填充床反应器中酶法连续合成甘油二酯的研究

2l卷 3期 2005年 5月 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal 0厂Biotechnology V01．2l No．3 May 2005 填充床反应器中酶法连续合成甘油二酯的研究 Synthesis of Diacylglycerol Using Immoblized 1，3- Regiospecific Lipase in Continuously Operated Fixed Bed Reactors 孟祥河 ，孙培龙 ，杨 开 ，何荣军 ，毛忠贵 MENG Xiang—He ，SUN Pet—Long ，YANG Kai ，He Rong—Jun and MAO Zhong—Gut 1．浙江工业大学生物与环境学院，杭州 210032 2．江南大学生物工程学院，无锡 214036 1．CoUoge ofBiological&EnvironmentalEngineering，Zhejiang UniversityofTechnology，Hangzhou 210032，Ch／na 2．School ofBiotechnology，Southern Yangtze Ualvemity，Wuxi 214036，Ch／na 摘 要 近年来，l，3一甘油二酯(DAG)由于其广泛用途及健康作用 日益受到人们的重视。报道 了一种无溶剂条件下填充床反 应器中连续酶促合成 l，3-DAG的方法。研究了填充柱的长径比、进料体积流速、温度、底物摩 尔比对酯化率和 l，3-DAG产量 的影响。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明固定化酶填充柱长径比7．8，亚油酸、甘油摩 尔比 l：2，进料速度 1．2mL／rain，65℃条件 下酯化反应可实现脂 肪酸酯化率、l，3-DAG纯度及生产效率的统一。填充床反应器中固定化酶连续催化酯化反应的一个主要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 即体系水分清除 困难。实验研究了采用过量甘油吸附脱水的可行性，亚油酸、甘油摩 尔比为 l：2时，可明显改善固定化酶的稳定性，增加 Lipozyme RM IM的使用寿命。连续运行 10 d，残余酶活仍保持在 8O％以上，而对照组则仅为 52％。 关键词 l，3-甘油二酯，舍成，Lipozyme RM IM，填充柱反应器，脱水 中图分类号 R392．1l 文献标识码 A 文章编号 1000—3061(2005)03—0425—05 Abstract Diacylglycerol，DAG，because of its muhifunctional and nutritional properties，attracted considerable attention recently．Enzymatic synthesis of diacylglycerols from linoleic acid was investigated in a solvent—free reaction in a continuously operated fixed bed reactors containing Lipozyme RM IM．By appropriate manipulation of the fluid—residence time．the relative proportions of the various acylglycerols in the effluent stream can be controlled．In addition，the presence of excess glycerol is effective for the removal of water produced during the esterification reactions．Under the conditions of molar ratio of linoleic acid to glycerol of 0．5，the immoblized enzyme maintained high stability and allowed the reaction to continue for 10 days without significant deterioration in enzyme activity．It was determined that the conversion of fatty acid，content of 1，3-DAG and volume efficiency of reactor reached optima under the conditions：a packaged-bed reactor(with a ratio of packed length to inner diameter of 7．8)，reacting temperature at 65℃，molar ratio of linoleic acid to glycerol of 0．5，and feeding flow rate of 1．2mL／min． Key words 1，d-Diacylglycerol，synthesis，lipozyrne RM IM，fixed bed reactor，water removal 1，3-甘油二酯(Diglyceride，DAG)是油脂的天然 成分，属 GRAS物质，其口感、色泽、风味与普通甘油 三酯(TAG)无异，因而是理想的油脂替代品⋯。1，3． DAG最大特点是食用后不引起肥胖，同时能抑制实 Received：November 16，2004；Accepted：February 3，2005． * Corresponding author．Tel：86-510·5843740；E-mail：Maozg@vip．163．corn 维普资讯 http://www.cqvip.com Chinese Journal ofBiotechnology 生物工程学报 2005，Vo1．21，No．3 验小鼠血清脂质的升高，减少肥胖大鼠内脏中性脂 肪的蓄积 ]。此外 1，3．DAG可调整奶油的熔点、塑 性b]，也可作为起始原料用于合成结构脂质、磷脂、 糖脂、脂蛋白、酶的激活剂、抑制剂等 。对于这 类应用，纯的、特殊结构的位置异构体 1，3．DAG是 必需 的。 1，3一DAG可通过化学方法获得，但近年来更倾 向于采用反应条件温和、专一性强、环境友好的生物 法。此前，我们曾对间歇条件下酶促脂肪酸、甘油酯 化合成 1，3．DAG进行 了研究 。然而在大规模的 生产中，更希望采用连续的填充柱反应器 ，以实 现固定化脂肪酶利用最大化。在此系统中，随着反 应的进行，作为副产物的水分会在反应器中逐步积 累，从热力学平衡的角度考虑会使酯化反应过早进 入平衡态，降低酯化率；作为反应物，水会与甘油竞 争酰基酶中间体，使酯化的产物水解；另外水分过量 吸附进入固定化酶中，会降低酶活，减少酶的使用寿 命。因此及时除去水分是必须的。通常的除水方法 主要有真空蒸发脱水、敞口反应除水、分子筛吸附、 吹干空气法、循环饱和盐水膜分离法等 。¨。”]。然而 对于填充柱反应器，上述方法均受到不同程度的限 制。本实验的主要目的是考察连续酯化反应中过量 甘油吸附脱水的可能性，以探索简便、易行的有效方 法，并对影响酯化率和 1，3．DAG产量的因素进行研 究，确定酶法连续生产甘油二酯的适宜条件。 1 材料和方法 1．1 材料 Lipozyme RM IM(Novozyme Co．广州公司)；亚油 酸(常州奥奇海洋生物有限公司)；甘油(AR级，上海 化学试剂公 司)；甘油酯标 准品 (Sigma Chemical Company，St．Louis，MO)。夹层 反应 柱 (26mm× 400mm，16mm×400mm)，普通 层 析 柱 (12mm× 400mm，7．9mm×400mm)，上海百特科技有限公司； 501型超级恒温循环水浴锅，上海实验仪器厂；81．2 型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器厂；HL．2D定时数 显恒流泵 ，上海沪西分析仪器三厂；TGL-16e台式离 心机，上海安亭科学仪器厂；SHZ．22水浴振荡器，太 仓医疗器械厂；MA 40快速水份测定仪，Sartorius公 司，丹麦。 1．2 方法 1．2．1 固定化酶反应柱的准备：首先在反应器底 部垫少量玻璃纤维防止酶流失，然后取 10g干的 Lipozyme RM IM手动充填入相应的夹层反应柱中， 酶上部再用玻璃纤维塞固定 ，拧紧两端旋帽使反应 器内部呈密封状态。反应器套层连接循环水浴。对 于细口径、无夹层的反应器，应将充填部分完全浸于 水浴中。本实验中所用 Lipozyme RM IM的空体积平 均为 1．80cm ／g，填充量为 10g(除 2．1外)原料在反 应器内的保留时间 t 可由反应器的空体积 与进 料的体积流速 F比值求得。本试验中 Lipozyme RM IM的酶活为940EU／g，1EU表示在无溶剂体系中，一 定温度条件下，每分钟消耗 1ttmol亚油酸所需酶的 微克数。酯化活力测定方法参考文献[7]。 1．2．2 连续酯化方法：首先将原料预热至相应的反 应温度，磁力搅拌混合，同时用恒流泵以一定流速输 入反应器顶部入口，调整保留时间，开始酯化反应。 每次试验前应先用至少 2v0的底物混合物(或正己 烷)冲洗反应器。调整冲洗液流速使得保留时间为 5min(反应器保留时间为反应物在填充柱中平均滞 留时间)，待实现稳定流动后调节流速达到期望的保 留时间，定时取样分析。要求反应液不少于5 ，每 流出 体积的反应液，应取样 1次。 1．2．3 产物的分析方法(I-IPLC／EI_SD法)：A Hewlett packard 1050 HPLC， Column， Shim-pack HRC-Si L (25cm×4．6mm)，Alhech ELSD2000，drift tube temp 90℃。流动相正己烷、异丙醇、乙酸乙酯，组成及梯 度洗脱程序详见 AOCS Cd 1 ld．96_1 。 1．2．4 甘油与固定化酶竞争吸水试验方法：首先 将甘油、脂肪酸用预干燥过的分子筛充分干燥 ，同时 取一定量固定化酶快速灭活，然后测其初始水分含 量。分别称一定量甘油、脂肪酸、固定化酶于道夫管 中混匀，添加既定数量的水，密封，于设定的温度下 水浴，200r／min转速振 荡 1h，然后 300Or／min离心 5min，分别测各组分的水分含量。 1．2．5 水 分含 量 的测定 方 法：水 分 含量 采用 Sartorius公司的 MA40快速水分测定仪测定。 2 结果与讨论 2．1 反应柱内径对酯化率的影响 试验研究了固定化酶 Lipozyme RM IM填充高度 12．5cm、反应温度 60℃、亚油酸、甘油摩尔比为 2：1， 保留时间 12min的条件下，不同内径的反应器对亚 油酸酯化率的影响。试验结果如图 1所示。 通常条件下，对于理想的活塞流反应器，填充高 度与内径的比率对反应程度不应有明显的影响 ¨。 但试验结果表明内径小的反应器有较高的酯化率。 维普资讯 http://www.cqvip.com 孟祥河等：填充床反应器中酶法连续合成甘油二酯的研究 427 U 79 l 2 I b 2．b Inner diamtcr／cm 图 1 反应柱内径对亚油酸酯化率的影响 Fig．1 Effects of the inner diameter of reactor on linoleie acid conversion 由于反应底物(甘油和亚油酸)是互不相溶的，因此 尽管进柱前经过混合，但原料仍呈两相。甘油主要 呈小液滴态分散在油相中。小口径的反应柱可增加 底物接触面积，利于传质，因而反应速度较快。观察 还发现甘油主要存在于反应柱中心，尤其在反应器 入口处，管壁周围甚至不润湿。因此有理由认为柱 壁附近极性的脂肪酶与甘油接触不良是大口径反应 器酯化率低的主要原因。另外，也许由于传质原因， 造成大口径柱偏离活塞流严重，所以出现上述现象。 然而，也不是柱径越细越好，充填高度与反应柱内径 之比过高会增加柱压，不利于工业化生产。因此以 下试验均采用内径 1．6cm的反应柱。 2．2 反应温度的影响 温度效应如图2所示。亚油酸、甘油摩尔 比为 2：1，保留时间 12min。由实验结果不难发现亚油酸 的酯化百分率随温度增加而增加，这是反应速率常 数随温度升高而增大的结果。酯化率随温度的变化 的趋势与间歇反应 基本一致，与之不同的是 70~C 时的酯化率要高于 60~C。这可能是填充柱避免了 机械搅拌对酶稳定性的影响，酶因脱落而热失活损 失减少，因此酯化率高。 图2 温度对连续酯化反应中亚油酸酯化率的影响 Fig．2 Effects of temperature on linoleie acid conversion 2．3 脂肪酸、甘油摩尔比的影响 底物摩尔比对亚油酸的酯化率及甘油酯产物组 成的影响分别如图3、4所示。 图3 底物摩尔比对亚油酸连续酯化反应酯化率的影响 Fig．3 Effects of ratio of linoleie acid to glycerol on conversion Condition：65℃ ，tR：12rain． 0 5 l 0 I 5 2 0 2 5 3 0 Molar ratio oflinoleic acid to glycerol 图4 底物摩尔比对亚油酸酯化产物组成的影响 Fig．4 Effects of ratio of linoleie acid to glycerol on glyeeride composition Conditi0n：65℃；tR：12min； TAG；口 1，2-DAG；■ 1，3-DAG； 日 MAG． 实验发现，底物摩尔比较低时酯化率较高，此现 象可能不仅仅与底物浓度有关 ，也许与过量甘油的 干燥脱水作用有一定关系。当体系中甘油过量时， 将充斥整个反应柱内部空间，由于甘油极性较强，极 易吸收酯化反应产生的水分，因此可能降低了酶颗 粒吸附的水分。本试验中亚油酸、甘油的摩尔比为 0．5时，亚油酸酯化率最高为 65．02％。 图4表明，酯化反应中 DAG是主要产物。DAG 得率高 的原 因可能如下：脂肪酸与甘油首先生成 MAG，MAG是良好的乳化剂，主要存在于油、水界面 处，因而会进一步酯化生成 1，3．DAG。DAG亲油性 强，不能继续停留在油水界面上，而是转移到油相 中，因而很少生成 TAG-J 。此外 1，3．DAG不能(或 很少)直接酯化生成 TAG，而要通过 1，3．，1，2．DAG 异构化，经由 1，2．DAG生成。综合考虑酯化率及 1，3．DAG的含量，选择亚油酸甘油摩尔比以 1：2为 ∞ ∞ ∞ ∞ 加 0 o／0 Ij矗 需 岂 Ioul1Jo 孽 器 ∞ ∞ 们 加 0 ，pu u苗u Pl甚 。lu一0uI一-J0 Iuu譬u 舳 加 ∞ ∞ ∞ ∞ 加 m ∞upl 8 ∞-lo c0Ill∞0厶暑00 如 ∞ 如 加 m O ，pa【J u ∞u PI譬 。lu一0口IIJo 目u3】u 维普资讯 http://www.cqvip.com 428 Chinese Journal ofBiotechnology 生物工程学报 2005，Vo1．21，No．3 宜，这对于连续反应及时脱水、最大限度地利用酶活 力也是有益的。 2．4 流速对连续酯化反应的影响 通常来讲，其它反应条件相同的情况下(反应温 度 65℃，亚油酸、甘油摩尔比为 1：2)，酶与底物接触 越充分，亚油酸的酯化率就越高。进料速度越小，保 留时间越长，酯化率就会越高。这一点在图 5上表 现得更为直观。然而低流速获得的高酯化率是以延 长反应时间为代价的。试验发现流速 1．5mL／min时 平均酯化速度最大，为5．92mmol FFA／ g／h。 图 5 进料速度对亚油酸酯化率、酯化速度的影响 Fig．5 Effects of flow rate on conversion and reaction rate of linoleic acid 口 Per cent linoleic acid esterifled；◆ Average reaction rate． 图6表明，流速低、保留时间长，产物中TAG含 量高，而 MAG含量低。MAG的合成及进一步酯化 受体系中酯化反应生成的水分影响很大。这种限制 在一定程度上可由过量甘油的干燥作用缓解。进料 速度高，保留时间适中时，1，3一DAG得率高。随着保 留时间的进一步延长，生成的 1，3一DAG会在质子酸 碱催化 (非酶催化)作 用下，部分 异构化为 1，2一 DAG ，后者会酯化生成 TAG。尽管异构化反应的 速度较慢，但对 1，3一DAG的终浓度会有一定影响。 1o0 更 耄80 g 6o 重40 ’丽 }20 ，3 0 1 0 26 0．47 075 1 06 1 5 1 96 2 5 3 3．6 Feeding flow rate／(mL／min) 图 6 流速对甘油酯组成的影响 Fig．6 Effects of flow rate to glycerides composition TAG；口1，2-DAG；一1，3-DAG；回 MAG． 2．5 过■甘油脱水效果的研究 2．5．1 不同添加量的甘油脱水效果的研究：本实验 尝试采用过量甘油脱去酯化产生的水分。脱水的目 的一方面是打破反应平衡促使酯化反应向合成方向 移动增加酯化率，然而更重要的是尽量减少固定化 酶吸水，降低酶活损失，实现固定化酶利用最大化。 但酯化温度下(65℃)油相对水分的溶解度是不能忽 略的，要实现较好的脱水效果可能需要较大的甘油 比例。因此添加多少比例的甘油脱水效果最好是我 们亟需考虑的问题。为此我们 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 了如下模拟试 验。 间歇酯化反应时，我们优化的条件为 25mmol亚 油酸、12．5mmol甘 油 (摩 尔 比 为 2：1)，0．2445g LipozymeRM IM(3％，wt％)，65℃反应 。假设亚油 酸、甘油完全酯化，则会生成 25mmol(0．45g)水、 7．75g甘油酯 混合物。本 实验 以 7．75g DAG油、 0．45g水，0．2445g灭活的 LipozymeRM IM替代上述 反应产物，在此基础上分别添加 0，12．5(1．15g)， 37．5(3．45g)，62．5(5．75g)，87．5(8．05g)mmol甘油， 模拟亚油酸、甘油摩尔比分别为 2：1，1：1，1：2，1：3， 1：4时的情形 ，混合后65℃，200r／min水浴振荡 1h，然 后恒温静置分层，测各相水分含量。结果列于表 1。 表 1 甘油的添加■对水分分布的影响 Table 1 Effects of m ount of glycerol on water distribution Molar ratio of linoleic acid to glycerol Water／％ — — 2：1 l：l l：2 l：3 l：4 Note：Lipozyme RM IM with initial water content of 8．0％ ．oil phase with initial water content of 0．1％ ，glycerol with initial water content of 0．12％ ． water mass refer to we Jisht of water absorbed． 亚油酸、甘油摩尔比为 2：1时，原料完全消耗而 无过量甘油存在，因此水分完全被“油相”、固相酶所 吸附。此时固定化酶水分含量高达 31．33％，油相 水分含量为 4．82％。然而随体系中甘油 比例的增 加，这两相中水分含量明显减少。表面看来“水相” 中水分含量也随之在减少，但其绝对吸附量却在增 加，从 2：1时的 0g增加到 1：4时的 0．3832g。另外 据 Novozyme公司产品说明 Lipozyme RM IM水分含 量在 8％ ～10％左右时酶活最高。观察上表中的数 据可以发现，在亚油酸、甘油摩尔比1：2时既可明显 降低油相中水分浓度，保持较高的酶活力，还可提高 反应器单位体积效率，因此确定连续反应中亚油酸、 一心∞傅dJ一 、 。寡寡 口o_l。砖 矗 V^ ∞ 舳 ∞ ∞ 加 O pa 岳 pI譬 0里。口IJJ口 3J 维普资讯 http://www.cqvip.com 孟祥河等：填充床反应器 中酶法连续合成甘油二酯的研究 429 甘油的摩尔比为 1：2。 2．5．2 连续反应中过量甘油对 Lipozyme RM IM稳 定性的影响：图 7是填充柱反应器连续运行 240h过 程中酶活的变化情况。实验条件如下：内径 16mm， 长40cm的填充柱 ，固定化酶填充量 10g，填充高度 12．5cm(空体积 18mL)，反应温度 65℃，亚油酸、甘油 的摩尔比分别为1．5：1(对照组)、1：2(试验组)，进料 速度 1．2mL／min．每 24h测一次酶活力。图中两条 直线的斜率代表酶的失活常数，斜率越大，表明酶失 活越快。底物摩尔比为 1．5：1时，酶稳定性很差，可 能是由于酯化产生的水份沉积到酶表面所致。 o 50 loo l50 200 250 ，／|l 图7 过量甘油除水对连续反应中酶稳定性的影响 Fig．7 Effects of water removM with excessive glycerol on the stability of Lipozyme RM IM in fixed-bed reactor ◆ R=0．5；o R=1．5． 连续运行 10 d后 ，酶活损失接近一半，而过量 甘油组(摩尔比为 1：2)的酶活力仍在 80％以上。由 此可见，填充柱反应器中过量甘油脱水对延长固定 化酶的使用寿命是简便有效的。 3 结 论 无溶剂条件下、填充柱反应器中利用 Lipozyme RM IM催化亚油酸、甘油连续合成 1，3．DAG是可行 的。实验发现反应器的长径比、反应温度、底物摩尔 比、进料速度不仅影响脂肪酸的酯化率而且影响产 物的组成。另外研究表明过量底物甘油脱水简便易 行，可有效提高固定化酶的稳定性，连续运行 10 d 后，酶活仍在 80％以上，而对照组仅为 52％。 REFERENCES(参考文献) [2] Meng XH(孟祥河)，Gao BJ(高保军)，Mao ZG(毛忠贵)et口z． Application of diacylslycerols．China FoodAdditives(中国食品添 加剂)，2002，153(4)：58—61 Naito S，Watanabe H， Shimasaki H et a1． Effect of Dietary Diacylslycerols on Lipids Metobilism in Human：1．The suppressive effect of dietary diacylslycerols on the increase of the seFum triSlY cefides．16 International Congress of Nutrrition．Montrea1． Canada，1997，PP．341 [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1O] [12] [13] 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