 葡萄糖浓度对产酶的影响 在以葡萄糖和 1％木糖渣作为碳源 的情况下 ，葡 萄糖对里 氏木霉产酶影响如图 1。不 同浓度 的葡萄 糖在培养一开始时加入。实验结果表明 ，葡萄糖对纤 维素酶 的合成有较强的阻遏作用 ，而且随着葡萄糖浓 度的增加，这种作用更加强烈 ，当葡萄糖浓度升高到 5％时 ，酶活基本 没有 ，说 明产生 了明显 的葡萄糖效 应 ，阻遏了酶的合成 。 J 旱 ] 、 蛏 罐 rJ 至 rJ 链 发酵时间，l1 图 1 不 同浓度 葡萄糖对 产酶的影 响 维普资讯 http://www.cqvip.com 2．5 不同碳氮 比对产酶的影响 C／N对酶的产生有较 大的影 响 J，本实验 以质 量浓度为 1．O％的木糖渣为碳源 ，通过改变营养盐的 浓度 ，从而达到改变 C／N 比，结果列 于表 4。从表 4 结果可以看 出，C／N 对纤 维素酶的产生有较 大的影 响，随着 C／N的增加 ，虽然最 高产 酶时间推迟 ，但纤 维素酶活却随之增高 ，当 C／N为 8：1时 ，纤维素酶活 达到高峰，为 5．94 IU／mL。但 当 C／N超过 8：1后 ， 纤维素酶的活力则开始逐渐下降。 表 4 不 同 C／N对纤维素酶生产的影响 序号 1 2 3 4 5 5 产酶周期／h C／N FPA／IU·mLI1 66 82 94 98 108 120 4：1 6：1 7：1 8：1 10：1 12：1 3．46 5．24 5．75 6．04 5．73 5．37 2．6 不同碳源对产酶的影响 大多数真菌产生的纤维素酶都是复合酶，也是诱 导酶。通常纤维素底物及其类似物都是纤维素酶 的 良好诱导物 ，其中包括纯纤维素粉、废纸浆和木质纤 维素粗原料等。本文对不 同碳源 的诱导作用进行 了 比较研究 ，结果见表 5。 表 5 不 同碳源对 里氏木 霉产纤维素酶的影响 从表 5中可 以看到 ，采用羧 甲基纤维素 或稻壳 粉，产酶结果很差，而采用纸浆时酶活力最高。在纯 纤维素原料 中，采用纯棉餐 巾纸 的产酶结果较差 ，实 验观察到菌体生长较慢 ，这可能是因餐 巾纸纤维比较 粗 ，菌种生长受到一定 限制 ，因而酶活较低。以木糖 渣 、玉米棒芯粉为底物 时，纤维 素酶 的活力较高。废 纸浆和木糖渣都是廉价的工业纤维素废料 ，常常引起 环境污染 ，采用廉价的废纸浆和木糖渣代替纯纤维素 生产纤维素酶，无疑具有明显的社会 和经济效益。 2．7 摇床转速对产酶的影晌 由于里氏木霉是好氧微生物 ，其产酶情况与氧传 递有很大关系【lo]。本实验中研究了不同摇床转速对 产酶的影响 ，分别选 择 150 r／rain、200 r／rain和 250 r／min三个不同转速进行实验 ，结果见图 2。 _j E 己 蛏 罐 U 至 U 鞋 图 2 不同摇床转速对产酶 的影 响 实验结果显示摇床速度对产酶有一定影响 ，转速 越高越有利于产酶 ，这可能是转速快时摇瓶 内传质状 况得到改善的结果 ，同时也说明在实验范围内摇床回 转运动产 生的剪切力还不 足以对产酶造成 负影响。 此外在 150 r／rain情 况下 还发 现菌丝 有结球 现象。 这些现象说 明剪切力过小也不利 于丝状菌的生长和 产酶。 2．8 底物浓度对产酶的影响 采用不同纸浆浓度 的培养基 ，测定了发酵过程中 FPA的变化 ，结果见表 6。 表 6 不 同浓度纸浆对里 氏木霉产 酶的影响 由表 6可 知，在 以纸浆 为原料的分批 发酵过程 中，纤维素酶活随纸浆浓度的增加而增加 ，至 30 g／L 达最大值 ，但进一步增加纸浆浓度为 40 g／L时，产酶 显著下降 ，其原因可能为高底物浓度使发酵液内溶解 氧浓度迅 速下降至临界值 ，或使环境 酸碱度变化过 大 ，因而对菌体初始生长产生明显抑制 ，菌体生长被 大大延滞 ，从而影响了产酶。 2．9 5m3通气罐发酵生产纤维素酶的产酶进程 根据 500 mL三角瓶培养得到的优化结 果，用选 定的培养基接种里 氏木霉，在 5m 通气罐 中进行产 酶实验，控制搅拌速度为 120～150 r／rain，通气量 0．2～1．0vvm，培养温度 28℃ ，每隔一 定时间测其 酶 活性和 pH值 ，结果见图 3。 图 3为采用 30 g／L纸浆为产酶培养基的分批发 酵过程 曲线 。从图 3可看 出，培养物 pH 随时间呈 v 型变化。纤维素酶是在培养 10 h以后开始产生 ，前 期酶活增长较慢 ，30 h以后酶活迅速增加 ，70 h以后 酶活增幅渐缓 ，到 90 h左右基本达 到高峰 ，FPA达 生蔓 !鲞差 塑!璺蔓 ! 塑 I 47 维普资讯 http://www.cqvip.com F()0D AND FERMEN I I、ION INDUSI RIE5 8．62 IU／mL。随后酶活开始 下降 ，培养基 中的还原 糖也开始下降。在整个发酵过程中，还原糖浓度一直 从 5 g／L降至 0．3 g／L并保持稳定 。 蠖 靶 链 活随底物浓度的增加而增加 ，但超过一定浓度时酶活 力反而下降。废纸浆 、木糖渣等廉价的纤维底物 ，可 以用来代替纯纤维素生产纤维素酶。 (4)最优培养基配方及发酵条件为 ：培养基起始 pH4．5，C／N=8：1，纸浆浓度 30g／L，培养温度 28℃ ， 接种量 10％(v／v)，摇床转速 150 r／min，培养时间 4 d。在此优化发酵条件下 ，摇瓶 发酵液 中的纤维素酶 活力达 11．67 IU／mL，比初始发酵条件下酶活力提 高近 3倍 。 (5)在同样的优化条件下进行 5 m 罐 中试 ，FPA 活力达 8．62 IU／mL。 图 3 5 m 搅拌罐产酶 的时间进 程 参 考 文 献 从 图 3中还可看 出，pH值 和还原糖降至最低点 以后，纤维素酶开始大量生成，说明纤维素酶的产生 妻 昌·酒精与蒸馏酒 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 学[M]·北京·中国轻工业出 和诱导底物有很大的关系，当还原糖基本消耗尽时， 2 耋 ．’ 研究及应用综述[J]．林产化工通 菌体开始利用纤维诱导物作碳源 ，从而启动了产酶 的 讯，1995(1)：6--9 诱导调控系统并产生大量的纤维素酶 ，从而使发酵液 3 张冬艳，张 通 ·影响液体深层发酵产生纤维素酶的因素 里的纤维素酶活力大大提高。但5 m3罐发酵最后结 窒 皋 果 比摇瓶的要低些 ，可能罐发酵时受 到剪切力 、转速 饲料工业，2003(1)：9～13 限制、起沫等 因素影响有关 。 5 余晓斌，具润漠 ．里氏木霉液体发酵法生产纤维素酶[J]． 食品与发酵工业 ，1998(1)：22～27 3 小 结 6 邬敏辰，李江华．里氏木霉固体发酵生产纤维素酶的研究 [J]．江苏食 品与发 酵 ，1998(2)：2～6 (1)在 500 mL三角瓶中对里 氏木霉 ZU一03的产 7 Miller G L．Use of dinitrosalicylic acid regrent for determina一 酶条件进行研究，发现培养基的C／N、初始pH、接种 啬 ： 嚣 & 量 、培养温度和摇床速度对纤维素酶的产生都有很大 Appl Chem 1987(59)：257～268 ⋯ 的影响。 9 Jirku V．Effect of C／2'~ratio and cellulose type on the cellu． (2)葡萄糖对纤维 素酶 的合成有较强 的阻遏作 b Y “ Y 01 tree and bilized¨ chodey 。tees LJ J’ 用，且阻遏作用随葡萄糖浓度 的增加而增强。 10 P e M ch ， n G ol i ：i ：。13i6R--，1Se39lb L．Ad、， in (3)里 氏木霉 ZU一03在不 同碳源存在 的情况下 ， Chitin Science(vol m II)[M]．Jacques And e P bli h ， 可以诱导产生 出活力不 同的纤维素酶 ，并且纤维素酶 1997-145～150 Optimization of Cellulase Production Using Trichoderma reesei HU Cai ing Dai Shumei Li Qiuyuan (Biotechnology Development Center，Tangshan Jidong Solvent CO．，Ltd．．Tangshan，063030，China) ABSTRACT The liquid fermentation conditions of cellulose production using Tr choderma reesei ZU一03 were studied．The optimum medium and the optimum fermentation condition were determined in this paper：initial pH at 4．8，the C／N at 8：1，pulp concentration at 30 g／L，culture temperature at 28℃ ，inoculum concentration of 10％ (v／v)，rotation speed of 180 r／min，and the culture time of 4 days．Under the above conditions，the cellu— lase activity in the flask was 1 1．67 IU／mL，nearly five times that of the original conditions．FPA was 8．62 IU／ mL in the 5m fermenter under the same optimized conditions． Key words Trichoderma reesei，cellulase，fermentation condition，optimization 2005 Vo1．31 NO 9(IotaI 2'13) 维普资讯 http://www.cqvip.com