Q5a 病毒安全性评价

来源于人或动物细胞系生物技术产 品的病毒安全性评价 I．前言 本文件旨在为从人或动物(即哺乳动物、鸟类、昆虫等)的特定细胞系制备的生物技术产 品提供病毒安全性的测试和评价方法，并提出了上市注册包装时应提交的一套资料。本文件 所述病毒不包括非常规性传播因子，如与疯牛病(BSE)和瘙痒病(scrapie)有关的传播因子。有 关疯牛病的问题，申请人：应与管理部门进行讨论。 本文件的范围涉及从特定细胞库引入的细胞培养物中所提取的产品，既包括从体外细胞 培养物所提取的产品，如干扰素、单克隆抗体和重组 DNA 产品(包括重组亚单位疫苗)，也 包括从体内如腹水内培养的杂交瘤(hybrid。ma)细胞中提取的产品。对于后者，有关其体内 所繁衍细胞测试的特别注意点和附加资料，见附录 1。灭活疫苗，含有自我复制因子的所有 活疫苗以及用基因工程方法生产的活性载体都不属于本文件范围。 来源于细胞系的生物技术产品的一个共同特点是存在病毒污染的危险性，这种污染在临 床上可产生严重的后果。污染可来自原细胞系(细胞基质)本身，也可来自生产过程中偶然带 人的外源病毒。然而，到目前为止从细胞系提取的生物技术产品还没有发生传播病毒的 问题。尽管如此，有关这些产品病毒污染的安全性，只有通过实行如下的病毒测试 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 并在 生产过程中对病毒的清除或灭活作用进行评估，才可能得到确实的保证。 控制生物技术产品的潜在病毒污染，可归纳以下相互联系的三条原则： a)．对细胞系和其他原料，包括各种培养基，进行选择和测试，确保其不含可能对人有 感染和/或致病作用的病毒。 b)对生产工艺中清除感染性病毒的能力进行评估。 c)在生产的适当步骤对产品进行测试，确保产品没有受感染性病毒的污染。 所有测试都不可避免地受到病毒定量分析本身的限制，即根据统计原则，能否测到低浓 度病毒取决于样本大小。因此，单靠一种方法并不一定能够确定一个产品的安全性。在许多 情况下，要确定最终产品没有感染病毒，不能单凭是否直接测到病毒而定，还需证明该纯化 方法是否能将这些病毒消除或灭活。 在不同生产步骤中应采取的病毒测试方法和病毒清除研究，其类型和程度取决于多种因 素，应逐一地进行分析；应考虑的因素包括：细胞库管理水平、所测定病毒的性质、培养基 组成、培养方法、仪器设备的型号、细胞培养的病毒测试结果、生产工艺清除病毒的能力及 产品类型和临床用途。 本文件的目的是为病毒测试 1病毒清除试验的评估；设计病毒实验和病毒清除研究的方 法提供一个总的框架。有关资料在各附录中加以说盼；所用定义参见所附专用词汇表。 制造商应根据其特定产品和生产工艺对本文件所提出的各项建议进行调整。生产商应对 其确保病毒安全的总体方针作出解释并说明其依据。除了提供详细资料外，还应提供一份病 毒安全性评估的总结，以帮助和利于管理部门审查。该总结应对病毒安全性研究的各个方面， 以及与本文件有关的用于避免病毒污染的方针作一简单陈述。 Ⅱ．潜在的病毒污染源 生物技术产品的病毒污染可来自原始细胞系或来自生产过程中偶然带人的外源病毒。 A 主细胞库(MCB)可能存在的病毒 细胞的病毒感染可以是隐性的或持久的(如疤疹病毒)，或内源性逆转录病毒。内源性逆 转录病毒基因组一直存在于细胞内，可从一代细胞直接传给下一代细胞。这些病毒可以整体 表达，或偶然表达成一种感染性病毒。 病毒可通过多种途径进入MCB，例如； 1)从受感染动物提取的细胞系； 2)使用病毒建立细胞系； 3)使用受污染的生物试剂如动物血清组分； 4)细胞操作过程中受到的污染。 B 生产过程中可能带人的外源病毒 外源病毒可通过多种途径带入最终产品，其中至少包括以下几点： 1)使用受污染的生物试剂如动物血清组分； 2)用病毒作为载体表达某一编码蛋白的特异基因； 3)使用受污染的试剂，如单克隆抗体亲和柱(affinityc。lumn)； 4)组方中使用了受污染的赋形剂； 5)细胞和培养基操作过程中的污染。 对细胞培养的参数进行监控有助于早期测出可能污染的外源病毒 III．细胞系界定：病毒测试 合适的病毒测试方法是确定细胞系是否适用于生物技术产品生产的重要部分。 A 对主细胞库(MCB)，工作细胞库(WCB)及体外细胞代次在生产限 度之内的细胞进行病毒检测 不同级别细胞(包括MCB、WCB和体外细胞代次在生产限度之内的细胞)的病毒测试方 法举例(见表 1)。 1．主细胞库 应对 MCB 进行内源性和非内源性病毒污染的全面筛查。对于含一种或—J 种以上人或 非人灵长目动物配体的异种杂交细胞系，由于这些细胞引起的病毒污染是极其有害的，因此， 应进行人或非人灵长目病毒的测定。 非内源性病毒的测定应包括体内和体外接种试验，井根据该细胞系的传代史进行其他特 异性试验，包括相应的物种特异性试验如小鼠抗体产生试验(MCB)，用以测定可能污染的病 毒。 2．工作细胞库 作为药物生产起始细胞基质的工作细胞库，必须进行外源病毒检测，既可对WCB进行 直接测定，也可对从WCB来源的体外传代限度内的细胞进行分析。当对 MCB已进行过相 应的非内源性病毒测试，或者对已达到或超过体外细胞传代限度的WCB来源的细胞进行过 外源病毒的测试，则不必再对原有的WCB作类似的试验。 WCB一般不须作抗体产生试验。 另外，不检测MCB，而对WCB进行全面检测来作为替代手段也是可以的。 3，体外传代限度内的生产用细胞 用于生产的体外细胞传代限度应根据在中试或商业化生产条件下达到或超过设定的体 外传代限度的生产细胞的资料而定。 一般说来，生产细胞是通过扩大 WCB 获得的，MCB 也可直接用于制备生产细胞。有 些内源性病毒对能在 MCB和WCB阶段没有被检测出，应对在体外传代限度之内的细胞的 内源性病毒作出评价。对体外传代限度之内的细胞至少应进行一次适当的试验(如体内和体 外试验)，以进一步确保生产过程不受月外源病毒的污染。如果此时测出有外源病毒，应对 工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 作仔细检查以查明污染原因。若有必要，应对工艺全部重新设计。 B对病毒检测和鉴别方法的建议 对内源病毒和外源病毒的检测方法很多。表 2列举了一些检测方法。这些方法可作为目 前推荐的基本方法，但不是包罗万象，也不是固定不变的。由于大部分适用的方法会随科学 的发展而变化，因此只要有充分的资料支持，采用其他方法也是可接受的。欢迎生产商与管 理部门讨论这些建议。对个别特殊情况，可能需要作其他试验。应设相应的对照试验，以确 保试验具有充分的敏感性和特异性。当细胞的种族提示有较大可能存在某种病毒时，需进行 专门试验和/或处理。如供生产用的细胞为人或非人灵长目细胞系，除特殊理由外，还应进 行如引起免疫缺陷性疾病和肝炎的人源病毒测试。聚合酶链式反应(PCR)可用于检测这些人 源病毒和其他特殊病毒的核酸序列。生产商应按以下提出的一般框架和理论背景证明其所做 工作的合理性。 1．逆转录病毒测试 对于MCB和培养达到或超过细胞代次的生产限度的体外细胞，应进行转录病毒测试， 包括对敏感细胞培养的感染性测定和电镜(EM)检查。如果没有检测到病毒感染，EM 没有 发现逆转录病毒或逆转录病毒样颗粒，应测定反转录酶(RT)，或采用其他适当的方法，测定 有无非感染性的逆转录病毒。至于转导研究(inducti。n study)，目前尚未发现对此有何应用 价值。 2．体外检测 进行体外检测时，应将被测试物品(见表 2)接种到能检测人和有关动物各种病毒的含敏 感指示剂的细胞培养基中。测试中所用细胞的选择需根据待试的细胞库物种来源而定，但必 须包括一种对人病毒敏感的人和/或非人灵长目动物细胞系。测试的种类和待测的样本应根 据细胞的来源或细胞操作的情况可能存在的病毒类型而定。细胞致病病毒和红细胞吸附病毒 应予以检测。 3．体内检测 将被测试物品(见表 2)接种到哺乳期小鼠和成年小鼠以及鸡胚中，以发现细胞培养基中 不能生长的病毒。根据细胞系性质和来源，还可使用其他动物物种进行测试。应对动物的健 康情况进行监测，如有异常应进行调查以确定病因。 4．抗体产生试验 对于啮齿类动物细胞系中的物种特异性病毒的检测，可将被测试物品(见表 2)接种到无 病毒的动物中去，经一段特定时间后测定其血清抗体水平或酶活性。这种试验包括：小鼠抗 体产生试验（MAP）、大鼠抗体产生试验（RAP）和仓鼠抗体产生试验（HAP）。最近有 关用抗体产生试验筛选查出的病毒见表 3。 C细胞系的可接受性 人们认识到，用于生产的某些细胞系含有内源性逆转录病毒及其他病毒或病毒序列。为 此，本文件第 V 节介绍了生产行动计划。对于含有内源性逆转录病毒以外的病毒的细胞系 能否用于生产问题，应由管理部门根据产品的收益、产品的临床使用用途、污染病毒的性质、 感染或致病的潜在可能性、产品的纯化工艺(如对病毒清除的评价资料)及对纯品进行病毒测 试的程度，进行利弊分析后综合考虑。 IV．未加工品的病毒测试 未加工品包括集中回收的一批或多批细胞和培养基。当胞不易取到(如使用中空纤维或 类似装置回收)时，未加工品是发酵罐中收获的液体。、在作深加工前，从生产反应罐中获 的一份末加工品的典型样本最有可能污染外源病毒，若有染，也最有可能被检测出来。因此， 除在部分初加工时进行敏感的病毒测试外(如未加工品在细胞培养基中可能有毒性，而经部 分加工后可能就没有毒性了)，应在未加工品阶段进行病毒测试。 在某些情况下，可对同时含有完整细胞和破碎细胞以及加工前从反应器中取出的培养上 清液的混合物进行测定。在行上市注册申请时，至少应上报三批中试生产规模的未加工品资 料。 生产商应制定出对各批产品进行外源病毒现场考核的划。对于未加工品病毒测试的范 围、程度和次数应结合以下几点综合考虑后再作决定：用于生产产品的细胞系性质、细胞系 界定过程中病毒检测的结果和广度、培养方法、原料来源和病毒消除研究结果等。对未加工 品，一般使用一种或几种细胞系进行体外筛查试验。如适用，可使用 PCR 试验或其他适当 的方法。 一般来说，已酗出有外源病毒的未加工品不能再用于生产产品，并应对工艺流程作认真 检查，以确定污染原因，以便采取适当措施。 V．对纯品进行病毒清除研究和病毒检测的基本原理和操作 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 应从 MCB、药品生产的各个阶段到最终产品设计出最适用并最合理的病毒测试方案， 其中包括对未加工品病毒清除的评价和鉴定。病毒清除的评价和鉴定，对于确保产品没有病 毒污染起着关键作用。 在选择清除研究用病毒时，一方面需要对清除已知病毒的工艺作出评价，另一方面还需 用非特异模型病毒(后文叙述)估计该工艺的耐用性。关于相关模型病毒、特异模型病毒和非 特异模型病毒的定义，见术语解释。工艺评估时需要了解在该工艺过程(如未加工品)有多少 病毒量存在，以及清除多少量才能确保产品的安全性。灭活有时效性，了解这一点将有助于 确保灭活效果。在评价对已知污染物的清除能力时，需对灭活的时效关系进行深入研究，对 灭活/清除方法的重现性加以证实，同时还要对工艺参数作出评价。当用非特异模型病毒来 考核生产工艺清除病毒的耐用性时；研究设计中应对非包膜病毒予以特别的关注。病毒清除 特性研究的限度可能受对细胞系和未加工品的检验结果的影响。这些研究应按以下所述方法 进行(第VI节)。 表 4 是举例说明对于细胞和/或未加工品病毒检测结果而采取的行动方案，包括工艺评 价、病毒清除鉴定和纯品的病毒试验。要考虑各种情况，但必须用非特异模型病毒对病毒清 除情况进行鉴定。A、B两种情况是最常见的。污染非啮齿类动物逆转录病毒的生产系统一 般不能再用于生产。如果要将 C、D、E的细胞系用于药物生产，要有充分说服力和正当理 由，并须与管理机构协商。当使用 C、D、E细胞系时，须有已经验证的有效步骤，确保可 疑病毒从生产流程中灭活或消除。 情况 A 细胞或未加工品中未发现有病毒、病毒样颗粒或逆转录病毒样颗粒，应使用上 述非特异模型病毒进行病毒消除和病毒灭活研究。 情况 B 只有啮齿类动物逆转录病毒(或非致病性逆转录病毒样颗粒如啮齿 A型和 R型 颗粒)，应使用特异模型病毒，如鼠白血病病毒，对工艺进行论证。对于纯品，应使用高特 异性和高敏感性的方法对所疑病毒进行测定。上市审批时，应至少提供三批中试或生产规模 的纯品。常用于药物生产的 CH。、C271、BHK 等细胞系和鼠杂交瘤细胞系，尚未有关于 产品病毒污染安全问题的报道。对于这些细胞系，由于其内源性颗粒的性质已经全面鉴定， 病毒清除问题也已证实，一般无须再检测纯品的非感染性颗粒。使用如情况 A 中所述的非 特异模型病毒即可。 情况 C 已知细胞或未加工品中含有除啮齿类动物逆转录病毒以外的病毒，而这些病毒 又无证据说明其对人有感染性[如表 3 脚注 2 中所标明的，除啮齿类动物逆转录病毒(情况 助以外的病毒)，则病毒消除和灭活的评价研究应使用已鉴定的病毒。如果不能使用已鉴定 的病毒，应使用相关模型病毒或特异模型病毒来评估其清除程序是否可被接受。在灭活的关 键步骤，应对已鉴定的病毒进行时效性灭活，作为对这些病毒工艺评价的一部分。对于纯品， 应用高特异性、高敏感性的方法对所疑病毒进行检测。申请上市时，应至少提供三批中试或 生产规模的纯品资料。 情况 D 当检测出已知的人致病原(如表 3 脚控 l 所指的)时，除特殊情况外，该产品是 不能被接受的。在这种情况下，建议用已鉴定的病毒作病毒消除和灭活评价研究，并使用 高特异性、高敏感性的特殊方法对所疑病毒进行检测。如无法使用该病毒，应使用“相关” 和域特异模型病毒(后文叙述)。应证明在纯化和灭活过程中，该工序确已达到稍除和灭活所 设病毒的目的。应在灭活的关键步骤取得时效性灭活数据，作为工序评价的一部分。应使用 高特异性、高敏感性的方法对纯品的所疑病毒进行检测。申请上市时，应至少提供三批 中试或生产规模的纯品资料。 情况 E 在细胞或未加工品中检测到用现有方法无法分类的病毒时，由于这种病毒最终 有可能是致病性的，因此该产品一般不予接受。在极个别的情况下，并有充分说服力和正当 理由说明该细胞能用于药物生产时，在进入下一步之前，须与管理机构协商。 VI．病毒清除程序的评价和鉴定 病毒消除和/或灭活方法的评价和鉴定对生物技术产品的安全性起着重要的作用。很多 过去发生污染的事例即是由于使用了那些未知的或可疑的原料。尽管这种情况并不发生在从 性质完全确定的细胞系提取的生物技术产品，而是发生在从其他原料提取的生物制品中，但 是病毒清除评价可使我们确信那些未知的、预想不到的和有害的病毒都有可能被清除。研究 必须以充分的资料为依据并且有对照。 病毒清除研究的目的是：评价灭活／消除病毒的各个工序是有效的，并对该工序降低病 毒的整体水平作出定量评估。具体做法是有目的地将一定量的病毒加入到原料和/或各工序 的抽样材料中去，验证下面的工序对此病毒的消除活灭或情况。如果较少几步就能证明其对 病毒的清除是充分的，则不必对生产的每一步都作评估和鉴定。应注意的事，生产的其他工 序可能会对已取得的病毒灭活/消除结果产生间接影响。生产商应对评价清除病毒的研究方 法做出解释和证明。 可通过消除病毒颗粒或将病毒感染性灭活的方法来达到降低病毒感染性的目的。在评定 每一生产工序时，都应说明使病毒失去感染性的可能机制，即究竟是被消除还是被灭活。对 于灭活步骤，应对研究计划作这样的安排：在不同的时间取样并做出灭活曲线（见VIB5节）。 病毒清除评价研究的目的是要证实，MCB 中已知存在的病毒被清除了，同时提供一定 程度的保证，即那些没有被测导的或能进入生产流程的外源病毒也可被清除。下降因子一般 用 l。g表示，其含义是：虽然病毒的残留感染性永远也不可能降至 0，但可以对实际大幅度 下降。 除了对已知存在的病毒进行清除研究外，还应对其他病毒的消除和/或灭活能力进行研 究。对于那些目前还不清楚或可能会存在的、生化和生物物理特性有十分广泛的病毒，研究 的目的并不是要达到某一特定的消除活灭或目标，而是要确定方法的可靠性。有必要对生产 工序中的病毒消除或灭活能力加以证实（见 VIC 节）。这种研究并不是要对某一特定安全 危险性做出评价，因此，无须求出特定的清除值。 A 评价和坚定病毒清除率用的病毒选择 为了测试生产工艺去除病毒的总体能力，供清除评价和工艺鉴定研究用的病毒应与可能 污染产品的病毒相似，而且要有广泛的理化特性。生产上应根据评价和鉴定病毒清除率的目 的及本指南提及的准则对病毒的选择做出合理解释。 1．“相关”病毒和“模型”病毒 病毒清除研究中的一个主要问题是确定使用何种病毒。这些病毒可分为三类：“相关” 病毒、特异“模型”病毒和非特异“模型”病毒。 “相关”病毒是指用于生产过程中评价病毒清除情况的病毒，可以是已被鉴定的病毒， 或是与已知病毒种类相同的病毒，或是可能会污染细胞底物或污染生产过程中使用的其他试 剂或材料的病毒。纯化和/或灭活工艺应证明能消除和/或灭活此种病毒。如果得不到“相关” 病毒，或它不太适用于清除病毒的工艺评价研究(如不能离体培养到足够的滴度)，应使用特 异“模型”病毒代替。适用的特异“模型”病毒是与已知病毒或可疑病毒密切相关(同种或 同属)，并与所观察的或可疑的病毒具有类似理化特性的病毒。 啮齿动物细胞系一般都含内源性逆转录病毒颗粒或逆转录病毒样颗粒，可能具有感染性 (C型颗粒)，也可能没有感染性(细胞浆 A型和 R型颗粒)。所用生产工艺应确定啮齿类动物 逆转录病毒可从此种细胞系产品中清除或灭活，此项工作可使用鼠白血病病毒，因为鼠白血 病病毒是鼠细胞的特异“模型”病毒。由于已能用 EB病毒(EBV)激活 B淋巴细胞而获得分 泌单克隆抗体的人细胞系，因此应确定生产工艺能否消除和/或灭活疤疹病毒。假狂犬病毒 也可用作特异“模型”病毒。 当其目的是确定生产工艺消除和/或灭活病毒的总体能力，即确定方法清除可靠性时， 应使用具有不同特性的非特异。“模型”病毒作为病毒清除特性研究。从“相关”病毒和/ 或特异“模型”病毒研究中所获取的资料也有助于这种评估。一般不需要对所有病毒进行测 试，应对那些对理化方法处理具有耐受性的病毒加以关注，因为从这些病毒所获取的结果可 作为评价生产工艺消除和域灭活病毒的总体能力提供有用的信息。选用病毒的种类和数量与 细胞系质量和特性及生产工艺有关。 附录 2和表 A—1例举了代表不同物理化学结构的“模型”病毒以及已用于病毒清除研 究的一些病毒。 2．其他问题 其他要考虑的问题如下： a)尽管有时不可能，能培养出高滴度的病毒是最理想的。 b)应有一种有效和可靠的测定方法对要测试的每一道生产工序中所用的每种病毒进行 检测。 c)有些病毒可能会对从事清除研究的人员造成健康损害，对此应加以重视。 B病毒清除评价和鉴定研究的设计和内涵 1．设备和人员 根据 GMP 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 ，不能将任何病毒引人生产设备。因此病毒清除研究应在隔离的实验室 进行。该实验室应进行病毒学研究并由具有病毒学专业知识的人员会同参与纯化工艺设计和 准备的生产人员一起进行。 2．缩小规模的生产体系 应对缩小生产规模的有效性加以证实。缩小的生产规模应尽量接近实际生产水平。色谱 设备、柱床高度、线性流速、流速／柱床高度比(即接触时间)、缓冲液、凝胶型号、pH、温 度、蛋白浓度、盐及产品都应代表生产规模水平。应有一个类似的洗脱方案。对于其他生产 工序，亦应有类似考虑。有些偏差是不可避免的，但应重视其对结果的影响。 3．对病毒逐步消除的分析 在进行病毒清除研究时，要评估一个以上生产工序对杀灭病毒的综合作用，还要对每个 可能参与病毒清除的生产工序的消除和/或灭活病毒的能力进行分别评估，并认真考虑各个 工序的确切作用。每一工序的测试材料中应含足够量的病毒，以便对每一工序阶段的有效性 作出适当的评价。一般来说，应将病毒加入到要测试的每一生产工序正在加工的材料中去， 在有阶情况下，只要将高滴度病毒加到未提纯的产品中去，并测定随后各步骤的病毒浓度就 可以了。当病毒清除是由分离步骤完成时，如有可能，建议对分离步骤中不同部分的病毒量 的分布进行调查。当在生产过程中有多个工序使用杀病毒缓冲剂时，也可用替代的方法，如 用较弱的杀病毒缓冲剂进行平行试验，作为对生产工艺总体评价的组成部分。另外应对每一 工序受试前和受试后的病毒滴度进行测定，感染性定量测定应有足够的敏感性和重现性。还 要有足够的重复实验以确保结果具有充分的统计学可信度。如有正当理由，也可使用与感染 性无关的定量分析。在进行感染性测定时；要有相应的病毒对照组以确保方法的敏感性。如 抽样病毒的浓度较低，其统计结果值得考虑(附录 3)。 4．确定病毒清除还是灭活 降低病毒感染性，可通过清除病毒或灭活病毒的方法实现。对评定的每一道生产工序， 都应说明其减失病毒感染性的机制是消除还是灭活。如生产工艺只清除了很少一部分病毒感 染性，由于病毒的清除是保证产品安全性的重要因素，则必须进行专门的或附加的灭活／消 除步骤。对某一特定步骤，区别其中的清除和灭活作用是必要的，例如，在一个过程中某种 缓冲液在多步清除步骤中使用，在每一步中均有灭活作用，即应区分多步清除(如层析)中缓 冲液的灭活作用和每一步层析的清除作用。 5．灭活评估 为了对病毒灭活作出评估，应在未加工的粗品或中间品中加入感染性病毒，并计算下降 因子。要知道病毒灭活不是一个简单的一次性反应，通常比较复杂，有快的“一期”反应和 慢的“二期”反应。因此，要在不同的时间取样研究并建立灭活．曲线。建议灭活研究除最 低作用时间外至少还应设一个大于零和小于最低作用时间的时间点。如果该病毒是一种已知 人致病性“相关”病毒，研究工作必须取得更多的资料，并设计出一种有效的灭活工艺。但 是，如使用非特异“模型”病毒进行灭活研究，或使用特异“模型”病毒作为病毒颗粒的替 代物，如 CH。细胞浆内逆转录病毒样颗粒，必须至少分别作两次独立的研究来证实清除的 可重复性。如可能，应从加入病毒的起始材料中能检测出的病毒量确定病毒的起始量。如果 不可行，可根据加入病毒的滴度计算起始病毒量。如果由于灭活太快，来不及根据工艺条件 建立灭活曲线，应进行相应的对照试验以证实病毒经灭活处理已失去感染性。 6。分离柱的功能和再生 纯化系统中的色谱分离柱和其他设备经一段时间反复使用后，其清除病毒的能力会发生 变化，因此在使用若干次后，必须估测其清除病毒的稳定性后才能再用。在设备再次使用前， 必须保证生产设备可能残留的任何病毒都被充分消灭或消除。例如，可通过提供证据证实色 谱柱经过清洗和再生过程确实将病毒灭活或消除了。 7．特别注意事项 a)制备高滴度病毒时应注意避免凝集反应。它可增强物理清除作用，降低灭活作用，从 而与实际生产不符。 b)必须注意能作出可靠分析的最低病毒量。 c)应进行平行对照分析研究，以评估样品是否因稀释、浓缩、过滤或贮存等原因使病毒 失去感染性。 d)加入产品中的病毒量体积要小，从而不会使产品稀释或改变产品的性质。因稀释后试 验蛋白样品已不再与生产规模的产品相同。 e)诸如缓冲液、培养基或试剂等的微小不同都会影响病毒的清除。 f)病毒灭活是时间依赖性的。因此，加入病毒的产品在某一缓冲剂中或特定色谱分离柱 中停留的时间长短应能反映生产规模的工艺条件。 g)应对缓冲剂和产品分别评估其对毒性或病毒滴度检测方法的干扰，因为这些因素会对 指示细胞产生不良影响。如果溶液对指示细胞有毒性，可能需要进行稀释、调整 pH值或者 将含有加入病毒的缓冲液进行透析。如果产品本身具有抗病毒活性，进行病毒清除研究时， 应需要采用无产品的空白对照试验，即使不用产品或用无抗病毒活性的相似蛋白替代品会影 响某些生产工序的病毒行为。应采用指示病毒的对照方法来证明如透析、贮存等难备检测样 本的单个过程对消除项活病毒的影响。 h)许多纯化装置都反复使用相同或相似的缓冲液或分离柱。分析数据时，应考虑这种方 法的各种影响。某一特定工艺的清除病毒效果会随所使用的生产阶段有所不同。 i)当生产条件或缓冲剂具有很强细胞毒性或杀病毒作用时，可能会低估总体下降因素， 因此需逐例讨论。出于病毒清除研究本身的局限性或因设计不够完善，也会高估总体下降因 素。 C病毒清除研究的说明 可接受性 评估病毒灭活朋除的目的是对各处理阶段作出评价和鉴定，了解其对灭活硝除病毒是否 有效，并对生产过程中病毒下降的总体水平进行定量分析。就及 B-E所述的病毒污染而言， 不仅要证明病毒已被消除或灭活，而且还要证明纯化工艺具有足够能力将病毒清除，从而确 保终产品具有相当的安全性。生产过程中所消除或灭活的病毒量应与未加工品中可能存在的 病毒量相比较。 为了进行这种比较，必须对未加工品中的病毒总量作出估计。方法可采用检测感染性或 其他诸如电透镜(TEM)的方法。整个纯化工艺去除病毒的能力应比末加工品的同等单剂量 中的估计量更多。病毒下降因子计算见附录 4；每个剂量颗粒的估算见附录 5。 生产商应认识到，不同种类的病毒，其清除机制有可能不同。当判断病毒灭活/消除过 程的效果时，应综合考虑以下各种因素： 1)所用测试病毒是否合适； 2)清除研究的设计； 3)所获得的 log下降值； 4)灭活的时效问题； 5)工艺参数变化对病毒消除/灭活的潜在影响； 6)测定方法灵敏度范围；。 7)灭活/消除方法对某些种类病毒可能具有的选择性。 以下任何一种方法都能实现有效清除：多步灭活法，多步互补分离法，或灭活与分离结 合法。由于分离法对病毒的物理化学特性具有很强的依赖性，它会影响病毒与凝胶基质的相 互作用和沉淀特性，因此“模型”病毒可用与靶病毒不向的方法进行分离。应很好确定影响 分离的生产参数并加以控制。表面特性的变化，如糖基化，也是差异的来源。但是尽管存在 这些潜在的可变因素，仍可采用将几种互补分离过程结合的方法或将灭活与分离相结合的方 法达到有效清除病毒目的。因此，色谱层析分离、过滤和提取等方法，只要控制条件并完善 设计，都是有效清除病毒的方法。一种清除病毒的步骤其降低病毒的能力，应至少分别由两 次独立的研究加以重复才能证明是有效的。 总体下降因子一般以各因子之和来表示。除另有合理解释，病毒滴度下降在 1log10。或 以下可忽略不计。 如所用生产工艺能达到的清除率很低，而病毒清除对于产品安全又是一个重要因素，则 应另外增加一次或多次有针对的灭活/消除步骤。生产商应对所有病毒下降因子的合理性作 出说明，并将根据以上所列因子对结果作出评价。 D病毒清除研究的局限性 病毒清除研究有助于保证最终产品达到可接受的安全水平：但其本身并不能实现安全。 这是由于病毒清除研究设计和执行过程中的许多因素会使对生产工艺清除病毒感染的能力 作出不正确的估计，其中包括如下因素： 1．用于某一生产工艺病毒清除研究的病毒制品可能是在组织培养中生产的。在某一生 产步骤，组织培养的病毒其特可能与原病毒的特性有所不同；例如，天然病毒与培养的病的 纯度和凝集度是不同的。 2．病毒感染性的灭活常是一条双相曲线：先有一个快速起始阶段，接着是一个较慢的 阶段。这就可能使最初灭活阶段逃逸的病毒对以后各阶段具有更强的耐受性。如具有耐受性 的那一部分病毒以病毒凝集物的形式出现，则其感染性可能对许多不同的化学处理及热处理 都产生耐受性。 3．生产工艺对病毒感染性的总体清除能力是以每一阶段病毒下降 log 值之和表示的。 将各阶段的下降因子相加，尤其是将下降较少(如低于 1log10。)阶段的因子相加，可能会对 去除病毒的实际能力估计过高。此外，亦不能将重复相同或几乎相同的方法所获得的下降值 包含在其中。 4．下降因子用 log 滴度来表示，说明尽管残留的病毒感染性可能已大大降低，但是决 不会降至 0.例如，考虑到测定方法的检测范围，每毫升含 8log10感染单位的制品感染性下降 8log10，其结果是每毫升 0log10或是每毫升一个感染单位。 5．尽管缩小生产规模设计时慎之又慎，但中试规模生产总是与生产规模的生产有所不 同。 6．生产过程中其他有相似灭活机制的病毒下降因子的相加会对整体清除病毒能力产生 过高估计。 E 统计 病毒清除研究应用数据进行统计学分析，对结果作出评价。研究结果应具有统计学意义 才能支持所得出的结论(见附录 3)。 F病毒清除的再评价 当生产或纯化工艺发生重大变化时，要考虑这种变化对病毒清除直接和间接的影响。必 要时应对该工艺进行再评价。例如，生产工艺的变化会使细胞系产生的病毒数量发生明显变 化；生产步骤的变化也可能会改变病毒清除的程度。 VII． 小结 本文件就病毒污染危险性的评价方法及产品的病毒清除方法提出建议，从而有助于从动 物或人细胞系生产出安全的生物技术产品。同时强调了以下一些措施的价值： A 要对细胞基质原材料进行全面定性和筛查，以明确存在哪些病毒污染物。 B 通过确定污染物的人向性，对危险程度作出评价； C 制定一项测试末加工品中外源病毒的计划。 D 为获得最佳病毒清除效果，对病毒清除研究应进行仔细设计，在同一生产过程中使 用不同的病毒灭活或消除方法。 E 评价病毒灭活和消除的方法研究。 ： VIII．术语 外源病毒 见病毒。 细胞基质 用于制造产品的细胞。 内源病毒 见病毒。 灭活 用化学或物理的方法使病毒感染性降低。 体外细胞代次 从MCB瓶融化到生产反应器回收之间的时间测定单位，包括培养所花 费的时间、培养稀释后用特定的方法进行传代培养时细胞扩增或传代的时间。 主细胞库(MCB) 一般是在规定条件下从经选择的细胞克隆中制备的细胞单批合并物， 等量分置于多个容器中并在特定条件下存放。 MCB是用作制备工作细胞库(WCB)的。检测 一个新 MCB(来自原细胞克隆、MCB 或 WCB)时，除非有正当理由，一般其检测方法应与 检测该MCB的方法相同。 最低作用时间 一个处理步骤所保持的最短时间。 非内源病毒 见病毒。 病毒清除工艺鉴定 用非特异“模型”病毒评价生产过程消除和/或灭活病毒可靠性的 研究。 病毒清除方法评价研究 用“相关”和/或特异“模型”病毒确定生产工艺清除和/或灭 活病毒效果的研究。 生产用细胞 用于制造产品的细胞底物。 未加工品 一次或多次回收后集中起来的细胞和培养基。当细胞不能直接获得时，末加 工品是从发酵罐中回收的液体。 病毒 在细胞内复制并可致病的感染性因子，只有一种核酸(RNA 或 DNA)，不能以其 遗传物质形式生长、双数分裂和繁殖。 外源病毒 非故意弓[入的污染病毒。 。 ： 内源病毒 其基因组是宿主细胞起源物种生殖细胞的一部分，并整合到动物基因组中的 一类病毒体。在本文件中，为无限繁殖细胞基质而故意引入的非整合病毒如 EBV及疯牛病 毒 (BPV)属于这一类病毒。 非内源病毒 MCB中存在的外源病毒。 非特异模型病毒 用来为生产工艺清除病毒能力定性的病毒，其目的是对生产过程消除 和/或灭活病毒的总体能力进行定性，即确定纯化工艺的效能。 相关病毒 用于工艺评价研究用的病毒，可以是已经鉴定的病毒或是已知病毒的同一种 类，或是生产过程中使用的任何易污染细胞底物的病毒。 特异模型病毒 与已知或可疑病毒密切相关(同种或同属)的病毒，与所见或所疑病毒具 有类似的物理化学特性。 病毒清除 通过将病毒颗粒消除或将病毒感染性灭活的方法消灭靶病毒。 病毒样颗粒 在电镜下可见、形态与已知病毒相似的某种结构。 病毒消除 用物理方法将病毒颗粒从产品中分离。 工作细胞库(WCB) 在规定培养条件下扩增 MCB 获得匀质的细胞悬液，并经分装成多 个等份制备而成。 表 l 不同级别细胞进行的病毒测试方法 MCB WCB 代次限制细胞 b 逆转录病毒和其他内源病毒的测试 感染力 十 — 十 电镜 十 c — 十 c 逆转录酶 十 d — 十 d 其他特异病毒试验 如适用 c — 如适用 c 非内源性或外源病毒测试 体外测定 十 —f 十 体内测定 十 —f 十 抗体产生检测 十 g — — 其他特异病毒检测 十 h — — a见正文—III．A．2 b传代限期内的细胞：在体外传代限度之内的生产细胞(见正文—m．A．3) c也可测定其他因子。 d若逆转录病毒感染试验为阳性，则无须作。 e指使用于已受此因子感染的细胞系。 f第一个WCB时，此测试应在该WCB产生的体外代次在生产限度之内细胞上进行；以 后的 WCB，可直接在明 WCB 上进行单项体外和体内测试，或在体外代次在生产限度之内 的细胞上测试。 g例如MAP、RAP、HAP———通常使用于啮齿细胞系。 h“例如，适用于人、非人灵长目或其他细胞的测试方法。 表 2 用于病毒检测的测定方法的应用与局限性举例 检测项目 检测对象 检测能力 检测局限性 抗体产生 细胞及其培养 特异病毒抗原 对动物测试系统 基的溶解物 无感染性的抗原 体内病毒筛查 细胞及其培养 对人有致病作 在测试系统中不 基的溶解物 用的各种病毒 复制或不致病的 病毒 体外病毒筛查： 对人有致病作 在测试系统中不 的各种病毒 复制或不致病的 病毒 1．细胞库鉴定 1．细胞及其培 养基的溶解物 (共培养时，测 试物品中的细 胞应是完整的 细胞) 2．生产筛查 2。从生产反应 器中回收的未 加工品或细胞 及其培养基溶 解物 TEM检测： 病毒或病毒样 通过鉴别，进行 颗粒 定性分析 1．细胞底物 1．活细胞 2．细胞培养上 2．无细胞培养 清 上清 逆转录酶 无细胞培养上 逆转录病毒和 只能测定在理想 (RT) 清 已表达的逆转 条件下具有最佳 录病毒 RT 活性的酶。由于 有细胞中酶的存 在，或浓缩样品 的本底干扰，很 难得出结论。 逆转录病毒 无细胞培养上 感染连逆转录 RV在所选测试 (RV)感染力 清 病毒 系统中不能复制 或形成分散疫源 或菌斑 共培养 活细胞 感染性逆转录 RV不能复制 病毒 1．感染终点 1。见 RV感染 性栏 2．TEM终点 2。见 TEMa栏 3．RT终点 3。见 RT栏 PCR(聚合酶 细胞、培养液 特异病毒序列 必须有引物序列。 链反应) 和其他材料 不能说明病毒是 否有感染性。 a此外，很难将测试物品与指示细胞区分 表 3 抗体产生试验中的病毒检测 MAP HAP RAP 脱脚病病毒[2、3] 淋巴细胞性脉络丛 汉坦(Hantaan)病 脑膜炎病毒[1、3] 毒[1、3] 汉坦病毒[1、3] 小鼠肺炎病毒 基尔汉姆(Kilham)大 (PVM)[2、3] 鼠病毒(KRV)[2、3] K病毒[2] 呼肠病毒 3型 小鼠脑脊髓炎病毒 (Reo3)[1、3] (泰累尔，GDVII)[2、3 ] 乳酸脱氢酶病毒 仙台(Sendai)病 小鼠肺炎病毒 (LDM)[1、3] 毒[1、3] (PVM)[2、3] 淋巴细胞性脉络丛脑 SV5 大鼠冠状病毒 膜炎病毒(104)[1、3] (RCV)[2] 小鼠小病毒[2、3] 呼肠病毒 3 型 (Reo3)[1、3] 小 鼠 腺 病 毒 仙台病毒[1、3] (MAV)[2、3] 小鼠巨细胞病毒 巨唾液腺炎病毒 (MCMV)[2、3] (SDAV)[2] 小鼠脑脊髓炎病毒(泰 图兰(Toolan)病 累尔，GDVII)[2、3 ] 毒[2、3] 小鼠肝炎病毒 (MHVO)[2] 小鼠小轮状病毒 (EDIM)[2、3] 小鼠肺炎病毒 (PVM)[2、3] 多瘤病毒[2] 呼肠病毒 3 型 (Reo3)[1、3] 仙台病毒[1、3] 胸腺病毒[2] 1有证据表明能感染人和灵长目动物的病毒 2无证据表明能感染人的病毒 3能在体外细胞中进行复制的来源于人或灵长目动物的病毒 表 4 评价病毒清除工艺的行动计划和纯品的病毒测试方法 情况 A 情况 B 情况 C[2] 情况 D[2] 情况 E[2] 状态 有病毒[1] 一 一 十 十 (十)[3] 病毒样颗粒 — — — — (十)[3] 逆转录病毒样颗 — 十 — — (十)[3] 粒[1] 已鉴定病毒 不适用 十 十 十 — 对人致病病毒 不适用 —[4] —[4] 十 不知 行动 用非特异“模型”病 是[5]] 是[5] 是[5] 是[5] 是[7] 毒对病毒清除进行 工艺鉴定 用“相关”或特异模 不 是[6] 是[6] 是[6] 是[7] 型病毒对清除病毒 工艺进行评价 测试纯品中的病毒 不适用 是[8] 是[8] 是[8] 是[8] 1细胞底物和域在末加工品阶段病毒测试结果。用于生产的细胞培养受病毒污染后一般不能使用。内源 性病毒(如逆转录病毒)或是勤佃组成部分的病毒，在经过适当的病毒清除评价后可接受。 2当原料受到病毒污染时，无论是否知道在人体中有没有感染性和域致病作用，只有在极个别情况下才 被允许使用。 3用直接或间接的方法观察过的病毒。 4被认为对人无致病作用。 5应使用非特异“模型”病毒对病毒清除进行鉴定。 6应用“相关”或特异“模型”病毒进行工艺评价。 7见正文中情况 E。 8应对可疑病毒使用具有高特异性和高敏感性的方法确证纯品中测不出病毒。当进行上市审批时，应至 少提供三批中试或生产规模的纯品。但对于像 CHO那样的细胞，其内源性颗粒已经充分鉴定，并已证明经 过充分病毒清除处理，一般不需要再对纯品进行非感染性颗粒的检测。 附录 l 从体内传代的细胞库中提取的产品 对于接种特定细胞库细胞的动物，再从动物回收的液体中提取的产品，应另外提供有关 该动物的资料。 只要可能，用于制造生物技术产品及生物制品的动物应从种类明确而又无物种特异病原 体的动物群中选择。应对表 3所列的有关病毒进行充分测试。应提供对新进的及有病的动物 的安全保障方法，并确保设备中所用的所有容器、清洁和除污方法都能有效防止外来病毒的 扩散。这可通过一项标志性计划加以实现。还应列出一份影响因素清单。兽医服务应现场或 就近提供。应说明动物饲养场与其他生产设备分隔的情况。人员操作应确保安全。 应充分说明动物饲养的程序。其中包括：饲料、清洁的喂养计划、定期做兽医检查的条 例(若适用)，以及曾经接种过的动物的具体 管理办法 关于高温津贴发放的管理办法稽核管理办法下载并购贷款管理办法下载商业信用卡管理办法下载处方管理办法word下载 。同时要对动物的接种方案、接种物的 准备、接种部位及接种途径加以说明。 动物的原始回收物可被看做是从生物反应器中回收到的未加工品。因此，本文件上文第 1V 节所列的所有测试项目都应适用。此外，生产商应对未加工品的生物负荷作出评价，确 定该材料是否无支原体，同时对成年和哺乳期小鼠进行物种特异性检测及体内测试。 附录 2 供病毒清除研究用的病毒的选择 A 有用的“模型”病毒举例 1． 代表一定物理化学结构的非特异“模型”病毒： —SV40(m多瘤病毒 1)、人脊髓灰质炎病毒 l(萨宾)、动物细小病毒或其他一些小的非包 膜病毒； 副流感病毒或流感病毒、辛德比斯(Sin此 is)病毒或其 —他一些中到大的包膜 RNA病毒； —疤疹病毒(如单纯疤疹病毒或假狂犬病毒)或其他一些中到大的 DNA病毒。 这只是一些病毒的例子，不强制使用。 2． 对于啮齿动物细胞底物，鼠逆转录病毒·常用作特异“模型”病毒。 B 已用于病毒清除研究的病毒举例 表 A-1列举了已用于病毒清除研究的病毒。但是，这些只 是例子，对表中任何病毒的使用无任何强制之意。生产商也可 考虑使用其他病毒，特别是对他们自身生产工艺更适合的病 毒。一般说来，至少要用三种不同特性的病毒对工艺的清除病。 毒能力进行