高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）
HPLC应用
一、样品测定
1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．
记录
混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载
时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）
5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：
①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。
⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。
二、方法研究
1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。
2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。
附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则
一、对起草单位的要求：
1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立HPLC法的依据及参考文献。
2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。
3．建立方法时，应考虑下列事项：
①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。
②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。
③尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。
④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物质化学结构相似，理化性质接近，峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题。
⑤检测器首选UV检测器。
4．采用HPLC法进行有关物质检查时，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法。
5．HPLC法用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次，计算相对标准差（RSD应不得大于l.5％）。
二、对复核单位的要求：http://hplc2.blog.163.com/blog
1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。
2．当HPLC法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验。
3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价。
4、流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
常用的脱气方法比较：
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。
在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
1、为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
样品过滤头的类型：
30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。
13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。
3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？
HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.
清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。
高效液相色谱级乙腈的质量评价
信息来源：液色迷人
摘要: 高效液相色谱（HPLC）分析中，流动相溶剂的纯度和质量对分析结果和仪器本身都有重要影响。溶剂中的各种痕量杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性定量分析结果，而且可能会污染分离柱和堵塞系统，造成仪器出现故障。了解HPLC溶剂规格和相关的测试方法，可以帮助HPLC 用户评价和筛选HPLC溶剂，减少溶剂杂质对应用造成的负面影响。本文介绍了基于紫外（UV）吸收和HPLC梯度确定HPLC级乙腈纯度和质量的两种
规范
编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载
方法及其对HPLC分析的意义，并探讨了这两种方法的实际应用。
乙腈区别于其他HPLC溶剂的独特性质（中等洗脱能力、强溶解能力、能够得到明确的色谱峰、低粘度、相对于醇类和酯类有较低的UV吸收）[1]，使其成为 最常用的有机流动相组分。乙腈一般是（由氨和丙烯）大规模生产丙烯腈的副产物。其中可能含有多种很少量的杂质，例如丙烯腈、α(β)-甲基丙烯腈、顺/反 式丁烯腈、乙醛、丙酮、甲醇、乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、恶唑和乙酸[2-4]。经过复杂的纯化过程，痕量的上述杂质可能仍然存在于HPLC级 乙腈中。其中一些杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性定量分析，而且会污染分析柱、堵塞系统，导致仪器出现故障。
作为美国分析试剂标准测试方法的权威，美国化学学会（ACS）分析试剂委员会在《试剂化学品》（第9版）中明确定义了HPLC级乙腈的技术说明，包括通用 的说明和HPLC的适用说明。通用的说明包括气相色谱（GC）纯度、水、滴定酸或碱、以及挥发残留物。HPLC的适用说明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脱基线[5]。
本文详细介绍了乙腈的两种适用于HPLC的规范方法及其对HPLC应用的意义，并通过详尽的实验数据讨论了操作中的注意事项以及影响测试结果的因素。
1 实验
1.1 仪器
本文中使用了两种HPLC系统，其特定条件介绍如下：Agilent 1100 HPLC系统由脱气机（G1379A）、四元泵（G1311A）、自动进样器（G1315A）和二极管阵列检测器（DAD）（G1315B） （Agilent Technologies, Wilmington, DE）组成，并用该系统获得图1和图2的结果。其他色谱图由Alliance 2695 HPLC系统和2996 光电二极管阵列（PDA）检测器(Waters, Milford, MA)获得。ZORBAX C18柱由Agilent提供；B&J C8柱从Honeywell Burdick & Jackson获得。
UV光谱使用Cary 4000 UV-VIS 分光光度计（Varian, Palo Alto, CA）。参比池为1 cm石英池，样品池为1 cm或5 cm石英池。
1.2 药品和试剂
HPLC级乙腈来自Honeywell Burdick & Jackson 及其他HPLC溶剂供应商。高纯水由Milli-Q超纯水系统（Millipore, Bedford, MA）和Honeywell Burdick & Jackson供应。乙酸（AR）由Sigma（St. Louis, MO）提供。
2 结果和讨论
2.1 HPLC级乙腈UV吸收规范的意义
UV吸收背景对HPLC乙腈的关键性源于两个原因。首先，大部分有机杂质都会产生UV吸收。乙腈的UV吸收越小意味着其中杂质含量越少。第二，HPLC仪器最常用的检测模式就是UV检测。因此乙腈的UV吸收越小，色谱的基线背景越低；从而灵敏度越高，检测限越低。
图3是来自不同供应商的HPLC级乙腈的UV光谱，尤其是在短波长范围（300~190 nm）并不相同。这可能是由于乙腈中难以去除的杂质因各溶剂供应商使用的纯化技术不同而不同。鉴于使用UV检测器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下检测，因此大部分溶剂供应商在上述波长范围内设立UV吸收规范。
2.2 影响UV吸收测量值的因素
在测试实验中，很多因素会影响UV吸收的测量值：
（1）光路距离（比色皿长）。在0.2~0.8 AU范围内，吸光率（A）的测量值误差最小，否则吸光率的测量误差会相对大些。如使用1 cm比色皿，即使在250～210 nm的短波长范围内，乙腈的吸光率也远小于0.2 AU，因此可能产生很大的误差。根据比尔定律，溶剂的吸光率和样品的光路距离成正比，因此增加样品池长度会使溶剂吸光率增加，使其值进入0.2~0.8 AU范围内，从而减小测量误差。使用5 cm比色皿，在400~190 nm扫描范围内得到不同乙腈样品的UV光谱（如图4所示）。从图4中曲线可以发现，使用5 cm比色皿可使乙腈在低波长的大部分UV吸光率进入0.2~0.8 AU范围，从而显示出数据的准确度更高。而且，不同乙腈样品的UV吸光率的差别与使用1 cm比色皿时相比更明显。鉴于这一点，Honeywell Burdick & Jackson等一些生产商使用1 cm和5 cm两种比色皿建立UV吸收规范。
（2）仪器参数。由于乙腈的吸光率非常低，仪器参数的设定要保证最佳的灵敏度和准确度。双光路模式可以克服单光路模式中光源能量随时间变化的缺点，并且可以更方便地扫描UV全波长范围。使用分光光度计的基线校正功能，可以去除由光源、检测器和样品池等引入的仪器变化[6]。由于仪器噪声随着扫描速度的提高 而增大，因此推荐使用最大扫描速度的一半。
（3）参比物。用于溶剂UV吸收测定的参比物有两种可能。《试剂化学品》（第9版）使用水作为参比；而《中国药典》使用空气作为参比。使用空气作为参比时测定的乙腈UV吸收值低于使用水作为参比时测定的值，而且在400~250 nm波长的范围内通常为负值。这是由于空气中氧和二氧化碳的贡献使其UV吸收强于水。如图5中所示，由于参比不同造成的UV吸收有显著不同，高达 0.03 AU，所以当我们阅读供应商提供的分析报告证书时需要了解究竟是使用水还是使用空气作为参比。
推荐使用新鲜的HPLC级瓶装水或者实验室超纯水系统制得的超纯水作为参比物。值得注意的是，实验室超纯水系统制得的新鲜水常常含有大量的气泡，这些气泡需要在实验前去除，否则会影响数据的准确度。
（4）氮气喷雾。为了延长溶剂的保存时间，一些HPLC溶剂供应商将惰性氮气充入溶剂。作者研究了氮气对乙腈UV吸收的影响（图6）。结果发现经过氮气喷 雾，乙腈在250~200 nm范围内的UV吸收显著降低。200 nm处的吸光率为0.012，是氮气喷射前的四分之一。其原因可能是氮气在乙腈中的溶解度远小于氧气和二氧化碳。氮气喷雾减少了氧气和二氧化碳对乙腈UV 吸收的贡献。（注意：也可能是由于氧气和溶剂形成了电荷传递复合物导致了UV吸收。）
（5）溶剂的挥发性。由于乙腈是一种挥发性溶剂，如果样品池和参比池在测试过程中是敞开的，那么样品池中的乙腈蒸汽可能会进入样品室或参比池，结果造成吸光率读数偏低。因此，推荐在实验中用聚四氟乙烯（PTFE）盖子将这两个池都盖住。
2.3 HPLC级乙腈空白梯度洗脱规范的意义
如果溶剂中的杂质水平低于1 ppm，简单的UV光谱通常检测不到其存在[1]。然而，这些痕量杂质可能在有机相和水相比例较低时在柱上富集并保留，然后当梯度过程中流动相洗脱能力增强时被洗脱下来，从而形成鬼峰[7]。因此，HPLC空白梯度洗脱基线上的鬼峰高低，是评价HPLC级乙腈质量的关键规范方法。它清楚地表明了乙腈中是否 含有影响梯度洗脱模式下HPLC分析的痕量的杂质。
《试剂化学品》（第9版）明确规定214 nm处HPLC空白梯度洗脱基线的最大峰高应低于5 mAU。具体的测定方法如下：C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；梯度：0 min，80% 水（溶剂A），20% 乙腈（溶剂B），保持30 min；在50 min时达到 100% B，保持10 min；流速2 mL/min。样品运行3次，并去掉第1次运行的结果[5]。图7比较了B&J ACS/HPLC和几种国内色谱级乙腈样品的ACS空白梯度洗脱基线。结果表明，一些本地产色谱级乙腈样品在254 nm时会产生高达20 mAU的鬼峰。这说明即使在254 nm处，这些国产试剂也可能在HPLC常规分析中产生干扰。
在HPLC的一些实际应用中，往往需要在更低波长处使用梯度洗脱模式以实现高灵敏度的HPLC分析，因此对乙腈的HPLC空白梯度洗脱规范提出了更高的要 求。为了满足高灵敏HPLC应用的要求，一些溶剂供应商也生产梯度级HPLC乙腈。这种乙腈不同于用于等度洗脱HPLC分析的乙腈，它们可以满足更严格的 梯度洗脱规范。例如，Honeywell Burdick & Jackson的空白梯度洗脱基线规格为：254 nm时低于1 mAU，215 nm时低于5 mAU。图1中，在215 nm下，不同供应商的梯度级乙腈的梯度洗脱基线不同，说明它们用于低波长梯度洗脱模式痕量HPLC分析的质量不同。
2.4 影响空白梯度洗脱基线测定的因素
由于操作和HPLC系统本身的复杂性，系统中的任何部分都可能成为梯度洗脱基线鬼峰的来源，因此在实验过程中应十分注意降低HPLC系统和水相的干扰。
（1）HPLC系统污染和流动相添加剂的影响。梯度洗脱过程中，任何有UV吸收的杂质都可能产生鬼峰。除了HPLC进样系统和色谱柱的污染，样品溶剂和流 动相的不匹配也会产生鬼峰。图8为当100%乙腈样品进入系统中，乙腈和水梯度运行色谱图中开始处可能产生正或负的鬼峰。因此进行空白梯度洗脱基线测定 时，为了去除可能来自进样系统的干扰而不予以进样。测试前色谱柱应彻底洗净，或者使用一根专门用来做这个实验的色谱柱来避免来源于色谱柱的交叉污染。
HPLC分析的实际应用中，常向流动相中加入一些添加剂来改善分离和峰形。然而，这些添加剂也可能成为梯度洗脱基线鬼峰的来源。图9中可见，水相中加入乙酸会导致梯度洗脱基线中有鬼峰。因此，乙腈空白梯度洗脱基线测定操作中，只用水和乙腈作为流动相而不加添加剂。
（2）HPLC系统中气泡的影响。溶剂中的气泡经过HPLC系统也可能产生鬼峰（图10）。这种鬼峰和典型的杂质峰不同，它们是鱼翅形：其前边缘很锐，然 后几乎线性下降至基线。在线压力监测系统显示，鬼峰形成时有很快的系统压力降（图11），更进一步证明这些鬼峰的形成是由于系统压力的瞬间快速降低而不是 由于杂质的存在。参考文献[7]和[8]详细解释了气泡如何导致了这种鬼峰的生成。
因此，当进行空白梯度洗脱测试时，需要确保HPLC系统中的气泡完全除净、脱气机正常工作并且流动相充分脱气，从而保证系统中没有气泡。
（3）流动相中水的影响。水相也是空白梯度洗脱基线中鬼峰的一个重要来源。实际上，空白基线洗脱基线中的大部分鬼峰来源于水相[9]。在消费者处进行的一 次HPLC梯度洗脱基线操作中发现使用不同品牌的乙腈时，17.5 min处都有一个很高的鬼峰，说明这是由消费者的水净化系统引起的（图2）。许多分析实验室常使用商品化饮用水或蒸馏水作为HPLC分析的流动相。实际 上，水的塑料容器常会促进细菌的生长，容器中的添加剂也可能会溶入水中，从而导致梯度洗脱模式中出现鬼峰。因此，推荐使用由HPLC溶剂供应商提供的商品 化瓶装HPLC级水，或超纯水系统制备的用于HPLC的水。图12表明新鲜的B&J ACS/HPLC水和来自Milli-Q系统的超纯水都能满足高灵敏度HPLC梯度洗脱测试规格。
但应该注意的是，空气中的污染物也可能进入到瓶装HPLC水中，一旦盖子打开一段时间后可能会长菌。图12显示，开瓶一周的棕色瓶装HPLC水的梯度洗脱 基线严重漂移，并且相比于新鲜HPLC水，其峰的数量和峰高都显著增加。因此，瓶装HPLC级水一旦打开，最好在两天内使用。至于Milli-Q超纯水， 应注意的是超纯水系统中的柱子和UV灯是消耗品，当到达使用寿命时需要更换;否则水中的总有机碳（TOC）可能显著增加，从而在梯度洗脱测试中产生干扰 [9]。
为避免柱内的流动相“疏水性塌陷”，梯度洗脱中初始流动相组成不使用100%水，而使用较低的有机相/水相比例（根据不同的HPLC溶剂供应商，通常为 10%~30%乙腈）。如果鬼峰是由流动相造成的，峰高会随着初始有机相/水相比例的持续时间而变大。为了进一步确定鬼峰是来自乙腈或水，可以改变初始有机相的比例。如果鬼峰随着初始有机相比例增大而增大，那么其来源应为乙腈；反之则来源于水。图13中，鬼峰高随着平衡时间增加，所以这些鬼峰全部来自于流动相。如果考察不同初始有机相比例的两个梯度洗脱基线，当初始有机相比例从20%增至30%时，48~52 min范围内的鬼峰增多，40~46 min范围内的鬼峰消失。这说明前一个来源是乙腈而后一个是水。
（4）过滤造成的流动相污染。为了避免流动相中可能存在的颗粒造成HPLC系统堵塞，HPLC仪器供应商通常推荐对流动相进行微过滤。然而，操作不小心或者微过滤装置本身都可能会向流动相中引入杂质。一方面，商品化过滤膜的质量差别很大，并且（尤其是用尼龙或高密度聚乙烯制作的）过滤膜本身可能引入更多颗 粒或含有可被乙腈萃取的物质；另一方面，一般的实验室条件下，很难保证过滤过程中过滤装置的玻璃器皿部分完全没有颗粒。使用0.45 μm尼龙支撑的的疏水PTFE膜过滤乙腈，空白梯度洗脱基线中45 min处会出现高达50 mAU的鬼峰（图14）。尽管污染的来源还需要进一步确认，这仍可说明实验室中微过滤操作引起污染的风险很高。因此，推荐在HPLC梯度洗脱评价测试中直 接使用由生产商提供的原装瓶里的乙腈，而不增加其他处理操作。
3 结论
UV吸收和HPLC空白梯度洗脱基线是HPLC级乙腈的两个关键规格。由于UV区域内乙腈的吸收很低，推荐使用双光路模式、基线校正和适当增加比色皿长度来获得更加准确的结果。另外，参比物质、溶剂是否经过氮气喷射以及溶剂本身的挥发性也可能影响测试结果。相比于UV吸收，HPLC空白梯度洗脱基线评价可 以为应用于HPLC梯度的乙腈质量提供更加精确和实用的评价。测试中需要考虑多种实际方面来确保获得准确可靠的测试结果；来自于HPLC系统、流动相添加 剂和水相的污染，以及附加的过滤操作都需要避免；系统中的气泡也要除净。
操作
心得
信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会
操作过程：
1、 开机操作：
（1）、打开电源
（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时，打开工作站，先打开在线工作站；打开离线状态的工作站可以离线处理图谱与出报告
（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；提到异丙醇溶液，我还学到一点就是，在用完反相后要换成正相时，我们需要用异丙醇过度30分钟左右，然后在换上正相柱
（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；
（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。
2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间，如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相，正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；
3、 建立色谱操作方法，注意保存为自己清楚的方法名，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；
4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
5、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；
6、 实验结束后，如果有盐一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。如果是一般的溶剂系统就直接用甲醇冲洗，冲洗过程中关闭D灯、W灯；以延长灯的寿命
7、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；
8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。未经操作培训，不得擅自使用仪器。
流动相：
1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；
3、 使用双泵时，最好不要有机相与水相直接调用，这样可能造成管路气泡，最好我们根据自己的需要配制一定浓度的有机相与水相的混合溶液，再与水相混合调用
4、换流动相后，要purge
样品：
1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、 用流动相或比流动相弱的溶剂制备样品溶液，若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小，尽量用流动相制备样品液； 手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
色谱柱：
1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的
说明书
房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载
，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；2、 使用符合要求的流动相；
3、 使用保护柱；
4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。
5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇或乙氰冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、 不要高压冲洗柱子；
7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱，使用硅胶柱时还要特别小心流动相的PH范围在2~8之间；使用过程中注意轻拿轻放。
8、上柱时我们要注意柱子的方向，千万不要装反了
高效液相色谱法的分类及其分离原理
高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）
固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制
吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：
X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相）
其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为：
K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。
K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相
常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。
对流动相的基本要求：
试样要能够溶于流动相中
流动相粘度较小
流动相不能影响试样的检测
常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用
常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）
将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制
溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。
液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液
K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。
②正相色谱和反相色谱
正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。
反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。
一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。
③液-液色谱法的固定相
常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非极性的十八烷（ODS）和异二十烷（SQ）等。
缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉。
采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。
使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成Si-O-Si-C型键，把固定液的分子结合到担体表面上。
优点：
化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失。
固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能。
固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提。
④液-液色谱法的应用
液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。
3.离子交换色谱法
原理：离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换，由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力（作用力）而被分离。
①离子交换色谱法的作用机制
聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：
离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。交换达到平衡时：
K值越大，保留时间越长。
②溶剂和固定相
两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。
多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。
薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨胀或压缩；缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。
③离子交换色谱法的应用
主要用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。
广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。
4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）
凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。
①凝胶色谱法的作用机制
体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。
凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。
②凝胶色谱法的固定相
软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。
③凝胶色谱法的应用特点
保留时间是分子尺寸的函数，适宜于分离相对分子质量大的化合物，相对分子质量在400～8×105的任何类型的化合物。
保留时间短，色谱峰窄，容易检测。
固定相与溶质分子间的作用力极弱，趁于零，柱的寿命长。
不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上时才能得到分离
高效液相色谱的类型
（一）吸附色谱
在吸附色谱中，样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非极性烃基几乎不予保留。所以，要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。通常，样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的，强离子样品是不适宜的。
吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础，按照样品的极性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的浓度为１０％或更少一些。如有可能，可进一步减小百分数。因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性，减弱吸附能力，并使重现困难。
（二）分配色谱
１. 正相分配色谱
正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品，但正相分配色谱不适合于离子型物质。
２.反相分配色谱
这种方法目前应用非常广泛，应用的范围也很广，在反相分配色谱中，样品的非极性部分起保留作用。
通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈，通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离，但如果样品带有离子型基团，需要在流动相中加入盐或调节流动相的ＰＨ值，例如，如果样品有一个—ＣＯＯＨ 基团，使流动相的ＰＨ值是偏向酸性的，由于抑制了—ＣＯＯＨ基团的电离而加强了保留。这个方法叫离子抑止法，如果样品有强离子基，有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。
在调节ＰＨ值中，保持ＰＨ值在填料说明书手册中所规定的范围内，大多数化学键式的二氧化硅使用在ＰＨ＝２-９，然而，当加入盐以后，最好使其ＰＨ＝７.５-８或更小的，多孔聚合物填料能应用非常广泛的ＰＨ值。
（三）离子交换色谱
这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的，按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。
离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。在离子交换色谱中，流动相的盐的浓度、ＰＨ及盐的种类等都对保留值有很大的影响。在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器，在高效液相色谱中不能使用ＮａＣＩ或其他的氯化物盐类。根据测量波长有些盐也不能使用，例如，醋酸吸收大约在２１０ｎｍ，当检测处在短波端的时候，用醋酸作流动相是不合适的。
（四）凝胶色谱
凝胶色谱不同于以上三种分离方法。凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。
因为在样品中，小尺寸的分子深深地渗透到微孔中，所以迟流出，而大尺寸的分子没有渗透到微孔中，就很快流出。通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相，叫做凝胶渗透色谱。
凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。
１.凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱（Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＰＣ。此一类的色谱，使用于有机性溶媒的样品中，如ＰＶＣ，ＰＳ，ＡＢＳ等等，而所用的洗脱液有ＴＨＦ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ等等。
２.凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｒｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ），简称ＧＦＣ。此一种类的层析法，使用于水溶媒的试剂中，如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、缓冲液等等。
凝胶的种类很多，按其原料来源可分为有机胶和无机胶。按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。
[编辑本段]
高效液相色谱法在分析检测上的应用
食品中山梨酸、苯甲酸的测定
１. 原理
样品加温除去二氧化碳和乙醇，调ＰＨ至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。
２.试剂和溶液
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水，溶液为水溶液。
（１）甲醇：优级纯，如果是分析纯，需重蒸。
（２）稀氨水：１+１ 溶液，氨水加水等体积混匀。
（３）０.０２ｍｏｌ／Ｌ乙酸铰溶液：称取１.５４ｇ乙酸按，加水至１０００ｍＬ，溶解，经滤膜（０.４５ｍ）过滤。
（４）２０ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液：称取２ｇ碳酸氢钠（优级纯）加水至１００ｍＬ，振摇溶解。
（５）苯甲酸标准储备液：准确称取０.１０００ｇ 苯甲酸，加２０ｇ／Ｌ碳酸氢钠溶液５ｍＬ，加热溶解，移入１００ｍＬ 容量瓶中，加水定客至１００ｍＬ，摇匀，此溶液苯甲酸含量为１ｍｇ／１ｍＬ，作为储备液。
（６）山梨酸标准储备液：准确称取０.１０００ｇ.山梨酸，加碳酸氢钠溶液（２０ｇ／Ｌ）５ｍＬ，加热溶解，移入１００ｍＬ 容量瓶中，加水定容至１００ｍＬ，山梨酸含量为１ｍｇ／１ｍＬ，作为储备溶液。
（７）苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液１０.０ｍＬ，放入１００ｍＬ容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各０.１ｍｇ／ｍＬ。经滤膜（０.４５ｍ）过滤（ 同时测定糖精钠时，可加入糖精钠标准储备液）。
３.仪器
高效液相色谱仪（带紫外检测器）。
４.测定方法
（１）样品处理
１.汽水、饮料、果汁类：（ 汽水需微温搅拌除去二氧化碳）吸取２.０ｍＬ 样品，加入已装有中性氧化铝（３ｃｍ*１.５ｃｍ）的小柱中，过滤，弃去初滤液，然后用流动相洗脱苯甲酸，接收于２５ｍＬ带塞量简中，洗脱至刻度，摇匀。此液通过微孔滤膜后进样。
３.配制酒类：称取１０.０ｇ 样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（１+１）调节ＰＨ约７，加水定容至适当体积，经滤膜（０.４５ｕｐ）过滤。
（２）高效液相色谱参考条件
１.色谱柱：ＹＷＧ-Ｃ１８ ４.６*１５０ｍｍ５ｕｐ，或其他型号Ｃ１８柱。
２.流动相：甲醇+乙酸铰溶液（０.０２ｍｏｌ／Ｌ）（５+９５）。
３.流速：１.０ｍＬ／ｍｉｎ。
４.进样量：１０ｕｌ。
５.检测器
紫外检测器，波长２３０ｍｍ，灵敏度０.２ＡＵＦＳ。
根据保留时间定性、外标峰面积法定量。
高压液相色谱HPLC培训教程(二)
II．基本概念和理论
一、基本概念和术语
1．色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。
拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。
峰底-基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。
峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ
半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ
标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。
2．定性参数（保留值）
死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）
保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR
调整保留时间(adjusted retention time，t'R)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)--扣除死体积后的保留体积。
3．柱效参数
理论塔板数(theoretical plate number，N)--用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。
理论塔板高度(theoretical plate height，H)--每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。
4．相平衡参数
分配系数(distribution coefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。
容量因子(capacity factor，k)--化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。
容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。
容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。
选择性因子(selectivity factor，α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间（《美国药典》）。
要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。
5．分离参数
分离度(resolution，R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R＝。当W1＝W2时，R＝。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。
中国药典规定R应大于1.5。
提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。
第九章 高效液相色谱实验技术
一色谱柱
1.液相色谱柱的安装
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的关键所在。
(1)、液相色谱柱的结构：
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。
在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。
b、柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。
(2)，色谱柱的安装：
a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1／4-1／2圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。
2、液相色谱柱的使用：
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
(1)、样品的前处理：
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
(2)、流动相的配制：
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
(3)、流动相流速的选择：
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
(4)、从HPLC色谱柱上去除样品残余物
因为样品中经常会含有能够吸附在色谱柱固定相上的杂质化合物，所以应该经常对色谱柱进行清洗或冲洗。当色谱柱在多次进样后显示出柱效降低时，有必要采用适当的流动相对色谱柱进行处理，冲洗除去吸附在固定相上的污染物和样品残余物。
方法如下：
将色谱柱从系统上取下，反向连接到输液泵上。色谱柱出口不要连接到检测器上，以免污染检测器流动池。
大多数的硅胶基质色谱柱反相冲洗没有问题，但是聚合物基质色谱柱并不能如此操作，在反相冲洗色谱柱之前最后与色谱柱生产商确认，反向冲洗流动相流速不要太大。
冲洗溶剂的选择要考虑分析的样品和使用的流动相条件，一般清洗流动相强度应该比流动相更强，但是条件应该尽可能的温和。
A. 用适当的溶剂冲洗色谱柱的盐和强添加剂。
B. 用比分析流动相更强的溶剂冲洗，该溶剂与流动相组成相同但不含盐和酸。
C. 如果认为B布骤没能完全清洗干净色谱柱，可用100％最强溶剂冲洗。
在清洗色谱柱时，最好用与流动相组成相同的溶剂，但是如果使用其他的溶剂，最重要的是要考虑到溶剂之间的互溶性，另外不要用强酸和强碱。
名称_____ 沸点_____ 挥发速度
二氯甲烷--------- 40--------- 2750
四氯化碳 -------- 76.8--------- 1280
醋酸甲酯--------- 57.2--------- 1180
丙酮------------- 56.2--------- 1120
正己烷 --------- 65～69 --------- 1000
二氯乙烷--------- 84----------- 750
环已烷--------- 80.8------------ 720
醋酸乙酯 -------- 77.1 --------- 615
丁酮 ------------ 79.6---------- 572
四氢呋喃--------- 66---------- 501
苯 ---------------80 ---------- 500
正庚烷 --------- 98.0---------- 386
甲醇----------- 64.5----------- 370
甲苯--------- - 111.0--------- 240
异丙醇 --------- 82.5--------- 205
乙醇 ----------- 78.1--------- 203
醋酸丁酯------- -26.5 --------- 100
二甲苯 --------- 135～145-------- 68
甲基溶纤剂------ 124.5--------- 55
丁醇 ------------ 117.1--------- 45
环已酮 --------- 155～156 ------- 25
三氯乙烯--------- 86～88--------- 快
二氧六环 --------- 101～102------- 中
二甲基甲酰胺 ---- 153------------- 慢
醋酸戊酯 ---------130～150 ------- 慢
3、色谱柱的保养
在正常情况下，色谱柱至少可以使用3—6个月，能完成数百次以上的分离。但是，若操作不慎，将使色谱柱很易损坏而不能使用。因此为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须对色谱柱进行仔细地保养。
1． 色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞，使操作压力速升高而无法使用，因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.45μm孔径的滤膜过滤。在流动相组贮槽与色谱柱间，安装0.45μm孔径的过滤器。在柱子上端接头处装上多孔过滤片，以防止固体颗粒进入色谱柱中。在水溶液流动相中，细菌容易生长，可能堵塞筛板加入0.01％NoHa能防止能防止细菌生长。
2．最好使用进祥阀进样，以防止注射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。
3．对硅胶基键合相填科，水溶液流动相的PH值不得超出2—8．5的范围，使温度不宜过高。柱子在酸性或碱性条件下使用之后，。应依次用水、甲醇清洗，对暂时不用而需要较长时间保存的柱子，要用纯甲清洗，柱子两端用金属螺帽封闭，保存于干净的有机溶剂中。
4． 要防止色谱柱被振动或撞击，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。
5．要防止流动相逆向流动，否则将使固定相层位移，柱效下降。
6．使用保护柱。连续注射含有未被洗脱样品时，会使柱效下降，保留值改变。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱间加上保护柱，其长度一般为3—5cm，填充与分析柱性质相似的表面多孔型固定相，因此可干法填装。而且价廉、更换容易。实验表明，使用保护柱后，除了使扩为零的组分的塔板数减少外，其柱效下降很少。
4、色谱柱的再生
一般情况下，硅胶和ODS等化学键合固定相再生是困难的。有时，采用下述方法可能提高校效。
1． 由于杂质微粒等因素，使柱上端固定相变色，柱效下降。这时，可仔细地将变色部分除去(约3mm左右)，再补充新的固定香。
2． 当色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，可选择合适的溶剂进行洗净。
3． 对离子交换树脂柱，先经1mol／L HCI相1mol NaOH溶液洗净，再以1—2mol/L NaCl水溶液平衡，以超声波发生器进行清洗，通常可获良好的效果。
4．当采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。
二.流动相
1.脱气
基线的各种问题
L、基线漂移
原因 解决方法
1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）
1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图
2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处
M、基线噪音（规则的）
原因 解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气
1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液 图 2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
3、流动相混合不完全 3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）
4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。
6、泵振动 6、在系统中加入脉冲阻尼器
N、基线噪音（不规则的）
原因 解决方法
1、漏液 图 1、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
2、检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶 3、选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
5、系统内有气泡 5、用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡 6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）
7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
8、检测器灯能量不足 8、更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞 9、更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
O、宽峰
原因 解决方法
1、流动相组成变化 1、重新制备新的流动相
2、流动相流速太低 2、调节流速
3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）
3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确 4、调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
5、 a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、 使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低 6、增加浓度
7、保护柱污染或失效 7、更换保护柱
8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷 9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低 11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大 12、使用较小的时间常数
P、分离度降低
原因 解决方法
1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）
1、重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞图
2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
Q、所有的峰面积都太小
原因 解决方法
1、检测器衰减设定过高 1、减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
2、设定较小的时间常数
3、进样量太少 3、增大进样量
4、记录仪连接不当 4、使用正确的连接
R、所有的峰面积都太大
原因 解决方法
1、检测器衰减设定过低 1、采取较大的衰减
2、进样过多 2、减少进样量
3、记录仪连接不正确 3、正确连接记录仪
HPLC日常维护办法之四：进样阀的问题
以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
A、手动进样阀，转动不灵
原因 解决方法
1、转子密封损坏 1、更换或调整转子密封
2、转子太紧 2、调整转子的松紧度
B、手动进样阀，载样困难
原因 解决方法
1、进样阀安装不当 1、重新安装
2、定量环阻塞 2、清洗或更换定量环
3、进样器污染 3、清洗或更换进样器
4、管路阻塞 4、清洗或更换管路
C、自动进样阀，不能转动
原因 解决方法
1、无压力（或电源） 1、提供恰当的压力（电源）
2、转子太紧 2、调整转子的松紧度
3、进样阀安装不当 3、重新安装
D、自动进样阀，其它问题
原因 解决方法
1、阻塞 1、清洗或更换阻塞部件
2、机械故障 2、见随机维修手册
3、控制器故障 3、维修或更换控制器
来源：分析化学网
1．流动相溶剂的处理：
(1) 水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH9—10的条件蒸馏，可用于常规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。
(2) 有机溶剂的提纯 通常用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。将溶剂通过氧化铝或硅胶柱可除去极性化合物。氯仿中含有的少量甲醇，可先经水洗再经蒸馏提纯。试剂级的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强烈吸收紫外线，可经蒸馏除去难挥发的丁基甲苯酚。为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。
(3) 溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用0.45ym孔径的滤膜过滤，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞。同时要进行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。
1)
溶剂中的CO2使得电导检测器的背景增大。
2) 检油池中的气泡，使得信号不稳定，常出现系列假峰（特别是当柱子加温使用时）。
3) 色谱柱内的气泡，使柱效降低。
4) 输液泵内的气泡，使活塞动作不稳定，流量变动，严重时法输液。
溶剂脱气的方法很多，常用的方法有：用惰性气相(如氦气)驱除溶剂中的气体；加热回流；真空脱气和超声波脱气。其中，以超声波脱气最为方便、安全、效果良好，只需将溶剂瓶放入加有水的超声波发生器槽中，处理10一15min即可。
2．试样溶液的制备 配制分析试液的溶剂应当使用色谱分离的流动相或可与其混溶的溶剂，配制好的试液需经0.45μm孔径的滤膜过滤，以除去固体微粒物质。
三、样品处理技术
在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需对试样预处理。样品的预处理方法很多，如溶剂萃取、吸附、超速离心及超过滤等。
1．溶剂萃取 溶剂萃取适用于待测组件为非极性物质。在试样中加入缓冲溶液调节pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但如果待测组分和蛋白质结合，在大多数情况下；难以用萃取操作来进行分离。
2．吸附 将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进行吸附。亲水性物质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯—二乙烯基苯等类树脂吸附。
3．除蛋白质 向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白质被沉淀下来，然后经超速离心，吸取上层清液供分离测定用。
4．超过滤 用孔径为l0×10-10一500×l0-10m的多孔膜过滤，可除去蛋白质等高分子物质。
四 液相色谱常见故障及排除方法
色谱柱
1、柱压升高;
色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。 卸下入口接头的滤片，使用1：1的硝酸溶液超声清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份。样品及流动相使用0．45μm滤膜除去微量杂质。使用流动相作溶剂配制样品。
2、新柱柱效低
柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好，影响传质过程。 更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积。使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。
3、旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷。
填料被流动相溶蚀而流失。 用同型填料填补柱效可部分恢复。对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。
4、旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。
入口填料被污染变质所致。 用强溶剂冲洗。刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。污染严重，则废弃或重新填装。
5、新柱接到仪器上后，柱头漏液。
柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。 用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。
6、新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降。
柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。 继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。
7、新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。
①同上。② 流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 ①同上。②配好流动相后一定要进行脱气处理。
8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。
柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。 更换或清洗柱入口滤片；用0．45μm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。
9、[b]进样次数增加柱压降逐渐增加。
①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。②样品在流动相中析出微小结晶。 ①用0．45μm过滤膜过滤样品。②推荐使用流动相溶解样品。 6O{G
10、使用—段时间后，柱效下降，分离不好。
①柱填料被流动相溶解而流失。②柱填料被样品杂质污染。 ①推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。
11、[b]柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。
柱入口床层被污染使柱填料变质。 用强溶剂冲洗除去杂质。
12、柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。
柱入口床层被污染。 用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。
13、进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。
样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。 ①用流动相溶解样品。②样品的浓度不宜太大。④进样量不宜过大。
14、使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。
霉菌生长所致。 ①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。
15、用5μm颗粒填料柱时， 以MeOH／H20作流动相时柱压较高。
MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。 可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。
16、长时间放置的色谱柱，出现双峰。
柱床层出现干裂。 柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。
17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。
强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。 不影响柱的性能。
18、柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。
柱中固定相流失所致。 ①更换色谱柱。②检查所用的色谱条件是否合适。
19、在UV色谱图中，靠近死时间处出现负峰。
①进样时压力波动所致。②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。 ①采用进样阀进样。
高效液相色谱仪的使用
1．色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净，用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中，用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液，用正己烷（含0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）为流动相测定柱效及分离度塔板数在2～3万/ml以上及分离度在1.5以上者，柱效好。为防止柱污染，常用1个50mm长，4~5mm内径，装有硅胶（40-50mm）或立柱相同填料的保护柱（预柱）接在主柱之前，以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经，以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚，再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。
2．流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中，经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱，最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法（isocratic dlution），即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法（gradicnt clution）,即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比，从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离，而整个色谱过程缩短。必须注意，梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。
3．检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收，荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物，大多数药物分子对紫外光有吸收，故能较普遍采用，检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器，既能使流动相停流作组分的定性定量检测，又能提高测定灵敏度，重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源，光强度增加了3~4倍，对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测儿茶酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池，在一暄电压下电解产生电流，放大后检测，检测限pg级。
4．数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统，除记录谱外，还能自动记录峰的保留时间，能自动积分求算峰面积，并能按照预定的程序作有关计算，报告分析结果。
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法
1 液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成（如图1所示）。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是容易出事故的主要场所。
2 常见问题及解决方法
2．1 针对柱压问题（表1）
柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50PSI之间。压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。值得注意的是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。首先考虑柱子是否被堵，此时可更换一根新柱子进行检测。
2．2 针对保留时间漂移的问题 [2，3] （表2）
保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，其包括了保留时间增大和减小。它的产生与很多原因有关。
2．3 针对异常色谱峰问题[2-4]
异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。具体情况与原因分析如表3。
3 高效液相色谱仪的保养[5-7]
3．1 HPLC的日常操作条件
工作温度10～30℃； 相对湿度<80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。
3．2 泵的保养
使用流动相尽量要清洁；进液处的沙芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡。
3．3 进样器的保养
每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。
3．4 柱的保养
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪连接时，阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提纯；严格控制进样量；每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。
3．5 检测器(UV)的保养
紫外灯的保养要在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。同时样品池要保养。
4 结语
在高效液相色谱使用过程中故障排出时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，从而确定假定因素与问题之间的联系；如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，从而避免浪费；养成良好的记录习惯，一个良好的记录是成功地进行故障排除的关键。
总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养，仪器系统的干净是用好仪器和维护维修仪器的关键。
（一）高压恒流泵的维护注意事项
泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。应采取下列措施以延长使用寿命：
绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。
每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。
要用HPLC级试剂
输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。
压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨
有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。
(二)流动相使用的注意事项
必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45μm薄膜过滤。
过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。
几种脱气方法比较：
1、 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。
2、 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
3、 抽真空脱气法：易抽走有机相
4、 超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15 分钟，此法效果并不太好但操作简单。
如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相：
浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜
特别注意HPLC使用过后的系统清洗：
含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：
1、 先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。
此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗
2、 再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。
3、 最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。
(三)流动相的更换
在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。要采用一种与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相进行过滤、清洗。
较为常用的过滤流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相。一般清洗时间为30~40分钟，直至系统完全稳定。
如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路阻塞。严重时将引起流 通池污染堵塞，不得不更换流通池。用户就要承担不必要的损失了。
储液器的注意事项：
保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。要使用HPLC级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非HPLC级的流动相一定要用0.45μm过滤器除区去其中的微量物质。
仪操作步骤
1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3）、打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4）、 进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5）、 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6）、 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7）、 设计走样方法。点击file，选取se-lect users ａnd methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8）、 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9）、 关液相色谱仪时，先关计算机，再关液相色谱。
10）、 填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1）、 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2）、 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3）、 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项---流动相：
1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；
3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。
样品：
1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
色谱柱：
1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；
2、 使用符合要求的流动相；
3、 使用保护柱；
4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。
5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、 不要高压冲洗柱子；
7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；
使用过程中注意轻拿轻放。
实验前准备事项
1.1 对照品的配制
1.1.1 配制方法
取干燥情况下的对照品（注意是否吸潮），每次称取量不得少于5mg，置一定容量量瓶中，加入少量溶剂，超声溶解冷却后再定容、混匀（高浓度）。再用移液管吸取1~2ml至先配制成高浓度的对照品，一定容量量瓶中，加入溶剂定容、混匀，即得（低浓度）。配置后的对照品均需用封口膜封好。
1.1.2 配制浓度 严格按照标准配制对照品浓度（低浓度），不可超过或低于一倍。
1.1.3 所需玻璃仪器和容器 所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
1.1.4 标签 配制好的对照品标签上应注明：品名、批号、取样量、稀释倍数（浓度）、配制日期。
1.1.5 干燥器 干燥器中的干燥剂每月至少处理一次。
1.2 供试品的制备
1.2.1 取样方法 成品：取10袋装量差异项下的样品，按照相关品种标准含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。
药材：取样袋中药材全部打粉至规定目数（一般为3～4号筛），按照05年版中国药典相关品种含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。
1.2.2 称样要求 用万分之一天平称取，使用中注意天平稳定。
1.2.3 量取要求 均用移液管量取或刻度量管。
1.2.4 所需玻璃仪器和容器 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
2 实验中注意事项
2.1 实验仪器的准备
2.1.1 仪器安装后是否存在漏液现象？压力是否稳定？柱子是否安反？
2.1.2 检查完毕后，打开电脑、N2000工作站电源开关后，再打开泵电源开关、控制面板上泵开关。先用色谱甲醇冲洗柱子，等待机器平稳后，再打开检测器电源开关、控制面板上检测器开关。30分钟后方可进针做实验。
2.1.3 打开电脑桌面上的N2000在线工作站，选择通道，设定保存路径、波长（注意控制面板上同样需要设置）等实验信息。
2.1.4 设定完毕后，点击数据采集、查看基线、零点校正后，注意观察电脑左下角电压值、时间值波动是否正常？
电压不对：灯是否开启？如果开启还有问题，就重新开启工作站或检测器。
时间不对：调节采样频率（应为10帧/秒）
2.2 流动相的配制 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
先抽滤、后超声（10-15分钟）
2.3 测定法要求
2.3.1 样品进样前先混匀，再用0.45μm滤膜过滤，再混匀后进样。
2.3.2 对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数）。
2.3.3 注意系统评价：理论板数（达到标准要求）、分离度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之间）。
2.3.4 平行进针要求RSD<2％。
2.3.5 进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。
2.4 仪器使用过程中注意事项
注意机器异常情况的发生（声音），压力是否过高（超过200Bar不可再做实验），流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。
2.5 实验完毕后
可用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水冲洗0.5小时，再用甲醇冲洗一小时。 2.6 人参、西洋参等含量测定
做波长小于240nm的样品时，注意机器、柱子一定要加长冲洗时间，乙腈则改用进口乙腈。
2.7 保留时间改变的样品
用于实验时间加长，导致对照品与样品保留时间不一致时，在实验最后加进一针对
操作过程：
1、 开机操作：（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开Bootp Server（一般启动时已打开）；
（2）、自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开On line）；
（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；
（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；
（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。
2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；
3、 建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；
4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
5、 溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；
6、 实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；
7、 关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；
8、 使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。
未经操作培训，不得擅自使用仪器。
1、 操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。当出现错误警告（各组件指示灯均为红色），一般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点击On line操作界面中的Instrument/System Off，然后再点击操作界面中的Instrument/System On即可。
2、 连接柱子与管线时，应注意拧紧螺丝的力度，过度用力可导致连接螺丝断裂。柱接头处易发生漏液，可能情况为接头Fittings中间的管子未和接口处贴紧。不同厂家的管线及色谱柱头结构有差异，最好不要混用，必要时可使用PEEK管及活动接头；
3、 操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡），若还是无法通畅，则需换柱；
4、 运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；
5、 样品瓶中样品较少，自动进样器进样针无法到达液面，可采用调低进样针进样高度的办法，注意设置时不要使进样针碰到瓶底，微量样品分析应使用微量样品瓶；
6、 自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位。
7、 泵压不稳或流量不准，可能为柱塞杆密封圈问题或seal wash垫圈问题，需更换；
8、 基线产生不规则噪声，可能原因为系统不稳定或没达到化学平衡（使其平衡，若用离子对试剂，在首次使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡），流动相被污染（更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统），色谱柱被污染（为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱），检测器不稳定；
9、 短期有规则的噪声，可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当（如两种溶剂的互溶性问题），泵入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定；
10、长期有规则噪声，可能原因为室温不稳（未使用柱温箱）或使用柱温箱不当；
11、基线漂移，可能原因为系统不稳或没有达到化学平衡，室温不稳（未使用柱温箱），流动相污染或分解，柱污染，检测池泄漏，系统泄漏，固定相流失（另选流动相，另选色谱柱），测定的波长选择错误（对溶剂有吸收），样品组分保留太长（用强度合适的溶剂清洗色谱柱），检测器不稳定；
12、每次进样时的保留时间不重复，可能原因为系统不稳或未达到化学平衡，由于气泡、各部件磨损等原因引起的泵压或泵脉冲输液不稳定，进样体积太大或样品浓度太高平衡被破坏，溶剂配比不合适，柱被污染；
13、无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；
14、色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题（瓶号错、进样体积不合适、进样错误、针头堵塞）；
15、峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏），柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化；
16、出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏；
17、前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱），柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效；
18、脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题（如阀漏等），检测器时间常数设置错误；
19、出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有稳定剂/稳定剂变化。
液相色谱常见问题及处理方法
一、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
1． 样品量不足，解决办法为增加样品量
2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。
5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。
8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
9． 流动相流量不合适。调整流速即可。
10． 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
二、为什么HPLC柱柱压过高
柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2． 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；3． 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。 一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的heodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 三、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2．存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子.
四、如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化
1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象
4. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
5． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
6．
流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
五、HPLC仪器问题
1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？
答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞；流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。
2、基线不稳，上下波动或漂移的原因是什么，如何解决？
答：a.流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气
b.单向阀堵塞；取下单向阀，用超声波在纯水中超20分钟左右，去处堵塞物
c.泵密封损坏，造成压力波动；更换泵密封
d.系统存在漏液点；确定漏液位置并维修
e.流通池有脏物或杂质；清洗流通池
f.柱后产生气泡；流通池出液口加负压调整器
g.检测器没有设定在最大吸收波长处；将波长调整至最大吸收波长处
h.柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
3、接头处为何经常漏液，如何处理？
答：接头没有拧紧；拧松后再紧，手紧接头以手劲为限，不要使用工具，不锈钢接头先用手拧紧，再用专用扳手紧1/4-1/2圈，注意接头中的管路一定要通到底，否则会留下死体积。接头被污染或磨损；建议更换接头。接头不匹配，建议使用同一品牌的配件。
4、进样阀漏液是如何造成的？
答：a.转子密封损坏；更换转子密封
b.定量环阻塞；清洗或更换定量环
c.进样口密封松动；调整松紧度
d.进样针头尺寸不合适，一般是过短；使用恰当的进样针（注意针头形状）
e.废液管中产生虹吸；清空废液管
六、谱图问题
1、 问：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？
答：保护柱或分析柱污染；取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
样品溶剂不溶于流动相；改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。
2、 问：K'值增加时，拖尾更严重，这是为什么？
答：反相模式，二级保留效应；
a.加入三乙胺（或碱性样品）
b.加入乙酸（或酸性样品）
c.加入盐或缓冲剂（或离子化样品）
d.更换一支柱子
3、 问：保留时间的波动有几种可能的原因？
答：温控不当；调节好柱温。流动相组分变化；防止流动相蒸发、反应等，做梯度时尤其要注意流动相混合的均匀。色谱柱没有平衡；在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。
七、问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
1． 样品量不足，解决办法为增加样品量
2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。
5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。
8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
9． 流动相流量不合适。调整流速即可。
10．检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
八、问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么？
1 进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。
2 进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。
3 在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。
4 系统的进样垫、柱接头等地方漏气。
九、问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
答：原因可能有：
1． 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2． 比例阀失效，更换比例阀即可；
3． 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
4． 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5． 系统检漏，找出漏点，密封即可；
6． 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
十、问：做PGS/MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱？
答：聚合物，尤其是一些含氮，硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预柱可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。
十一、问：更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？
答：这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
十二、问：购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？
答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
2． 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
3． 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；
4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
十三、问：高温毛细柱的使用寿命一般为多长？
答：毛细柱寿命锄决定于柱子本身的性能外，在很大程度上取决于使用情况，如使用温度、样品状态，进样量等，如果在其使用温度范围内，样品干净，色谱柱不被污染的情况下，柱子寿命一般在2-3年之间。
十四、问：BPX70毛细柱是否可用于GC/MS分析？
答：完全可以。BPX70为极性柱，使用温度范围宽（25-260C），程序升温可达290C，流失低，适合于分析脂肪酸甲酯的的各种位置和几何异构体，药物异构体，碳水化合物等。因BPX70为交联柱，故用于GC/MS很稳定，污染后可清洗再生。
十五、问：如毛细管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢复？是否可通过老化来解决？
答：根据柱污染程度可采取不同的方法来解决，如果污染不严重，污染物沸点不是太高，可通过老化来解决，但老化温度不可超过柱子的最高使用温度，且一般要较长时间（8-30）小时，如果污染较严重，或通过老化仍不能使柱性能恢复，那就必须采用溶剂清洗，通常是用5倍柱容积的溶剂（如正戊烷，二氯甲烷等）通过色谱柱。当然，清洗熔剂用的越多，对柱性能的损坏越大，清洗完后，在通载气老化一定时间，如果柱性能恢复，便可继续使用。
必须指出：只有交联柱才能清洗，对于非交联柱，清洗柱子会彻底失效，因为固定液被洗掉了，至于清洗用熔剂的选择，可参考说明书。[/hide]
色谱常见故障及排除方法
1、柱压升高T
色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。 卸下入口接头的滤片，使用1：1的硝酸溶液超声清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份。样品及流动相使用0．45µm滤膜除去微量杂质。使用流动相作溶剂配制样品。
2、新柱柱效低 F
柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好，影响传质过程。 更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积。使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。 ?
3、旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷。Qt5e(,
填料被流动相溶蚀而流失。 用同型填料填补柱效可部分恢复。对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。 l
4、旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。v
入门填料被污染变质所致。 用强溶剂冲洗。刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。污染严重，则废弃或重新填装。
5、新柱接到仪器上后，柱头漏液。E
柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。 用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。 ,
6、新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降。Zm
柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。 继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。 xL7
7、新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。S\T
①同上。② 流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 ①同上。②配好流动相后一定要进行脱气处理。 k
8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。f
柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。 更换或清洗柱入口滤片；用0．45µm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。 X9Ks=x
9、进样次数增加柱压降逐渐增加。.
①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。②样品在流动相中析出微小结晶。 ①用0．45µm过滤膜过滤样品。②推荐使用流动相溶解样品。 bx
10、使用—段时间后，柱效下降，分离不好。p
①柱填料被流动相溶解而流失。②柱填料被样品杂质污染。 ①推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。 K1)0j
11、柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。`tI
柱入口床层被污染使柱填料变质。 用强溶剂冲洗除去杂质。 c,=O
12、柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。
柱入口床层被污染。 用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。
13、进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。
样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。 ①用流动相溶解样品。②样品的浓度不宜太大。④进样量不宜过大。
14、使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。 M
霉菌生长所致。 ①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。
15、用5µm颗粒填料柱时， 以MeOH／H20作流动相柱压较高。
MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。 可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。
16、长时间放置的色谱柱，出现双峰。
柱床层出现干裂。 柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。
17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。
强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。 不影响柱的性能。
18、柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。)!
柱中固定相流失所致。 ①更换色谱柱。②检查所用的色谱条件是否合适。 TM<
19、在U V色谱图中，*近死时间处出现负峰。WF`2TK
①进样时压力波动所致。②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。 ①采用阀进样。 ②用流动相溶解样品。
简述液相色谱单向阀故障判断和排除
通常情况下，液相色谱高压输液泵的单向阀有输入单向阀和输出单向阀，单向阀的基本工作原理：液体只从阀的一端进去，另一端出来，即液体呈单向流动。
单向阀中最关键的部件是宝石球和宝石球座，宝石球是非常光滑的球体，球座为园矩形，它有光滑面和毛面之分，安装时，宝石球应放置在球座的光面上，可以达到非常好的密封效果。当柱塞杆抽动时，宝石球上浮，单向阀被打开，液体进入单向阀；当柱塞杆推动时，液体被排出单向阀，同时宝石球下浮回到球座，封堵被排出的液体，使液体不能回流。
单向阀故障通常有两种情况：
1、单向阀被堵死，其外在表现为：液体出不来，无压力显示。
这种情况往往是宝石球和球座粘住了，流动相进不去，当然也出不来。一般也是用过缓冲液作流动相，由盐存在粘住的，或者流动相较脏、粘度高而引起的。
2、单向阀被污染，其外在表现为：压力波动大。
这种情况通常都是球座上有细微的固体颗粒，固体颗粒有可能是盐析出，尤其是在使用缓冲液作流动相后，导致宝石球和球座密封性不好，流动相有回流现象。
处理方法：
当确认是单向阀故障后，将单向阀小心拆卸下来，将入口单向阀和出口单向阀分别标注，然后置于预先加入纯净水的玻璃烧杯中，注意将宝石球向上放置，按以下顺序进行：纯净水超声清洗10分钟以上，纯净水最好事先加热至50℃左右，这样效果更好；换甲醇超声清洗15分钟。
检查：
将单向阀按原样装上，注意不要将进口阀和出口阀装错，先用针将泵中空气抽出，按正常操作顺序开启泵，检查有无泄漏点，检查泵压是否正常。此时流动相一般为甲醇。如果还有压力不稳或测不到泵压，请重复以上处理操作。
预防措施：
1、流动相一定要先超声，再经0.45微米膜过滤。
2、使用盐缓冲液作流动相后，先要用纯净水冲洗管路，将盐冲洗干净，才能在流动相中加入一定比例的甲醇或乙腈等有机溶剂，决不能直接使用有机溶剂冲洗。
高效液相色谱柱柱效测定
一、实验目的
1．
了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理
2．
学习高效液相色谱仪的使用
3．
学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法
二、基本原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即：
式中：tR为组分的保留时间
Y1/2为色谱峰的半峰宽度
Y为色谱峰的峰底宽度
三、仪器和试剂
1．
仪器1：KLC321型高效液相色谱仪（紫外检测器）
2．
5μl微量进样器
3．
试剂：甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、混合液
四、实验条件
1．
色谱柱1 长15cm，内径 4.6mm，装填10?m的C-18烷基键合固定相
2．
流动相 甲醇:水（85:15），流量0.8ml/min
3．
紫外光度检测器 波长254nm，灵敏度0.08
4．
进样量 5ul
五、实验步骤
1．根据实验条件和实验录像指导，按KLC321仪器操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，色谱工作站之“采样系统”基线平直时，即可进样。
2．分别吸取5μl甲酯、混合液，并用色谱工作站记录色谱数据，同时记录色谱数据文件名。
3．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。
六、数据记录及处理
单位：min
单液
类别
保留时间
起点时间
落点时间
理论塔板数
甲酯
5.543
5.507
5.580
92249.500
乙酯
5.350
5.197
5.970
766.423
混合液
类别
保留时间
起点时间
落点时间
1
2.667
2.573
2.737
3.067
2.745
3.228
3.453
3.335
3.722
3.852
3.722
4.150
4.523
4.365
4.640
5.567
5.380
5.693
2
2.687
2.597
2.770
3.067
2.777
3.185
3.403
3.185
3.625
3.732
3.625
3.983
4.277
4.055
4.640
5.097
4.922
5.693
混合液各理论塔板数计算结果如下表：
1
2
4231
3859.78
645
904
1273.77
957.06
1296
1738
4328.2
855.23
5061
699
气相色谱法的基本知识及应用
本讲主要学习气相色谱的基本理论以及气相色谱仪器和气相色谱的基本应用。
一、 基本概念、分类及公式
1、色谱法的定义及发展
色谱法是一种分离方法，它利用物质在两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相做相对移动时，使被测物质在两相之间进行多次分配，这样原来的微小差异产生了很大的效果，使各组分分离，以达到分离分析及测定一些物理化学常数的目的。
例如，苯加氢生成环己烷的反应，由于苯和环己烷的沸点只相差0.6 oC，一般的蒸馏方法很难分离，所以采用萃取蒸馏的方法分离。而用填充柱气相色谱法，半米长的丁二酸乙二醇聚酯固定相填充柱上，二者可以实现很好的分离，因为他们在这种固定相上的分配系数差异较大，即使用其他的固定相，只要延长色谱柱的长度，也能够实现很好的分离。
如何理解色谱法(Gas Chromatography )
主要有2点：一是要有两相，二是要有差异。
两相：固定相和流动相
具体到气相色谱：
固定相就是色谱柱(column)，流动相就是气体或者称为载气(carrier gas )。
差异就是指分配系数的差异。
Gas Chromatography
下面可以用一个比较粗糙的例子来帮助理解色谱法。
Gas Chromatography：
海底的通道就如同色谱柱一样，只对兴趣的人有保留作用，这样达到选择性质保留溶质的效果，而保留差别的大小决定了分离的基础。
换作另外一个通道，比如是植物类的，例如花，那么又对另外一类人又吸引力，那么在海底通道上没有差别的人群也许在这个花的通道上能够看出差别，总之，只要他们之间有差别，总能够找到这个差别把他们区分开。
色谱法发展的历史：
1906年俄国植物学家Tswett命名自己发明的分离植物色素的新方法为色谱法。因为他并不是一个著名的学者，因此他发表出来的文章并没有得到重视。
1931年，德国的Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验，得到很好的结果，色谱法因此得到很大的推广。
1940年，Martin和Synge提出了液液分配色谱法，又把塔板的 概念引入色谱法中，初步建立了塔板理论。
1941年，他们提出了用气体代替流体做流动相的可能性，在他们发展了完整的气液色谱法之后，他们得了1952年的诺贝尔化学奖。
随后，1957年Golay开展了开管柱气相色谱。
上个世纪六十年代末把高压泵和键合相固定相结合，出现了高效液相色谱。
接着，出现了色谱法和其他检测技术的联用，例如GC-MS、GC-IR等。
上个世纪八十年代，毛细管电泳出现，此后得到长足的发展，并不断出现新的模式，一直成为研究的热点。
2、色谱法的分类
a、按两相物理状态分类
流动相为气体：固定相为固体Gas –solid Chromatography
固定相为液体Gas-liquid Chromatography
流动相为液体：固定相为固体Liquid-solid Chromatography
固定相为液体Liquid-liquid Chromatography
流动相为超临界流体：Supercritical Fluid Chromatography
b、按分离原理分类
吸附色谱（adsorption chromatography)
分配色谱 (partition chromatography)
离子交换色谱(ion-exchange chromatography)
凝胶色谱(gel chromatography)
络合色谱(complexation chromatography)
亲和色谱(affinity chromatography)
c、按色谱动力学过程分类
淋洗法(elution method)
流动相与固定相的结合比样品与固定相的结合弱
分为等度淋洗和梯度淋洗。是目前色谱方法中最普遍的方法。
置换法(displacement method)
流动相与固定相的结合比样品与固定相的结合强
前沿法(frontal method）
样品本身就是流动相，固定相上吸附或者溶解力最弱的最先流出，后面的就是混合物了。
d、按固定相形式分类
平板色谱：薄层色谱，纸色谱
柱色谱：填充柱GC，高效液相色谱
3、基本参数及公式
色谱图：若干物质的流出曲线，即在不同时间上的浓度或者响应的大小。
保留时间 retention time（tR）：样品注入到色谱峰顶出现的时间。
保留体积retention volume（VR）：从注射样品到色谱峰值出现时，通过色谱系统的流动相的体积。一般可以用保留时间乘流动相线速度得到。
死时间 dead time（tM）：不被保留的样品通
过色谱柱的时间。
调整保留时间 adjusted retention time（tR’）：
保留时间减去死时间等于调整保留时间。
色谱峰底宽W ：由色谱峰的两边拐点做切线，与基线交点的距离。
半峰高宽度W ? ：色谱峰高一半处的峰宽。也称为色谱峰半高宽度。
理论塔板数和有效塔板数
理论塔板数和有效塔板数的区别是用保留值和调整保留值的关系，由于死体积中的保留时间与分配平衡无关，因此有效塔板数描述的更加准确一些。
理论塔板数或者有效塔板数是衡量色谱柱分离能力高低的重要指标，买来一个色谱柱，一定先看它给出的柱效指标，就是指N的大小，只有N比较大，对难分离的物质才能够给出满意的结果。
分离度R
峰底分离度：等于相邻组分色谱峰保留值之差与色谱峰平均峰底之比。
分离度R等于1时两个色谱峰得到基本分离，R等于1.5时，两峰得到完全分离。在定量分析中，要对色谱峰进行积分时，最少要达到R为1，如果达到R>1.5，保证积分中基本没有误差。
二、气相色谱仪器
气相色谱仪的组成
气路系统
进样系统
柱系统
检测系统
数据处理和控制系统
气路系统：
气源
高压钢瓶
气体发生器
气路控制系统
控制阀
电子气路控制（即EFC或EPC）
进样系统：
进样口（气化室）
手动进样
自动进样
特别说明的是关于气体进样的问题：
需要气体进样阀
（a）载样位置；
（b）进样位置；
1、载气入口
2、接色谱柱
3、样品注入口
4、放空
5、样品定量管
柱系统
色谱柱：
填充柱和毛细管柱
柱温箱
温度程序实现的基础
毛细管柱的优点：毛细管内没有固体填料，气阻比填充柱小的多，可以采用较长的柱管和较小的内径，以及较高的载气流速，既没有涡流扩散，又减小了纵向扩散造成的谱带展宽。较薄的液膜又在一定程度上抵消了由于载气流速增大引起的传质阻力增大。
缺点：柱容量小，进样量小，对
进样技术要求更高。
载气流速的控制要求更加精确。
对检测器的灵敏度要求更高。
毛细管柱的3种类型：
壁涂开管柱WCOT：Wall Coated Open Tubular column
载体涂渍开管柱SCOT：Support Coated Open Tubular column
多孔层开管柱PLOT：Porous Layer Open Tubular column
检测系统
火焰离子化检测器FID：flame ionization detector
热导检测器TCD：thermal conductivity detector
电子俘获检测器ECD：electron capture detector
氮磷检测器NPD：nitrogen phosphor detector
火焰光度检测器FPD：flame photometric detector
质谱检测器MSD：mass spectrometry detector
主要介绍TCD和FID两种检测器
TCD:thermal conductivity detector
基本原理是每种物质都有导热能力，而且导热的能力大小不同，通过一个热敏电阻来测定与热敏电阻接触的气体组成变化情况。这种检测方式虽然不是最灵敏的，但是对所有样品都有响应，是通用型的检测器。
FID：flame ionization detector
一般用的是氢火焰
原理是在氢火焰燃烧时，在火焰的上方会有一个温度很高的区域，样品在这个区域被离子化，形成一些正负离子，在火焰的周围加上一个电场，让离子定向移动，形成电流，经过一系列放大后得到放大信号，也就是检测到的信号。
FID只对有机化合物有响应，因此，是选择性的检测器。但是它的灵敏度较高，所以我们现在的仪器上都是配双检测器的，以方便互相弥补。
数据处理和控制系统
主要通过工作站实现的。
数据处理包括对数据的分析和总结
控制系统是各个电子部件的远程控制
后面还要详细介绍工作站的使用
三、气相色谱的应用
（一）、GC应用的领域
石油和石油化工分析
油气田勘探中的地球化学分析
原油分析
炼厂气分析
模拟蒸馏
油品分析
汽油添加剂...
关于液相色谱仪使用中气泡产生及解决方法
液相色谱仪在使用中整个液路系统有两个地方易产生气泡!
1、泵头吸液白管。
2、检测口流通池。
气泡产生的原因：温度上升，压力下降!
温度上升或柱温上升，当接近试剂沸点时，试剂汽化产生气泡，试剂中已含微小气泡，因加热变大而产生气泡。
压力下降产生气泡，流动相中一直包含微小气泡，无论超声过滤，均不能池底去掉它，那么当压力下降时，微小气泡将长大，且多个小气泡易聚集成大气泡，而影响正常实验。
下面分部位说明气泡产生原因及解决办法:
一、泵头及吸液白管。
1、泵头：泵头是压力变化最剧烈的地方，也是最易产生气泡的地方，泵头靠负压而吸液，而负压必然使流动相中的小气泡长大，当泵腔变正压时，已长大的气泡未必能全部变小流入后续液路，则泵腔内将积存气泡，从而影响吸液精度，鉴于此，泵头上专门设计了排气阀，便于泵头排气，观察柱压稳定了说明泵头排气成功。
2、吸液白管长气泡。
a、吸液白管接触空气部位漏气，产生可见气泡，吸液白管是常压和负压交臂变化部位，其漏表现为大气进入白管内，而不易见到管内液体漏出。
处理方法：更换白管。
b、滤头堵：滤头堵使得液体流入滤头的速度下降，泵强制吸液而产生真空气泡。
判断：拔掉滤头不再长气泡则是滤头堵。
处理：A、30%硝酸水液超洗滤头，20分钟左右。
B、水超洗滤头，注意换水多超几次。
C、流动相汽化产生气泡。
尤其是夏天室温高，沸点低的试剂易汽化，比如：乙酸，乙醚，氨水，石油醚等易于汽化。
处理：超声，降室温。
二、检测流通池长气泡。
流通池是易积存气泡的地方，其对基线影响巨大，流动相流入色谱柱后，压力越来越小，微小气泡将逐渐长大，而流通池截面积远大于钢管面积，则气泡在池内易长大，气泡的特点是长大在无外压的情况下，很难缩小到钢管内经以下流出流通池，所以它就存在了池内。
处理方法：对于示差检测器(示差检测器池只能耐几个公斤压力)，只能是反复冲洗斥资，举高废液瓶靠废液管内液柱给池加一个微小反压，所以这就靠成了示差池子排气困难些，但无它法。
三、我公司紫外检测器池内气泡排除，当基线很乱，无规则时，应考虑池子排气泡。
1、反复调节反压器压力，直至基线稳定。
2、手工排气泡步骤。
a、取下反压器，接上备用钢管。
b 、泵吸液，检测器调零。
c、在现柱压基础上加一个50KG压力上限保护，比如，现柱压60KG，pmax设压力上限110KG即可。(我公司紫外池子可耐150KG压力加50KG保护可保证池子不会损坏)。
d、手堵废液钢管出液端，眼看泵柱压上升，且同时看检测器显示屏上AV值的变化。
如果池内有气泡，则手堵废液管，AN值将剧烈变化，当手松开后AV值再次大步上升，证明池内有气泡但没有排掉，当手堵和松开废液管时，AV值基本不变时，证明排汽泡成功，再观察基线将稳定。
四、池内有气泡，手堵废液管，AV值剧烈变负的原因解释，池内充满空气或液体时，光透过率均很高，但有汽泡时透过率很低，手堵废液管，池内气泡变小，光透过率加大，AV值剧烈变负。
HPLC故障排除
HPLC故障排除
现象
类型：可能原因
解决方法
死时间基线干扰
正/负（干扰）：进样溶剂的折光指数不同
用流动相代替样品溶剂
检测器漏
严重：检测器密封垫失效
更换密封垫
基线漂移
正方向：污染物积聚/洗脱
清洗色谱柱，净化样品，用纯溶剂
负方向：（梯度型）--流动相“A”溶剂有吸收
用不吸光或HPLC级溶剂
正方向：（梯度型）—流动相“B”有吸收
用不吸光或用更高的紫外波长
正方向：（梯度型）—流动相“B”有吸收
用不吸光或HPLC级溶剂
随机性—温度变化
将柱和管线绝缘保温
随机性—温度变化
将柱和管线恒温
波浪性—室内温度的变化
检测和控制室温
鬼峰
上次进样的残留
运行结速时，用强溶剂冲洗色谱柱
污染
冲洗色谱柱以除去污物
样品中不明干扰物
样品净化或预分离
离子对—破坏平衡
在实际应用的流动相中，制备样品使干扰减少到最小
肽谱—三氟乙酸氧化
每天新配样品，使用抗氧化剂
反相—水受污染
用不同量的水通过反相柱检查水的适用性且洗脱后测量峰高；用HPLC级的水
尖峰—溶剂中气泡
溶剂脱气
柱反压高
不可逆吸附试样使柱阻塞
更好地净化样品，使用保护柱
流动相粘度过高
使用低粘度溶剂或升温
粒度太小
用更大粒度的填料
入口过滤+芯堵塞
更换滤芯
入口过滤+芯堵塞
改变溶剂流向
漏液
轻微，接头出有白色粉末—接头松
旋紧连接件，切断管线或更换密封垫圈
进样阀漏
严重—阀转子磨损
更换阀中的转子
柱或其它接头漏
严重—接头松动
旋紧或更换接头
泵漏
严重—泵密封件失效
更换泵密封件
负峰
折光指数检测器—溶质折光指数小于溶剂折光指数
无故障，将级性调反使之为正
紫外检测器—溶质吸光度小于流动相
用紫外吸收更低的流动相溶剂不要长时间循环
基线噪声大
随机性—污染物积聚
冲洗柱，净化样品使用HPLC级溶剂
连续性—检测器灯故障
更换紫外灯（寿命1000小时）
偶然性—外界电干扰
使用液相色谱专用电源稳压器
尖峰—检测器中气泡
流动相脱气或反压调节器
双峰
进样量太大
进样量应为流动相进样量的1/6
进样溶剂太强
使用较弱的进样溶剂或流动相
过滤沙芯堵塞
更换并用0.5μl孔隙率的在线滤片
柱有空隙或气沟
用玻璃珠或填充料填满空隙或充填柱
存有未扫过的进样器流路
更换进样器转子
柱头有空隙
用玻璃珠或填充料填充柱头
柱子进样量超载
用更高负载量的固定液
增大柱直径
减少进样量
峰拖尾
双峰的开始
参阅上面方法
存在未扫的死体积
减少接头的数量
保证进样器密封完好
保证接头位置适中
碱性化合物—硅醇相互作用
换成高聚物固定液
碱性化合物—硅醇相互作用
用更强的流动相或加竞争碱（如：三甲胺）
硅胶基—柱降解
使用特种色谱柱，高聚物柱或空间保护柱
硅胶基—硅醇相互作用
向流动相中加盐增加缓冲液浓度
用PH更低的流动相抑制
衍生溶质以改变极性相互作用
宽峰
进样量太大
降低进样溶剂强度使溶质集中
在进样阀中峰分散
在进样前后引入气泡以降低分散
数据采样速度太慢
增加取样频率
检测器时间常数慢
调节时间常数使之于峰宽匹配
流动相粘度太高
增加柱温
检测池容积太大
用尽可能小的池容积系统中无交换器
进样量太大
降低进样量
保留时间长
用剃度洗脱或更强的流动相
压力波动
逆止阀漏
更换逆止阀
泵中有气泡
脱气，通氦脱气
泵密封口漏
更换泵密封垫
压力渐增
微粒积聚
过滤样品：管线中加过滤器，过滤流动相
水/有机系—缓冲液沉淀
检验缓冲液—有机混合物，确保相容性
保留超出总渗透体积
尺寸排除—与固定相间的特种作用
加流动相改性剂或改变溶剂以减少此现象
保留时间不断变动
柱温不断变化
使柱恒温，绝缘，保证实验温度恒定
平衡时间不足以适应梯度洗脱要求，或等度洗脱流动相起变化
确信在溶剂改变或梯度结束后至少10个柱容积通过色谱柱
流动相组分选择性蒸发
减少氦气的剧烈脱气，保持溶剂贮器盖好，制备新的流动相
缓冲能力不足
用>20mM浓度的缓冲液
在线流动相混合不-致
保证梯度系统输送恒定组分
污染积聚
冲洗色谱柱以除去污物
最初几次进样-吸附在活性部位
用浓样品进行冲洗柱，使其处于正常状态
保留时间逐渐缩短
流速在增加
检查泵以确保正确，否则须重调
柱上进样超载
减少进样量
键合固定相的流失
保持流动相的PH值在2-8.5
保留时间逐渐增加
流速在减慢
固定液体流中的漏液调换泵密封垫
硅胶填料的活化点
使用流动相改性剂
键合固定相的流失
保持流动相的PH值在2-8.5
流动相组成在变化
确保流动相容器盖好
硅胶填料的活化点
流动相中加竞争碱
硅胶填料的活化点
固定相用更高覆盖度填料
灵敏度问题
峰位于检测器线性范围之外
稀释或浓缩使之处于线性区内
最初几次进样-样品在样品池或柱中被吸附
用浓样品处理样品池/柱
自动进样器流路阻塞
检查流量情况，确保无阻塞现象
进样器样品池未充满
确保样品池中充满样品
在样品制品时有关的样品流失
用内标法在制备样品，优化样品制备方法
柱寿命短
硅胶基填料-流动相降解填料
使用聚合基填料，保持PH值在2-8.5
硅胶基填料-流动相PH值高
保持PH值在2-8.5
柱平衡时间减慢（离子对现象）
长链离子对试剂平衡时间慢
使用较短的烷链试剂
气相色谱常见故障图形分析和排除方法
常见故障图形分析和排除方法
表1-1 用热导和氢焰离子化检测器时的故障图形分析和排除方法
故障及图形 可能原因 排除方法
电源不通 （1） 插头接触不好或开关不好
（2） 电源保险丝烧断
（3） 仪器有短路，仪器的保险丝烧断 （1） 检查各插头是否插紧，重复开闭开关
（2） 更换保险丝
（3） 检查仪器线路并修理好
色谱柱恒温箱不升温 （1） 电热丝烧断
（2） 温度控制器或一次元件可能有损坏 （1） 检修电热丝
（2） 先检查接头是否接触良好，若无问题则检查温度控制器或一次元件
汽化室和检测器恒温箱不升温 （1） 电热丝烧断
（2） 电源不通或接头松脱
（3） 控制电路发生故障 （1） 检修电热丝
（2） 检修电源，拧紧接头
（3） 检修控制线路
放大器零点不能调节或调不到预定位置 （1） 调零电位器失灵
（2） 机内粗调电位器位置不当
（3） 放大器工作不正常，如输入级元件（静电计管，场效应管等）不配对 （1） 更换
（2） 重调粗调电位器至适当位置
（3） 检修或更换元件
放大器零点不稳 （1） 探头元件受潮污染
（2） 放大器中元件损坏
（3） 放大器机内稳压电源不稳
（4） 输入高阻受潮，污染或有指纹油脂印 （1） 调好电极距离，除漏电
（2） 更换变压器
（3） 更换点火线圈
（4） 降低氮气量或提高氢气量、空气量
（5） 排除堵塞现象
（6） 排除漏气现象
基线不能调零 （1） 记录器零位调节器位置定的不对
（2） 记录器连接不正确
（3） 记录器故障
（4） 基流补偿电位器失调或坏
（5） 补偿电压不够
（6） 氢焰放大器故障
（7） 氢气流量过大
（8） 火焰烧到电极
（9） 固定液流失过大
（10） 氢焰用的三种气体之一不纯
（11） 氢焰检测器内积有冷凝水或沾污
（12） 热导检测器热导丝失去平衡，可能是由于热丝烧断，测量与参比池热丝阻值相差太大或测量池钨丝沾污；柱前后漏气，热丝不全在氢气流中
（13） 钨丝与池壁相碰 （1） 把记录器信号输入端短路然后调零，可参看记录器说明
（2） 按记录器或仪器说明连接
（3） 看记录器说明
（4） 不要把基流补偿的粗细调电位器中的任一个调到头，以免调节失灵。更换损坏的电位器
（5） 增加补偿电压
（6） 参看仪器说明书查出故障并排除
（7） 调节氢气流量
（8） 调整电极位置
（9） 更换其它固定液柱或降低柱温
（10） 更换不纯气体或更换气体净化装置
（11） 升高检测器温度把水赶出或清洗检测器
（12） 调正钨丝弓架位置
（13） 用万能表检查热丝阻值是否烧断，根据情况调节阻值或更换热丝。查出系统漏气处并排除之
基线不稳噪声大 （1） 记录器滑线有污垢
（2） 记录器银滚珠磨损
（3） 记录器故障
（4） 柱子沾污或过量流失
（5） 载气流速过高或漏气
（6） 载气沾污
（7） 热导检测器放空管有冷凝液
（8） 进样器有污染
（9） 色谱柱与检测器连接管有污垢
（10） 钨丝松或接触不良
（11） 电源不稳或桥流过大
（12） 电桥有虚焊处或多圈电位器接触不良
（13） 氢焰检测 器的氢气流量过高或波动
（14） 氢焰检测器的空气太高
（15） 氢焰检测器的空气 ，氢气有杂质
（16） 氢焰检测器内有冷凝水
（17） 离子头潮湿
（18） 火焰烧到电极
（19） 电极处积有灰尘
（20） 离子检测器信号线故障
（21） 离子检测器及其绝缘材料沾污
（22） 氢焰离子头四周漏气
（23） 气路接头或电插头松脱
（24） 接地不良 屏蔽不良
（25） 波段开关有污垢 （1） 用绸子或尼龙布沾酒精擦洗滑线电阻
（2） 用砂纸磨光或换新的滚珠
（3） 把记录器的信号输入导线短路，若噪声仍出现，则需检查记录器
（4） 重新老化
（5） 更换或将过滤载气的吸附剂再生
（6） 降低载气流速排除漏气
（7） 排除冷凝液，并设法排除冷凝液产生的可能性
（8） 清洗进样器管，并更换胶垫
（9） 清洗连接管
（10） 更换钨丝
（11） 排除电源故障或调小桥电流
（12） 排除虚焊，清洗电位器触点
（13） 调好氢气流量
（14） 调好空气流量
（15） 更换或再生空气和氢气和氢气的过滤器
（16） 升高检测器温度至100℃，排创除冷凝水
（17） 干燥离子头
（18） 调正电极位置
（19） 排除灰尘
（20） 排除故障或更换信号线
（21） 用无残渣溶剂清洗绝缘材料和检测器，洗清后不要用手指直接拿取
（22） 拧紧螺帽或更换垫圈
（23） 检查地线是否接好，地线质量是否良好，有无外来电场干扰
（24） 找到有污垢的触点，清除污垢后往复旋转波段开关数次
基线出现正弦波 （1） 炉温控制器定位不当
（2） 检测器炉温控制失灵
（3） 色谱柱炉温控制失灵
（4） 检测器炉子绝缘不好
（5） 载气流量调节故障
（6） 气体钢瓶压力过低，使调节器不能正常控制
（7） 使用氢气发生器时，氢气波动过大 （1） 把炉温控制旋钮调至适当位置龠使恒定在所需温度时，炉子加热电流波动不大
（2） 更换或检修炉温控制器或测温热敏元件
（3） 同上
（4） 把绝缘材料装填妥当或更换（用高阴表检查）
（5） 载气流调节器（稳压或稳流阀）上的操作压力降一般 需适当调高，如故障仍未排除，则需更换或检修阀
（6） 更换钢瓶
（7） 调氢气发生器
恒温操作时基线不规则漂移 （1） 仪器安放位置不当
（2） 仪器接地不当
（3） 固定液流失
（4） 柱出口到检测器的连接管被沾污
（5） 载气漏
（6） 载气调节器失灵
（7） 热导检测器炉温无规则波动
（8） 钨丝中间有异物
（9） 桥电流过大
（10） 热导池或钨丝沾污
（11） 包丝引出线接触不好
（12） 桥路稳压电源失效
（13） 离子室严重沾污
（14） 氢焰检测器的氢气和空气调节失灵
（15） 离子室输出信号线接触不好
（16） 氢焰点燃后引烯开关未关闭
（17） 氢焰放大器故障 （1） 便换仪器位置，仪器不要直接放在加热器下或空气调节器下，不要放在过量通风或环境温度变化处
（2） 把仪器及记录器地线接好
（3） 老化柱子，有些柱子不适合在所设定的温度下使用，特别是需用高灵敏挡操作时总有基线漂移
（4） 清洗连接管
（5） 找出漏气的地方并消除之
（6） 检查载气调节器及流速控制器，以保证所需的操作条件，检查钢瓶是否压力用尽
（7） 检测器炉堂不能有空洞，以免冷空气进入炉内
（8） 除去异物
（9） 调小电流
（10） 清洗热导池或钨丝
（11） 接点重新焊接牢固
（12） 更换电源
（13） 清洗离子室
（14） 检查氢气和空气的调节器找出故障加以修理
（15） 使其接触好
（16） 关闭引然开关
（17） 参看放大说明书中故障消除方法
基线抖动 （1） 记录器灵敏度过高
（2） 热导池电源交流纹波电压过高
（3） 放大器工作不稳 （1） 调节记录器灵敏度调节器，使记录器笔灵活划出峰而不抖动
（2） 采取相应措施，消除之
（3） 检修放大器
恒温时，基线向一个方向 （1） 检测器温度不稳（仍在升温或降温）
（2） 载气流速不稳，或气路系统漏气
（3） 钨丝故障
（4） 热导检测器稳压电源有故障
（5） 氢焰离子化检测器的放大器有故障
（6） 氢焰离子化检测器中，氢气流速变化 （1） 检测器温度改变后需要有足够的稳定时间，特别是热导检测器，金属块体大，温度平衡滞后于指示温度
（2） 检查气路系统是否漏气，特别是进样口橡皮垫及柱入口处的接头；柱出口与热导检测器的接头是否有微漏；钢瓶压力是否太低，采取相应措施消除之
（3） 更换钨丝
（4） 更换电源或检修电源
（5） 参看说明书进行检修
（6） 检查氢气钢瓶压力和流速控制部件是否失灵，必要时换钢瓶或拆修部件
频率很快的小手刺 电源干扰 使机壳良好接地 ，绝不能以电源的中线代替地线排除附近有干扰有用电设备
周期性短刺或峰可能原因 （1） 气体管路有冷凝液使 载气鼓泡通过
（2） 接在柱尾的皂泡流速计液面太高
（3） 来自氢气发生器的氢气管路有水冷凝，氢气路有异物堵塞
（4） 电源上有大功率设备周期性通断电造成 （1） 加热除过冷凝液或吹出
（2） 断开柱尾的皂泡流速计
（3） 除水，更换氢气过滤器，清洗氢气管路
（4） 不要与大功率设备使用同一电源
基线出现较大单向毛刺 （1） 钨丝中有异物
（2） 电源插头接触不良
（3） 严重电源干扰或温度控制继电器火花干扰
（4） 氢火焰有时烧到收集极或极化电压环 （1） 氢气热导池
（2） 检查插头内有异物并将插头拧紧
（3） 排除干扰电源，检修或更换温度控制继电器
（4） 调整气流比或电极位置
出现无规律毛刺 （1） 由于开关门或风扇引起的快速空气流波动
（2） 柱后有细小的颗粒进入检测器
（3） 记录器滑线电阻局部接触不良
（4） 放大器高阻部分受潮或接触不良
（5） 喷口漏气
（6） 空气流量太大，使火焰位置发生漂移
（7） 离子头或绝缘材料沾污
（8） 热导检测器稳压电源有故障
（9） 离子检测器放大器故障
（10） 输入电压的波动大 （1） 把仪器放在妥善的地方，不要放在加热器或空调器的风扇下
（2） 要防止玻璃棉、担体颗粒或净化剂颗粒需清除之
（3） 用绸布沾酒精或乙醚擦洗或使之接触良好
（4） 干燥或更换高阻
（5） 拧紧，加热或更换喷口
（6） 把空气流量调至适当位置
（7） 用清洁剂清洗绝缘材料和离子头
（8） 检修电源
（9） 参看说明书检修
（10） 使用单独电源线或用稳压器
不出峰 （1） 检测器、放大器或记录器电源开关未开或引线脱落
（2） 记录器连接不正确
（3） 记录器银球脱落或其它故障
（4） 无载气
（5） 注射器漏或堵
（6） 进样垫漏
（7） 柱子连接处严重漏气
（8） 氢焰灭火
（9） 屏蔽线的金属丝与导线相碰
（10） 信号线断路
（11） 没有极化电压
（12） 钨丝引出线接错
（13） 柱温太低，样品在柱上冷凝
（14） 柱子在样品上严重吸附
（15） 汽化温度太低样品不能汽化 （1） 打开电源开关或把脱落引线接好
（2） 按说明书正确连接
（3） 按好银球，查找故障所在并排除
（4） 打开载气阀，并调至所需流速，若载气线路堵塞、需输通线路，若载气钢瓶用尽，就需更换钢瓶
（5） 更换注射器或将堵塞物取出
（6） 换垫
（7） 将接头拧紧
（8） 重新点着火
（9） 将屏蔽线金属丝与导线分开
（10） 检查断路位置，排除或更换信号线
（11） 加上极化电压
（12） 把引出线正确接好
（13） 升高柱温
（14） 升高柱温或多次进样进行预饱和
（15） 用煤气或挥发性样品来证实，然后增加汽化温度
保留时间正常峰面积变小 （1） 衰减量太大
（2） 进样量不足
（3） 进样针头太短，样品没进汽化室，或进样技术不好
（4） 注射器或橡胶垫在注样时漏气
（5） 载气在柱尾处漏
（6） 进样注射器针头堵塞或漏气
（7） 热导池钨丝电流太低
（8） 载气热导性能变化。如由氢气改为氮气
（9） 氢焰检测器系统各气路气体流速失调
（10） 氢焰检测器两个电极距离发生变化
（11） 氢焰检测器捕集极上有一层氧化膜或由有机硅固定液流失而沉积在电极上的白色SiO2影响电极的导电性能
（12） 载气用错（把CO2钢瓶误认为N2）或N2中含氧量太高
峰面积减小，保留值增大 （1） 载气流速变慢
（2） 从进样器到检测器气路中有漏 气
（3） 进样垫连续漏气 （1） 提高载气量，若载气管路有堵，找到堵塞的地方并排除
（2） 查找漏气处并排除
（3） 更换进样垫
负峰 （1） 记录器信号输出导线接反或不正确
（2） 双柱系统中进样器用错
（3） 离子检测器的方式选择开关位置放错
（4） 热导检测器的极性开关位置放错 （1） 按记录器或仪器说明连接
（2） 改用相应的进样器
（3） 检查方式选择开关是否放在所用分析柱的位置
（4） 切换极性开关位置
基线出现阶梯；基线不回零；衰减档不正确；出现“扁平”峰顶；记录笔易被手指推向左或右 （1） 记录器增益或阻尼控制调节的不好
（2） 仪器或记录器接地不当
（3） 有交流信号输入记录器
（4） 样品中含有高纯度的卤素、氧或硫使钨丝表面腐蚀 （1） 调节记录器增益或阻尼控制，参看记录器说明，把记录笔调到不易用手推动
（2） 仪器及记录器正确接好地线
（3） 按装滤波电容（约0.25μf，150Vdc）电容可接在记录器+或-输入线对地之间，究竞接哪根记录线为好，由实验者来确定，不可将电容接在记录器输出线之间（即接在+、-线之间）
（4） 更换热导池或钨丝
圆顶峰 （1） 超出检测器的线性动态范围
（2） 记录器增益太低 （1） 减小样量
（2） 参看记录器说明，把记录器增益调到合适的位置
平顶峰或怪峰 （1） 离子化检测器放大器输入管饱和（图Ⅰ、Ⅱ）
（2） 记录器滑线故障或机械运行系统有故障（图Ⅰ） （1） 减少样量或把放大器输入高阻衰减档改换到低档
（2） 用毫伏发生器或电位差计检查记录器
额外的峰 （1） 上一次进样的高沸点组份峰馏出（图Ⅰ）
（2） 载气中湿气或其它杂质冷凝于柱头序升温时流出
（3） “鬼峰”注入溶剂后从柱上解吸下来的峰（图Ⅱ）
（4） 样品分解（图Ⅱ及Ⅲ）
（5） 样吕及固定液或担体起作用（图Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）
（6） 样品被污染（图Ⅲ）
（7） 由玻璃棉或进样器带入污物（图Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ） （1） 间隔一定时间，再进下一次样
（2） 重装、更换或再生载气过滤器
（3） 注入几次溶剂，并再老化
（4） 降低汽化温度
（5） 更换其它固定液柱，若是由于担体催化作用而引起，则可更换其它担体柱
（6） 注样前适当净化
（7） 使用清洁的玻璃棉或老化进样胶垫
鸭嘴峰 氢焰在出峰时火焰烧到电极 减少进样量，或调整电极位置
分叉峰 （1） 热导检测器用氮气为载气时，流速、柱温选择不当
（2） 载气不纯 （1） 选择适当的流速及柱温
（2） 更换纯载
氢焰出大峰时记录笔突然回到基线以下 （1） 火焰熄灭
（2） 样量太大
（3） 样品中含氧量比燃烧空气中含氧量大，使火焰熄灭，引起记录笔突然反回基线
（4） 氢气或空气量下降
（5） 喷口堵塞
（6） 氢气发生器由于反压波动而跳闸，使氢气中断 （1） 重新点火
（2） 减少样量
（3） 用惰性气体稀释样品或用氧气代替空气助燃
（4） 重空气或氢气至适当流速
（5） 清洗或更换喷口
（6） 重开氢气发生器，若仍出现跳闸现象，检查氢气流路有无障碍物。清洗氢气流路后，重开动发生器
峰拖尾 （1） 进样器管有污染（样品或胶垫碎屑）
（2） 柱温太低
（3） 柱子使用不当，样品与载体或固定液发生相互作用 （1） 用容剂或清管器清洗进样器，必要时可更换进样器管
（2） 提高柱温，但不要超过最大使用极限
（3） 提高固定液配比，采用惰性载体或改用极性固定液
前延峰 （1） 对柱子过负荷
（2） 样品在系统中冷凝
（3） 进样技巧不好
（4） 汽化温度太低 （1） 减少进样量
（2） 检查柱温和检测器温度是否正确
（3） 掌握进样技巧
（4） 提高汽化温度
峰分不开 （1） 柱温太高
（2） 柱子太短
（3） 固定液全部流失，仅留下担体
（4） 固定液或担体选择不当 （1） 降低柱温
（2） 加长柱子
（3） 换柱
（4） 另用他柱
（5） 降低载气流速
程序升温时基线上升 （1） 载气流速不平衡
（2） 柱子沾污 （1） 按说明书使流速平衡
（2） 重新老化柱子
程序升温时基线不规则漂移 （1） 柱子老化后仍有过量“流失”
（2） 载气流速未在最佳条件下平衡 （1） 降低固定液用量或降低柱温，有些固定液挥发性太大，不宜程序升温用，即使再老化亦无法解决，故最好换柱子
（2） 按说明书平衡载气流速
表4-5 用电子捕获检测器时的故障图形分析和排除方法
故障及图形 可能原因 排除方法
噪声大 （1）电极绝缘不良
（2）检测器污染
（3）电极引线或电缆接头接触不良
（4）接地线不良 清洗更换
清洗
拧紧接头
更换
灵敏度低 （1） 放射源玷污
（2） 放射源被腐蚀
（3） 电极绝缘不良
（4） 极化电压引线和电极接触不良或对地短路
（5） 放大器输入电榄绝缘性差
（6） 载气杂质过多 清洗
更换
清洗或更换
使其接触良好，消除短路
更换
清洗或更换
更换
出现反峰 （1） 放射源或电极被沾污（图Ⅰ）
（2） 脉冲发生器不正常
（3） 收集极接触不良或短路 清洗
波形检查
基线显著漂移 （1） 检测器温度不稳
（2） 放射源沾污
（3） 进入检测器的杂质太多
清洗
老化吹洗
线性范围窄 （1） 载气不纯，如含氧量太高
（2） 色谱柱中放出干扰物质过多
（3） 负电性化合物注入过量（图Ⅰ）
（4） 由于放射源被污染基流太小
（5） 放射源过热损伤 更换
老化不能改善时更换
提高柱温老化
清洗
更换
零点失调 （1） 阴极引线绝缘性差或对地短路
（2） 阳极引线绝缘不良或对地短路 更换引线消除短路
同上
“样品瓶帽盖”干扰 样品瓶帽、密封垫的杂质，部分溶于样品中 密封垫用金属箔衬里或用聚乙烯瓶塞磨口
载气的选择、净化和流速的测定
项目 意义与要求 方法
载气种类的选择
载气种类选择的意义
（1） 满足检测器对载气的要求；
（2） 满足分析方法对分析周期、柱效率以及灵敏度的要求 热导检测器可用H2、He、N2或Ar、用H2、He作载气时灵敏度高，N2则灵敏度低，且易出现W峰
氢焰检测器可用H2、N2为载气，空气助燃。气体密度秤检测器可用N2、Ar、CO2
放射性检测器可用H2、He、Ar、N2 。H2 、He适于快速分析，但H2易燃，易漏He最理想
载气的净化 载气中含有O2、CO2、H2O、CH4等杂质可导致
（1） 柱失效：CO2、H2O使分子筛失去活性，O2使PEG；固定液断链等
（2） 样品变化：如载气含水会使氯硅烷类样品水解；
（3） 氢焰检测器基流，噪声增大
有机杂质可用活性炭除去?（4） 热导检测器线性变劣，校正因子不能使用。因此，载气必需净化
? 水份用干燥剂除去分析氯硅烷类易水解样品时，载气依次经无水高氯酸镁分子筛、P2O5干燥，可防止样品在系统中水解，满意地分析低浓度氯硅烷样品
? H2气中的O2可用105型催化剂除去，N2气中的O2可用活性铜催化剂除去
载气中的CO2可用碱石棉除去?
? 201或202银X型分子筛催化剂，是一种多用途新型气体净化剂，可以净化气体中氯氧，含硫化合物，水份及二氧化碳等杂质，除氧性能最为突出，效果与105型催化剂相似（可降低O2含量至0.5ppm,）从-80℃到160℃的温度范围均适用。201型催化剂不仅可除氢气中的微量氧，亦可在常温下脱除氮及稀有气体中的微量氧
流速的选择与测定
（1） 在最佳流速下，柱效率最高
（2） 在柱中各点载气流速不同，皂膜流速计测的是柱出口体积流速F，有进用线速度u表示.F、U表示柱管中平均流速和线速
（3） 载气流速一般应选择大于或等于最佳流速 （1）出口载气线速度u等于柱长L被死时间tM除：U= L(cm)
tM(s)
(2)平均流速等于出口流速乘以压力梯度校正因子j（见表5-13）：
U=ju; F=jf
(3)轻载气最佳线速度比重载所大些，H2和He一般10cm/s，N2为5--7cm/s，用轻载气可缩短分析时间
（4）热导检测器载气流速一般是30--150ml/min
氢焰检测器H2为30--50ml/min N2:H2=1:1--1:2,N2:空气=1：5--1：10
①. 105型催化剂是大连红光化工厂生产的含钯除氧催化剂。使用前需将它放在脱氧反应管中，在360℃于一毫米汞柱下减压脱水两小时，冷却至室温后可将欲纯化的氢气以1000（体积/体积）的空间流速通过催化剂，还原活化一小时，即可使用。对于含氧1%的H2，一次通过该催化剂后，氧含量可降到0.2ppm，催化剂失效后可用上述方法再生
②. 活性铜催化剂呈棕色条状，使用前需用H2在300-400℃下有效地除去氮气中的氧，使其含量下降到10ppm左右，催化剂变黑说明失效，需再生
③. 201或202银X型分子筛催化剂是南京无机化工厂产品。使用前需加热活化（100--160℃）用氢气缓慢吹洗，使银X型分子筛还原成为金属态即可使用。失效后可再通H2还原，还原十余次后，可将催化剂升温活化除去水分
进样操作要领
项目 意义 要领
汽化温度 （1） 对峰形影响：温度过低产生前延峰，过高峰前沿直立，或出现分解产物的色谱峰
（2） 对柱效和峰高的影响：汽化温度超过样品沸点，柱效和峰高变化不明显
（3） 对分离的影响：汽化温度低分离不好 汽化温度可比样品中最高沸点组份的沸点30-40℃
进样量 进样量应选择在组份量与其峰高或峰面积呈线性关系的范围内。进样量过大会导致：
（1） 降低柱效和分离度
（2） 超过柱负荷，使峰高不呈线性增加，不能用峰高定量
（3） 超过检测器的线性范围，峰高、峰面积都不呈线性增加 填充柱一般进液样不超过10ul,气样不超过10ml。并取决于检测的灵敏度，热导检测器一般1—5ul,氢焰检测器1ul以下
进样手法 （1） 注射深度、速度和位置对峰高、峰面积都有影响
（2） 易挥发样要更加注意 固定进针速度稍快为好（高沸点物质进针可慢些）、针头不要靠壁，低沸点样品拔针要求快，尽量保持注射器针尖中残留液体的体积一致在毛细色谱分流进样情况下，为避免样品在注射器针尖中残留体积不一致而对进样量产生误差，可在取样前先取一定量（1ul）早出峰的溶剂，然后取一段空气，再取样品，取完样后，把针杆上提到针尖内的样品全部进入注射器刻度管内，精确读取样量，然后进样，这样针尖内不会残留样品，仅留下溶剂，可保证所取样量全部进入柱内
气相色谱柱的使用及日常维护的注意事项
1、高温下在没有载气通过时，柱的固定液热分解较迅速，所以在柱箱（炉）升温前应该先通上载气，柱箱冷却后才能关闭载气。
2、载气中若夹带灰尘或其它颗粒状物体就会导致柱迅速损坏，因此在载气进入仪器管线前需加净化器。（带填充剂的汽化室玻璃衬管必须注意不能带有微粒或灰尘吹出）
3、载气中的水分通过固定液的液膜吸附在柱管表面上，将取代或破坏固定液液膜，所以，固定液极性越强，越需要采用干燥的载气，例如：象OV-1、SE-30、SE-54、OV-101对载气干燥要求不高，而PEG20M、FFAP和SP1000对载气要求就很高。但在涂布于碳酸钡沉积层上的柱子情况就恰恰相反，涂极性固定液的柱子能经受含水样品的直接进样，而涂非极性固定液的柱反而不能经受含水样品。
4、对于那些能被氧化的固定液（如PEG20M、Caxbowax、FFAP等）对载气除氧也很重要，在N2和He中往往含O2较高，而H2中含O2少，所以，ECD-CS、FID-CS常用高纯N2作载气，TCD-CS用H2作载气，可用105催化剂常温下除O2。同时，停机使用时，应将排空端密封住，以防止空气中的O2对柱固定液的氧化作用。
5、在大多数情况下，柱的寿命与它的使用温度成反比。采用稍低些的温度上限，可显著提高柱的寿命，程序升温到较高温度所维持的时间短对柱的寿命影响较小。
6、 毛细管柱最大特点是高的柱效，但是必须清楚一般所测得的柱效不仅反映了柱的质量，而且还包括进样过程的整个系统的效率的总质量，也就是说，自样品进入系统的一瞬间开始到记录笔绘出色谱峰为止，每一个能影响峰的加宽或分离的因素，如进样器、柱的连接、辅助气引入位置、管路死体积、进样器内衬的毛病等等，都一定会影响柱效。
7、 一根好的柱子，由于安装不当，可以造成理论塔板数降低，峰形增宽或拖尾、活性物质的吸附性拖尾或消失、灵敏度降低或组分分离不佳等等。
8、 进样器与色谱柱连接方式：
①.分流进样方式：分流点要求位于载气流速较高的区域。
②不分流进样方式：色谱柱最好不伸进进样器内，避免造成气流扫不到的区域，通常直接连接到进样器的末端。
③检测器与色谱柱出口端连接：对FID不仅插入深度要超过尾吹和H2气的进口，而且应尽可能将柱出口端插到FID的喷嘴下面1mm处为佳，对Micro TCD应插到TCD气体入口处为佳。可以改善轻度拖尾。
如何选择填充柱
1．固定液的选择
选择固定液无严格规律可循。一般是凭经验规则，或根据文献，或利用麦克雷诺（McReynolds）常数表来选择固定液，然后将样品注入初步选定的柱子，根据样品分离结果，再决定是否更换固定液。
事实上同一样品也可用不同固定液加以分离，“相似相溶”规律必须遵循，分子间的相互作用力（定向力、色散力、诱导力、氢键力。这些分子间作用力的强弱取决于作为分析对象的固定液-溶质体系，大致顺序是氢键≥色散力、偶极间力、诱导力。）必须考虑。
在初步选择固定液之前，对样品的各种性质应尽可能多的了解。
1.1 固定液的选择
（1）已知样品固定液的选择
A．对于非极性样品，应首先考虑选用非极性固定液。在非极性固定液上，不论样品是非极性或极性，保留作用都是色散力造成的。无特殊选择性，组分基本按沸点顺序分离。如果是烃与非烃混合物，则同沸点的极性物质先流出。
B．对于中等极性样品，应首先选用中等极性固定液。组分与固定液分子间的作用力为色散力和诱导力，基本上按沸点顺序分离，但对沸点相同的极性和非极性组分，则诱导力起主要作用，非极性组分先流出。
C．对于强极性样品，应选用强极性固定液，组分与固定液分子间的作用力主要为定向力，诱导力和色散力处于次要地位，则样品组分主要按极性顺序分离。对于极性和非极性混合物，则非极性组分首先流出，而且固定液极性越强，则非极性组分出峰越快，极性组分保留时间越长。
D．对于兼有酸性或碱性的极性样品，应选用带有酸性或碱性基团的高分子多孔小球，大致按分子量大小顺序分离。还可选用强极性固定液，加入小量酸性或碱性填充剂，以克服载体的拖尾效应。
E．对于能形成氢键的样品，就选用氢键型固定液，按形成的氢键能力大小顺序分离。
F．对于含有异构体的样品，主要是芳香性异构体样品，可选用特殊保留作用的有机皂土或液晶做固定液。则对位异构体往往出峰较晚。
（2）未知样品固定液的选择
固定液的选择要和定性分离结合起来。选择的指标只能由分离峰数目的多少，峰形以及主要（含量多的）组分分离的好坏来评价。
A．用高效能毛细管柱进行初分离。毛细管柱具有很高的分离效能，一般未知样品大都可以分离开。
B．按指定固定液进行选择
12种指定固定液是角鲨烷（SQ）、甲基硅油或甲基硅橡胶（SE-30，OV-101）、苯基（10%）甲基聚硅氧烷（OV-3）、苯基（20%）甲基聚硅氧烷（OV-7）、苯基（50%）甲基聚硅氧烷（OV-17）、苯基（60%）甲基聚硅氧烷（OV-22）、三氟丙基（50%）甲基聚硅氧烷（QF-1，OV-210）、β-氰乙基（25%）甲基聚硅氧烷（XE-60）、聚乙二醇-20000（PEG-20M）、己二酸二乙二醇酯（DEGA）、丁二酸二乙二醇酯（DEGS）、1,2,3-三(2-氰乙氧基)丙烷（TCEP）。
在这些指定固定液中，半数以上为有机硅固定液。这是因其极性可由取代基百分数来调节，热稳定性好，使用温度范围宽（-50～350℃）对各种组分皆有良好的分离能力。其中有五种称为最常使用固定液：SE-30，OV-17，QF-1，PEG-20M，DEGS，它们的性能稳定，极性间距均匀，应用面广，是一类最佳固定液。
（3）利用混合固定液
可以用混合固定液调节被分离物质的保留值，以达到适宜的选择性。对许多常规固定液来说，它们的保留性能具有“线性加和性”。
1.2 固定液配比的选择
固定液配比的选择取决于样品的性质（沸点、极性），固定液、载体的性质以及柱温等一系列因素。
固定液的涂渍量有：10～30%，5～0.5%和＜0.5%三种。固定液的厚度与载体的表面积有关。固定液的涂渍量减少时，保留时间缩短。一般而言，即使在低固定液相时色谱柱的理论塔板数也不改变，所以快速分析最好用低固定液相色谱柱。
一般来说，载体的表面积越大，固定液的含量可以越高。反之表面积越小，固定液含量应越低。近年来多采用低配比固定液柱，一般在10%以下。从速率理论可知，固定液配比主要影响传质项，即分配比和液膜厚度，降低固定液的配比，可以降低液膜厚度，减少液相传质阻力，提高柱效。但固定液含量过低，以至敷盖不了载体表面，也会由于载体吸附效应而使柱效降低。
2．载体的选择
载体的选择对色谱柱性能有很大影响。即：（1）决定柱效率（理论塔板数N直接与载体的表面积有关，表面积越大N越大）；（2）样品吸附在载体上会产生拖尾峰或前延峰。如样品和载体之间产生氢键会引起色谱峰拖尾。
气相色谱法的载体有：硅藻土微粒；对苯二甲酸微粒（185℃）；特氟隆树脂微粒（210℃），此外还有硅胶、活性氧化铝等吸附剂。
理想的载体条件：（1）单位体积的填料要有足够的表面积；（2）表面是惰性的；（3）装柱时载体不破碎；（4）有耐热性。
2.1 载体的选择原则
（1）生物类制品、药品等，它们一般属于高沸点、强极性物质，经常采用玻璃微珠担体，也可采用质量好的经酸洗的白色担体。
（2）高沸点的化工产品，如高碳醇、芳香羧酸酯，固定液涂渍量一般低于5%，经常采用白色担体或灰色担体。
（3）强腐蚀性物质，如SO2等，可选用特氟隆担体。
（4）含水有机物的分析，要求测定其中水的含量，可采用经硅烷化处理后的担体或高分子多孔小球（GDX）担体。
（5）一般常规的非极性或弱极性物质，如烃类、芳烃、卤代烃的分析，经常以采用红色担体为好。
2.2 载体粒度的选择
理论塔板高度（H）和载体的粒径（dp）成比例，所以减小dp可以得到尖峰。
载体颗粒减小，柱效将线性增加。但粒度过细会使柱压差过大，使柱子填充不均匀，使柱效和分析速度降低，给操作也带来不便。通常填充柱的载体直径约为柱径的1/20～1/25左右，即当柱子较长时用60～80目（125～250微米），较短时用80～100目。
2.3 载体的前处理
前处理方法有：酸碱洗涤；硅烷化处理；涂渍极性液相；KOH处理；H3PO4处理等。表面处理最重要的方法是酸处理法。这种酸处理方法能除去硅藻土表面的铁、镁、钠等金属物质。
3．色谱柱的选择
3.1 色谱柱的材质
有玻璃、镍、不锈钢和聚四氟乙烯塑料、石英等。有极性的样品或不稳定的样品必须用玻璃柱。不锈钢柱宜用于比较稳定的样品或需进样量大才能分析的样品。
一般柱形随仪器而定不容选择，有U形、W形、螺旋形。螺旋管的直径应比柱大15～25倍，否则会影响分离。
3.2 色谱柱的内径
板高与柱半径平方成正比。原因是粗内径的色谱柱在填充固定相时，粗颗粒的固定相易集中于管壁附近，而细颗粒的易集中于管柱中心，致使柱截面上形成粒度梯度，即固定液分布不均匀造成柱效下降。而细内径色谱柱易填充均匀，因而柱效高。填充柱多用直径2～3mm的色谱柱，而微填充柱则使用内径1mm左右的色谱柱。
3.3 柱长的选择
选用多长的色谱柱，主要依据固定液对难分离物质对的选择性。一般多用1～3米的填充柱。
4．载气及其流速的选择
4.1 载气的选择
首先要适应所用检测器的特点，其次要考虑载气对柱效和分析速度的影响。在快速色谱分析中，多采用H2、He作载气。
4.2 载气线速的选择
对于难分离物质对，一般选用最佳线速，以N2作载气，其最佳线速在7～10厘米/秒；H2，10～12厘米/秒，此时柱效最高。另外，载气线速与保留时间的倒数成直线关系。
4.3 载气流速对检测器响应值的影响
对浓度型检测器来说，当进样量一定时，峰高基本上与流速无关，而峰面积与流速成反比；相反，对质量型检测器来说，峰高正比于载气流速，而峰面积与流速无关。
5．柱温的选择
基本原则是在保证组份充分分离前提下，尽量缩短分析时间。一般温度降低30℃，保留时间将增加一倍，温度降低分离效果好。
选择柱温的根据是混合物的沸点范围、固定液的配比和检测器的灵敏度。
5.1柱温和固定液配比、保留值间的关系
当保留值保持不变，则降低固定液含量，就可以降低柱温。降低柱温又使色谱柱选择性α增大，而α增大则达到一定分离度所需塔板数降低，从而有利于难分离物质对的分离。
降低固定液含量可以降低柱温的另一个优点是，对于高沸点试样，可以在较低柱温下分析，这就使可供选用的高温固定液的数目增加了，色谱柱的稳定性也由于柱温的降低而增加。但是固定液含量过低，柱温过低，易引起色谱峰的前伸或拖尾。
5.2柱温和柱效、分析时间的关系
提高柱温有利于提高柱效能。柱温倒数与保留值的对数成线性关系，因此升高柱温可缩短分析时间。
5.3柱温和试样沸点间的关系
柱温和试样沸点间的关系，主要依据固定液的最低最高温度极限，和色谱仪的温度使用范围。可通过固定液含量来调节柱温的高低。
对于高沸点混合物（沸点300～400℃），可用低固定液含量1～3%的色谱柱，在200～250℃柱温下分析。
对于沸点不太高的混合物（沸点200～300℃），固定液含量5～10%，在150～200℃柱温下分析。
对于沸点在100～200℃的混合物，柱温可选在其平均沸点2/3左右，固定液含量10～15%。
对于气体、气态烃等低沸点混合物，固定液一般在15～25%之间。
6．气化温度的选择
气化温度取决于试样的挥发性、沸点范围、稳定性、进样量等许多因素。气化温度一般选在试样的沸点或稍高于其沸点，以保证快速、完全气化。
检查气化室温度选择的是否恰当的方法是再升高气化温度，如果柱效和峰形有所改进，则温度太低，如果保留时间，峰面积，峰形激烈变化，则温度太高，分解已经出现。
因色谱是一个无限稀释的体系，极微量试样可以瞬间汽化。故对一般分析色谱，气化温度比柱温高10～50℃左右即可。
如何选择毛细管色谱柱
1．固定液的选择
遵循相似相溶原理，同等条件下首选最小极性的固定相。非极性的固定相的使用寿命大于极性固定相。尽可能避免使用污染特殊检测器的固定相，例如：腈基对于NPD，含氟固定相对于ECD。但如果厂商特别说明，比如OV-1701（含腈基）和DM-200（含氟），则可以应用于ECD、NPD、MSD等高灵敏度检测器。
1.1非极性
100%聚二甲基硅氧烷
AE.SE-30、AE.OV-101、AT-1、BP-1、DB-1、HP-1、GB-1、SPB-1、Rtx-1
使用范围：碳氢化合物、农药、胺类、脂类、酚类
5%二苯基-95%二甲基硅氧烷聚合物
AE.SE-52、AE.SE-54、AT-5、DB-5ht、BP-5、HP-5、DB-5
使用范围：碳氢化合物、多核芳烃、脂类、酚类
1.2中等极性
6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-1301、DB-1301、DB-624、Rtx-1301
使用范围：杀虫剂、醇类、氧化剂、溶剂残留
14%氰丙基苯基-86%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-1701、AT-1701、DB-1701、Rtx-1701
使用范围：药物、硝基苯类、醇类、脂类、除草剂
35%二苯基-65%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-35、DB-35、Rtx-35 -20～300
使用范围：胺类、杀虫剂、药品
50%二苯基-50%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-17、AT-50、DB-17、DB-17ht、Rtx-50、SP-2250
使用范围：药物、农药、极性化合物
50%三氟丙基-50%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-210、DB-210、AT-210、Rtx-200
使用范围：醛类、酮类、有机磷、杀虫剂、除草剂
50%氰丙基苯基-50%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-225、AT-225、DB-225、DB-225ms、BP-225、Rtx-225
使用范围：醛类、醇类、乙酸酯类、中性甾醇、聚不饱和脂肪酸、生物碱
50%氰丙基-50%二甲基硅氧烷聚合物
AE.OV-215、DB-23、Rtx-2330、SP-2330
使用范围：顺/反脂肪酸异构体
1.3强极性
聚乙二醇 -20M
AE.PEG-20M、HP-20M、AT-WAX、DB-WAX、Supelcowax
使用温度：20～250 40～260
使用范围：醇类、酸类、脂类、醛类、香精油、溶剂、甘醇、腈类
改性聚乙二醇
AE.FFAP、AT-1000、DB-FFAP 、SP-1000、BP-21、HP-FFAP
使用范围：酸类、醇类、醛类、酮类、腈类、丙烯酸酯类
三氧化二铝
ZKAT-PLOT Al2O3、Al2O3/KCl、Al2O3/Na2SO4、AT-Alumina
使用范围：低碳烃C1～C6
2、色谱柱长度的选择
15m柱用于快速筛选，简单混合物或分子量极高的化合物。
25--30m常规柱:分离10-50个组份的样品。
50m常柱：分离多于50个组份或包含有难分离物质对的复杂样品。
3、色谱柱内径的选择
0.53mm：具有类似填充柱的负荷量，总柱效远远超过填充柱。达到同样的分离度时，分析时间显著快于填充柱。可方便的采用柱上进样或直接进样技术，适用于分析不太复杂的样品，是填充柱的代替品。
0.32mm：柱效低于0.25mm常规柱，负荷量则比常规柱高约60%。
0.25mm：最常用的内径规格，柱效高，负荷量低，必须分流进样，适用于复杂多组分样品的分析。
0.20mm：柱效高，负荷量低，流失小，适合高沸点化合物的分析，可与质谱等灵敏检测器联用。
直接联用的GC/MS和MSD需要小口径柱，因为真空泵不能处理大口径柱的大流量。确实查明你的整个系统看看适合那些柱内径的选择。
4、色谱柱膜厚的选择：
0.10-0.20um（薄液膜）负荷量低，高温下流失小，适合于高沸点化合物的分析，适用于配高灵敏检测器。
0.25-0.33um（标准液膜）
0.50-5.0um（厚液膜）：负荷量较高，在高温下流失较大，适宜于分析低沸点样品。
一般说来，薄膜比厚膜洗脱组分快、峰分离好、温度低，这表明它们适用于高沸点化合物、组分密集化合物或热敏化合物。
标准膜厚为0.25到0.5μm，对于流出达300℃的大多数样品（包括蜡、甘油三脂、甾族化合物）来说分析很好。对于更高的洗脱温度，可以用0.1μm的液膜。厚膜对于低沸点化合物有利，对于流出温度在100℃~200℃之间的物质，用1-1.5μm的液膜效果较好。超厚膜（3-5μm）用于分析气体、溶剂和可吹扫出来的物质，以增加样品组分与固定相的相互作用。
另一个选择厚膜的原因，是为了用大口径柱时与小口径柱保持相同分离度和保留时间。由于这个原因，大口径柱都只有厚膜。厚膜意味着柱里有更多物质，从而流失更多，温度极限必然随膜厚度增加而下降。
色谱工作者应具备的良好习惯
色谱工作者应具备的良好习惯
1、按仪器说明书的规程操作
验收仪器时，不仅要清点所有零部件是否齐全，还要检查仪器说明书是否齐备，并妥善保存这些资料。在独立操作仪器之前，一定要认真阅读有关说明书，并严格按规程操作。这是做好仪器分析的前提条件，而且一旦仪器出了问题，也好与厂商交涉。
2、准备一份色谱柱测试标样
色谱柱性能是保证分析结果的关键。新买的色谱柱，首先要用测试样品评价其性能。如果用色谱柱厂商提供的测试条件测试而结果不合格时，就可要求退货或换货。更重要的是，此后的使用过程中色谱柱性能会变化，当分析结果有问题时，可以用测试标样测试色谱柱，并将结果与前一次测试结果相比较，这有助于确定问题是否出在色谱柱，以便于采取相应的措施排除故障。
3、及时更换色谱柱密封垫
石墨密封垫漏气是GC最常见的故障之一。一定不要在不同的柱上重复使用同一密封垫，即使同一根柱卸下重新安装时，最好也要换新密封垫，这样能保证更高的工作效率。如果装上色谱柱后发现漏气而再更换密封垫，就要花费更多的时间，即使旧垫仍能使用，也要比原来多拧紧一些，弄得不好就会拧断毛细管色谱柱。
4、使用纯度合乎要求的载气
载气一定要用高纯级（99.999%）的，以避免干扰分析和污染色谱柱或检测器。要知道一根色谱柱的价格是一瓶高纯氮气或氢气价格的20倍以上。如果因为要省钱而用普通气体作载气，可能是丢了西瓜拣了芝麻。检测器用辅助气体最好也用高纯级的。虽然在灵敏度要求不高时，可用普通气体，但其代价可能是检测器被污染。
5、定期更换气体净化器填料
变色硅胶可据颜色变化来判断其性能，但分子筛等吸附有机物的净化器就不好用肉眼判断了。所以须定期更换，最好3个月更换一次。如果硅胶与分子筛装在一起，则更换硅胶时也要更换分子筛。
6、使用性能可靠的气体减压器
新的减压器在使用时一定要试漏，在长期的使用过程中也要经常检漏，这是发现问题的一个好习惯。如果不注意这个问题，轻则造成气体浪费，重则出现安全问题，到时悔之晚矣。
7、定期更换进样衬垫
进样口衬垫漏气是GC常见故障之一。另外，衬垫的老化降解也会给分析带来干扰。比如其碎屑掉进汽化室内也可能导致鬼峰。至于多长时间换一次衬垫，则要看所分析的样品性质和分析条件而定。常规实验室一般每天更换一个进样衬垫。无论如何，一个衬垫的连续使用时间不要超过一周。
8、及时清洗注射器
保持注射器清洁能避免样品记忆效应的干扰。更换样品时要清洗，用同一样品多次进样时也要用样品本身清洗注射器。一支注射器暂时不用时（比如下班），更要彻底清洗，否则残留其中的样品可能将针芯粘牢，造成注射器报废。使用自动进样器的用户也应注意此问题，最好是经常更换和清洗注射器。
9、定期检查并清洗进样衬管
仪器长期使用后，进样衬管内会有焦油状物质，这是样品中的不挥发成分造成的。此外还会有颗粒状物质积存（隔垫碎屑，样品中的固体物质）这些都会干扰分析的正常进行。因此要定期检查，及时清洗。注意，在衬管中填充一些经硅烷化处理的石英玻璃毛，既可提高样品的汽化效率，又能防止隔垫碎屑进入色谱柱造成堵塞。10、更换零部件要逐一进行
修理仪器时，不要一次更换多个部件，那样会造成故障原因的判断失误。应该一次更换一件，经测试后再更换另一件。这样可能更便于准确地判断故障原因，同时避免不必要的开支。
11、做好仪器使用和分析记录并定期归档
这是仪器的履历，应逐日记录，包括操作者、分析样品及条件、仪器工作状态等等。一旦仪器出现问题，这是查找原因的重要资料
气相色谱分离条件选择的指标
1.柱效能（N）
为了分离某一物质对，当相对保留值不变（固定液、柱温不变），而k值（固定液配比）变化时，k越小越是靠近非保留峰，则完全分离所需的塔板数越多。但扣除非保留峰后（tR-t0）算出的有效板数（neff）却保持不变，则分离情况也可保持不变。
2.选择性（α）
所谓选择性就是固定液对于两个相邻组份的相对保留值，也就是某一难分离物质对校正保留值之比，以α表示。α代表固定液对难分离物质对的选择性保留作用，其数值越大，越容易分离。
3.分离度（R）
柱效能只说明色谱柱的效率高低，却反映不出难分离物质对的直接分离效果；而选择性则反映不出效率高低，故需用一综合性指标，即既能反映柱效能又能反映选择性的指标，作为色谱柱的总分离效能指标，这一指标就是分离度，分离度是反映色谱柱对相邻两组分直接分离效果的。而R值越大就意味着相邻两组份分离得越好。
气相色谱法的特点
1.色谱柱内现象单纯，可以从理论上理解。
2.混合样品在非极性色谱柱上，组份按沸点顺序流出，在极性色谱柱上，其组份按极性大小流出。
3.增加色谱柱长度可改善分离能力。
4.样品组份在固定相和移动相中易扩散，能迅速达到分配平衡，故可提高移动相的流速以缩短分析时间。
5.检测惰性气体中的样品组分时，可以使用各种高灵敏检测器，所以能做极微量分析和特定组分的高灵敏度的选择性检测。
6.容易与质谱仪或付里叶变换红外光谱仪联用，便于多组分混合物的分离和鉴定。
7.适于分析的物质仅限于在某种形式下为热稳定的挥发性物质。所以从全部化合物来看，适用范围较窄，约为20%。
液相色谱理论
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
HPLC有以下特点：
高压—压力可达150～300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速—流速为0.1～10.0 ml/min。
高效—可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快—通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
高效液相色谱柱的使用与维护简介
由我公司向市场推出的多种液相色谱柱，填料均是由高纯的球形全多孔硅胶制备而成，备有多种含碳量及孔径的填料，色谱柱的装填采用了优化的匀浆装填工艺，使色谱柱具有很高的柱效和良好的色谱峰对称性.另外严格的质量检验程序，保证了柱间和批间的重现性，为您的方法开发和常规分析提供价格合理的高性能产品.同其它精密的产品一样，高效液相色谱柱也需要正确的使用和维护，以确保在较长的色谱柱寿命期间为您提供分析的重现性和高效率.
1.安装：色谱柱的两端采用塑料帽进行封口。一方面，防止污染物进入色谱柱；另一方面防止色谱柱在运输和存储过程中柱子内部发生干裂。本色谱柱可以安装在大多数液相色谱系统上。要确保所有的管线用匹配的接头正确与色谱柱连接，以减小死体积。注意：使用不匹配的；连接配件会减弱柱性能，更严重的会损毁色谱柱。
2.保证良好的柱寿命和性能的步骤：以下所列出的各项措施和建议有助于您更好的使用色谱柱。
（1）流动方向已明确标明在色谱柱上，请正确安装色谱柱，除非您想冲洗色谱柱入口的污染物，否则，请避免反接色谱柱。
（2）流动相与样品在使用前最好用0.5微米的滤膜进行过滤，这样会延长柱寿命，使用预柱则更好。
（3）新色谱柱被保存在纯有机相中，因此在使用时要使用该溶剂平衡，再更换成与之相溶的流动相，若使用含盐的流动相，应先将柱体系中的溶剂替换为水相，否则盐析会导致柱压升高。
（4）本色谱柱适合的流动相为水和各种常规有机溶剂。
（5）流动相pH需保持在2～8之间。
（6）尽量减小柱压力波动。
（7）经常用强溶剂冲洗柱子。
（8）柱温不要大于60℃。
（9）如流动相中含有盐和缓冲溶液时，应用水冲洗干净。如果柱需要较长时间的贮存，应以纯有机溶剂保存例如甲醇，乙腈，最好定期用该溶剂平衡柱子，以防止柱子中溶剂的挥发，导致柱填料干裂。
高效液相对流动相的要求
①必须是HPLC级的，不与固定相发生化学反应。
②对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10范围内（可用范围）或2～5（最佳范围）。k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀。
③必须与检测器相适应。如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。
④粘度小。
⑤必须脱气：由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。因此，流动相在使用前必须经超声脱气30分钟以上。
⑥过滤：由于流动相里有很微小的垃圾，如不经过过滤，偶尔会卡在单向阀门中，从而产生压力波动。
高压液相色谱常见故障及排除方法
(一)保留时间变化
可能的原因 : 解 决 方 法
1.柱温变化 : 柱恒温
2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 : 用>25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 : 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 : 采用保护柱
(二)保留时间缩短
可能的原因 : 解 决 方 法
1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 : 降低样品量
3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 : 柱恒温
(三)保留时间延长
可能的原因 : 解 决 方 法
1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3.键合相流失 : 同前(二)3
4.流动相组成变化 : 同前(二)4
5.温度降低 : 同前(二)5
(四)出现肩峰或分叉
可能的原因 : 解 决 方 法
1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 : 更换进样器转子
(五)鬼峰
可能的原因 : 解 决 方 法
1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 : 处理样品
3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六)基线噪声
可能的原因 : 解 决 方 法
1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
可能的原因 : 解 决 方 法
1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4 : 同前(四)4
5.同前(四)3 5. : 同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
可能的原因 : 解 决 方 法
1.进样体积过大 : 同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载 : 进小浓度小体积样品
浙公网安备 33021202002483