医学硕士答辩欧琴答辩

EBV LMP2 B细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究 温州医学院2004级硕士学位论文 答辩 答辩ppt下载中国建筑转正答辩ppt下载民事答辩状范文下载毕业答辩毕业答辩模板 答辩人：欧 琴 导 师：张丽芳 教授 夏克栋 教授 专 业：病原生物学 2007.5.17 主 要 内 容 ◆ 研究背景 ◆ 研究目的 ◆ 研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ◆ 结 果 ◆ 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 与讨论 ◆ 结 论 EB病毒(Epstein-Barr virua,EBV)属于γ疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。 研 究 背 景 中国南方高发的NPC 研 究 背 景 肿瘤 亚型 EBV阳性率 表1 EBV相关的增生性疾病 Burkitt淋巴瘤 E-BL 100% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100% NPC 低分化或未分化 100％ 霍奇金病 mc/ld 80%-90% ns 30％ T细胞淋巴瘤 fatal IM 100% AILD 40% 淋巴母细胞瘤 fatal IM 100% 与器官移植相关 100％ 与AIDS相关 70％-80% 因此，研制EBV疫苗用于预防和治疗EBV相关的疾病正成为一个热点。 研 究 背 景 LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。 LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想 靶抗原之一。 Jaikumar Duraiswamy等以腺病毒为载体构建了含LMP2多个CTL表位的重组体，在HLA A2/Kb小鼠体内能诱导出强烈的特异性CTL反应。对于LMP2所引起的体液免疫反应也有报道，在NPC患者体内存在较高滴度的LMP2抗体，但有关具体的B细胞表位的研究未见报道。 肿瘤体液免疫：激活补体系统融解肿瘤细胞；ADCC;抗体的调理作用（吞噬细胞在有抗体存在的情况下，可通过调理作用即经其表面Fc受体更加强的吞噬结合了抗体的肿瘤细胞）；抗体封闭肿瘤细胞上的某些受体；抗体使肿瘤细胞的黏附特性改变或丧失。 研 究 背 景 表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。 多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。 表位疫苗，包括合成肽疫苗、重组表位的多价疫苗及表位核酸疫苗。 表位疫苗能诱生特异性免疫应答，避免了不同免疫优势抗原表位的互相干扰和抑制性抗原表位的免疫抑制，免疫应答将具有更强的特异性和更高的免疫效果, 是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。 有报道，疟疾的表位疫苗必须是同时含有B 细胞和T 细胞表位多价的表位疫苗。 研 究 背 景 NPC患者血清中能检测LMP2抗体。 B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提 供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽 抗原可用于血清学检测。 研 究 目 的 1. 预测EBV LMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。 2. 分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。 3. 将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。 研 究 方 案 一、EBV LMP2的二级结构分析 和B细胞表位预测 研 究 方 案 采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索 LMP2完整蛋白质的氨基酸序列 (http://www.expasy.org/sprot/); 采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法 预测LMP2二级结构(http://www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域 (http://www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服务器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、 Zimmerman方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及 柔韧性参数(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) ； 对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的B细胞表位，并 用吴玉章等建立的抗原性指数(AI) 综合评判EBV LMP2的B细胞优势 表位。 ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ 生物信息学方法预测， EBV 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 株(B95-8) 研 究 方 案 二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、 表达及其融合蛋白的纯化 研 究 方 案 引物设计与合成 退火获得目的基因 pET32a (+)/EBV-LMP2 B细胞表位重组质粒的构建 纯化、连接、转化DH5α大肠杆菌 转化BL21大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白 SDS-PAGE、Western blot分析 pET32a (+)质粒酶切 酶切、测序鉴定 目的基因的获得，优化 研 究 方 案 引物 碱基序列 酶切位点 OZLF-67 5’TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAA BamHI AGGGCGGATCTTCGATGCGG 3’ OZLF-68 5’GATCCCGCATCGAAGATCCGCC XhoI CTTTAACAGCCTGCTGTAAC 3’ OZLF-69 5’TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG 3’ BamHI OZLF-70 5’GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC 3’ XhoI OZLF-71 5’TCGAGTTAATTCGGGATAAATTC BamHI TGTGCTGGACAATGATTTG 3’ OZLF-72 5’GATCCAAATCATTGTCCAGCACA XhoI GAATTTATCCCGAATTAAC 3’ 图1 pET32a/B细胞表位的重组质粒图 研 究 方 案 研 究 方 案 层析纯化蛋白： 灌 胶 Buffer B液调节吸光度和透光度 样本处理 样本加入层析柱中，收集滤液 Buffer B液洗涤，至A＜0.01，收集滤液 Buffer D液洗涤，至A＜0.01，收集滤液 Buffer E液洗涤，至A＜0.01，收集滤液 样本收集 SDS-PAGE分析滤液中目的蛋白分布情况 Buffer B: 8M尿素(pH8.0) Buffer D: 8M尿素(pH6.8) Buffer E: 8M尿素(pH4.0) 在pH值为8.0的8M尿素溶液中，带有His的蛋白与Ni-NTA树脂的结合能力大大强于未带His的蛋白，非特异性结合在应急条件下易被洗脱；在用pH值为6.8的8M尿素洗涤液洗涤时，与Ni-NTA树脂结合的带有His残基的内源性蛋白在应急条件下被洗脱；在用pH值为4.5的8M尿素溶液洗涤时，带有His.Tag的蛋白质子化，His.Tag不再能与Ni＋结合，从Ni-NTA树脂中分离出来，获得了纯化的表位融合蛋白。 研 究 方 案 三、EBV LMP2 B细胞表位融合蛋白 免疫原性的初步研究及血清学检测 动物：ICR小鼠 免疫方式：背部皮下多点注射 采血方式：眶静脉采血，3只/组 研 究 方 案 以纯化的融合蛋白作包被抗原 以B95.8细胞作包被抗原 选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体 研 究 方 案 ELISA检测： 结 果 一、EBV LMP2的二级结构 分析和B细胞表位预测 结 果 H:α-螺旋；e:β-片层；c:无规卷曲；-:未预测结构；t:β-转角 图2 EBV LMP2二级结构预测 α-螺旋、β-折叠的化学键键能比较高,能够较牢固地维持蛋白的高级结构，但很难合适地与抗体嵌合，且经常处于蛋白质的内部，因而很少可能成为抗原表位所在区域。而β-转角及无规卷曲等柔性结构比较松散，易于发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白的表面，成为抗原表位的可能性较大。 结 果 aa 144～150 202～208 265～268 318～322 375～390 445～455 图2 按SOSUI程序预测EBV LMP2蛋白跨膜区 膜内区域 跨膜区 膜外区域 结 果 图3 各种不同参数对EBV LMP2的预测结果 a.亲水性参数 b.极性参数 c.柔韧性参数 d.表面可及性 e.抗原性 二级结构 10～82,89～108,116～126,142～149,198～206,288～295,317～321, 339～348,379～389,414～422,481～497 膜外区域 144～150,202～208,265～268,318～322,375～390,445～455 亲水性 15～26,36～41,43～60,65～74,90～96,101～119,176～179,199～205, 236～242,414～416,483～492 表面可及性 13～18,20～22,25～32,39～64,67～82,90～92,95～112,114～116,73 ～178 199～201,203～204,235～240,378～380,383～384,416 ～420,484 ～496 抗原性 10～83,88～109,111～121,174～179,198～207,235～241,290～293,340 ～ 348,380～387,413～421,471～476,483～491 极性 20～23,45～55,57～59,65～74,90～94,102～117,198～203,234～342,483～491 柔韧性 10～85,89～121,199～205,218～222,236～244,289～296,342～347,370 ～378,381～383,385～388,412～420,483～493 预测方法 预测结果 结 果 表3 应用不同方法预测EBV LMP2 蛋白B细胞表位的肽段位置 142～150、198～209、317～322、378～391 结 果 145～150 TASVST 0.005 199～209 RIEDPPFNSLL 0.037 318～322 TLNLT 0.036 381～391 KSLSSTEFIPN 0.028 B细胞表位区域 氨基酸序列 抗原性指数 表4 EBV LMP2的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数 二、EBV LMP2 B细胞表位的克隆、 表达及其融合蛋白的纯化 结 果 结 果 图4 重组质粒pET32a/ozlf-67酶切鉴定 1:λDNA/HindⅢ DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 图5 重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定 1:λDNA/HindⅢ DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 图6 重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定 1:λDNA/HindⅢ DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-71; 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I 重组质粒酶切鉴定 结 果 测序结果 图7 3个重组的目的基因的测序图 结 果 B细胞表位融合蛋白鉴定 图8 B细胞表位融合蛋白表达产物 SDS-PAGE和Western-Blot分析 1:蛋白分子标准物； 2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达； 6: BL21 His抗体 结 果 ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化 图9 纯化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-7：Buffer E液滤液 图10 纯化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-8：Buffer E液滤液 图11 纯化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5-6：Buffer E液滤液 图12 纯化的His蛋白SDS-PAGE电泳分析 1：蛋白分子标准物； 2：样品穿透液； 3：Buffer B液滤液； 4：Buffer C液滤液； 5：Buffer E液滤液 结 果 结 果 三、EBV LMP2 B细胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究 结 果 图13 不同免疫原在不同时间的抗体均值（X±SD） 分别包被3种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分别 检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效 价差异。 结 果 图14 多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果 * * ：与His蛋白免疫组比较 * * 结 果 B95.8细胞作为包被抗原，ELISA检测3种表位融合 蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。 图15 B95.8细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价 * ：与His蛋白免疫组比较 * * * 结 果 选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC组、 CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。 图16 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价 * ：与正常组比较 * 结 果 表5 ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率 * *与正常组比较 * 分 析 与 讨 论 预测的B 细胞表位是线性B 细胞表位，主要 的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及 性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形 成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种 因素综合作用的结果。 吴玉章等综合考虑蛋白质的许多性质，如片段的活动性、结构、构象和氨基酸侧链的排列等，建立了抗原性指数预测方法，用以筛选B细胞优势表位。 分 析 与 讨 论 采用分子生物学方法分别得到了包含预测 表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为 进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。 分 析 与 讨 论 3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性 B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体 以B95.8细胞作为抗原包被酶标板， B细胞表位 融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异 　性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位 肽的结合能力较弱。 分 析 与 讨 论 选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC患者血清特异性抗体，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。 结 论 1.预测EBV LMP2的B细胞表位可能位于其N端199～209、318～322和381～391区段； 2. 分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a(+)/ozlf-67、pET32a(+)/ozlf-69和pET32a(+)/ozlf-71；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。 3. 表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与EBV抗原结合。 4.Ozlf67蛋白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。 首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教 授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的 悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚 挚的敬意和感谢！ 感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台 全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老 师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学 等对我实验的帮助及生活的关心！ 我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我 强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生 感激！ 最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家 教授在百忙之中对本文的指导！ 致 谢 值此论文完成之际向所有曾经关心、帮助过我的老师、同学致以深深的谢意。 感谢所有帮助过我的人！谢谢你们！ 中国南方高发的NPC 因此，研制EBV疫苗用于预防和治疗EBV相关的疾病正成为一个热点。 Jaikumar Duraiswamy等以腺病毒为载体构建了含LMP2多个CTL表位的重组体，在HLA A2/Kb小鼠体内能诱导出强烈的特异性CTL反应。对于LMP2所引起的体液免疫反应也有报道，在NPC患者体内存在较高滴度的LMP2抗体，但有关具体的B细胞表位的研究未见报道。 肿瘤体液免疫：激活补体系统融解肿瘤细胞；ADCC;抗体的调理作用（吞噬细胞在有抗体存在的情况下，可通过调理作用即经其表面Fc受体更加强的吞噬结合了抗体的肿瘤细胞）；抗体封闭肿瘤细胞上的某些受体；抗体使肿瘤细胞的黏附特性改变或丧失。 表位疫苗，包括合成肽疫苗、重组表位的多价疫苗及表位核酸疫苗。 表位疫苗能诱生特异性免疫应答，避免了不同免疫优势抗原表位的互相干扰和抑制性抗原表位的免疫抑制，免疫应答将具有更强的特异性和更高的免疫效果, 是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。 有报道，疟疾的表位疫苗必须是同时含有B 细胞和T 细胞表位多价的表位疫苗。 生物信息学方法预测， EBV标准株(B95-8) 目的基因的获得，优化 在pH值为8.0的8M尿素溶液中，带有His的蛋白与Ni-NTA树脂的结合能力大大强于未带His的蛋白，非特异性结合在应急条件下易被洗脱；在用pH值为6.8的8M尿素洗涤液洗涤时，与Ni-NTA树脂结合的带有His残基的内源性蛋白在应急条件下被洗脱；在用pH值为4.5的8M尿素溶液洗涤时，带有His.Tag的蛋白质子化，His.Tag不再能与Ni＋结合，从Ni-NTA树脂中分离出来，获得了纯化的表位融合蛋白。 α-螺旋、β-折叠的化学键键能比较高,能够较牢固地维持蛋白的高级结构，但很难合适地与抗体嵌合，且经常处于蛋白质的内部，因而很少可能成为抗原表位所在区域。而β-转角及无规卷曲等柔性结构比较松散，易于发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白的表面，成为抗原表位的可能性较大。 142～150、198～209、317～322、378～391 His抗体 吴玉章等综合考虑蛋白质的许多性质，如片段的活动性、结构、构象和氨基酸侧链的排列等，建立了抗原性指数预测方法，用以筛选B细胞优势表位。 值此论文完成之际向所有曾经关心、帮助过我的老师、同学致以深深的谢意。 感谢所有帮助过我的人！谢谢你们！