实验一二重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法

质粒DNA的提取、纯化、酶切、电泳、 紫外分光光度法定量测定 朱文博 中山医学院 基因克隆示意图 分、切 接 转 筛 基因工程 定义： 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术，又称重组DNA技术。 基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 实验内容 2.限制性内切酶的酶切鉴定(P83) 3.定性鉴定:DNA的琼脂糖凝胶电泳(P28) 4.定量检测：DNA的紫外分光光度法测定(P37) 1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法) 实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用 ; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和步骤； 掌握紫外分光光度计对DNA含量的测定方法。 一.质粒DNA的提取 1 关于质粒的概念 a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？ * 1.1 质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。 * (1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 1.2 质粒的三种构型 * (2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA) 如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。 * (3) 线状DNA (linear DNA, L DNA): 如果两条链均断开，即为线状DNA。 电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？） * 最快 中 最慢 1.3 质粒DNA的一般特性： (1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型：菌毛、抗药性等 (3) 它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。 (4) 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同： ★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。 * 1.4 提取质粒DNA的目的与意义： 基因载体/基因克隆/基因工程 2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则 2.1 提取质粒DNA的常规方法 (1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。 但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒DNA的差异来分离的。 2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤 (1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） (2)细菌的收集与裂解 收集方法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。 (3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。 2.3 核酸分离纯化的总原则： (1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等） 3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA 3.1 实验原理： 高碱 细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。 纯化 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质 3.2 主要试剂及作用 溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲) ① 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械 剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用) ② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用） * 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） * 溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 3.3 实 验步骤 加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S   除去上清，加入冰的200 µl 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min   加入200µl 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min   加入150µl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min，12000g×5min  上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min   弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 µl TE 溶解DNA   RCF = 1.12r（rpm/1000)2 RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min） 注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！！！ 二、限制性内切酶切割重组质粒 1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 1.1 定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 * 1.3 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 1.2 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 1.4 命名 Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定 2.1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA） * 重组质粒 BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 PUC119（3.2Kb） U6启动子（256bp） 2.2 实验材料: (1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。 * 2.3 实验步骤 (1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定 * 2.4 双酶切体系 质粒DNA 10μl 10×M buffer 2μl BamHⅠ 1μl HindⅢ 1μl ddH2O 6μl * 合计 20μl 准备室老师已加好 同学自己加 37 ℃，1-2h 思考题？ 为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？ * 1 原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 * 三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶电泳 1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液 1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 2 实验材料及试剂 琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE 10 加样缓冲液 EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光. 琼脂糖凝胶板的制备 （封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳） 倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4 μl上样缓冲液，混匀 ） 电泳（100V 0.5小时，5V/cm） 染色与检测 （EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯下检测） 3 实验步骤 一、电泳前准备 准备内容 作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干 防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。 2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。 3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录 达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。 4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。 实验记录备查 二、制胶 步骤 注意事项 1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确 2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。 4.室温凝胶30分钟 过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。 5.拔梳子，放入电泳槽。 缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。 三、上样电泳 步骤 注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀 Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。 3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。 胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。 四、染色成像 步骤 注意事项 1.染色 如果胶中没有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染30分钟。 2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像 3.打印照片做分析记录 思考题？ 酶切前后的对比？ * M 酶切后 酶切前 点样孔 细菌基因组DNA OC 型质粒DNA L型质粒DNA SC 质粒DNA 细菌RNA 质粒电泳图谱 四、紫外分光光度法检测DNA浓度 1 分光光度技术 1.1 概述 分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。 * 1.2 特点 ①灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L ②准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差2～5％（1～2％）; ③操作简便快速; ④应用广泛。 * 2.1 分光光度计的基本部件 光 电 * 2 紫外分光光度法的原理 （氢灯、氘灯） 入射光＝反射光＋分散光＋吸收光＋透过光 用溶剂作为“空白”校正反射光、分散光 入射光（I0）＝吸收光＋透过光（It） * 2.2 分光光度法分析的依据： ①物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取决于物质的结构，这就是分光光度法定性分析的依据； ②其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这是分光光度法定量分析的依据。 * 2.3 吸收池 或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装被测溶液和决定透光液层厚度的器件。 一般由玻璃或石英制成， 注意：a. 与光束垂直； b. 规格相同； c. 清洁。 * 2.4 紫外分光光度法检测DNA的原理 原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。 优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。 缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。 * 产生误差的原因： 1.单色性不纯的影响； 2.杂散光的影响； 3.比色皿的影响； 4.温度、pH值的影响； 5.吸光度读数时的误差。 * 3 实验步骤 用0.1×TE 对待测DNA样品按1:20稀释 0.1×TE作为空对照,在波长260nm、280nm、310nm处分别测标准DNA样品的OD值 根据OD值计算DNA浓度（g/ml） 单链DNA[ssDNA]=33×(OD260－OD310)×稀释倍数 双链DNA[dsDNA]=50×(OD260－OD310)×稀释倍数 4. DNA的纯度鉴定 OD260/ OD280=1.8 （RNA为2 .0） >1.8 可能有RNA污染 <1.8 可能有蛋白质污染 * 2006.04.06