微生物检测及酸奶啤酒制作 丁兆强微生物检测及酸奶啤酒制作 丁兆强

实验名称 ：  微生物检测及酸奶啤酒制作 系别：化学系 班级：化学01 实验者：丁兆强 学号：2010012221 同组姓名：胡昕泓、段世全 实验日期：2012.03.10 实验一 环境中微生物的检测和分离纯化 1、 实验目的 1、熟悉常用微生物培养基; 2、掌握微生物的分离,纯化; 3、用平板划线法和稀释法分离微生物; 4、认识微生物存在的普遍性. 2、 实验原理 (一)微生物的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。 (二)平板菌落计数法 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量既可换算出样品中的含菌数。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。 3、 实验材料 取液器(1000μl一支)，培养箱，培养皿(20个)，，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μl无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 ，牛肉膏蛋白胨培养基所需的牛肉膏、蛋白胨等物质。 4、 实验步骤 (一)培养基的制备 按以下步骤制备牛肉膏蛋白胨平板培养基，每组12个平板。 成分：牛肉膏 1.5g，蛋白胨3g，NaCl 1.5g，自来水300m1 制法： 1．于500ml三角瓶内加入上列成分，混合溶解。 2．调pH至7.4—7.6 3．加入5-6g 琼脂（加入的量取决于琼脂质量） 0.1MPa（121℃）灭菌20min，冷却到50-60℃， 采用叠皿法把培养基倒入灭好菌的90mm培养皿中，制作无菌平板，凝固后倒置待用。 (二)周围环境中微生物的检测及结果 在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验： 1取一个平板，分成五个区，做好标记(下同)。用未洗过的手指头以及肥皂洗过1次（2次、3次）并用水冲干净的手指头、肥皂洗过3次）并用水冲干净的的手指头再用70-75%酒精棉球(所有实验都不用毛巾擦)分别在第一到第五个区上涂抹； 2取一个平板，分三个区，用正在使用的纸巾、硬币、旧纸币分别在不同的区上拖动2～3次； 3往培养基上放置一根头发，并用无菌涂布器压紧；或抖动头发数次，使头发上可能附着的微生物落在培养基上； 4取一个平板，分区，用无菌接种环分别沾一环自来水、河水以及矿泉水在平板不同区上划线； 5用无菌牙签取一点牙垢在一个平板培养基上划线； 6取两个平板，一个打开皿盖，置实验台上(空气中)10min；另一个按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min； 7取一个平板，打开皿盖，对着培养基咳嗽，必须使口腔中喷出的气流和飞沫落到培养基上； 以上用报纸包好倒置于37℃培养箱里培养24小时观察结果。 五、实验结果 杯中水 对应的培养皿 可观察到 约 13 个乳白色菌落 咳嗽对应的培养皿 仅可观察到 1 个菌落 空气对应的培养皿 可观察到约四个菌落 1 为未洗手指，对应大量菌落 234 对应着用肥皂洗 1 、 2 、 3 遍的手指。菌落数目差不多。 5 对应着酒精棉球擦拭过的手指，菌落相比前面略少。 左为牙垢对应培养基，右为头发对应培养基。 左边有较多的菌落，而右边则仅有约两个菌落。 四幅图均为涂布的土壤样品，可以看到均有大量的菌落，左上角因为涂布未分散导致菌落连成一片。右边两幅 （实为同一培养基） 涂布地比较不错，菌落非常多且分散。 纸币对应的培养基 培养基上 长有少量菌落，十个左右 自来水和河水对应的培养基，均产生大量的黄色菌落。 按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min的培养皿同样无菌落产生。 6、 实验讨论 1、 实验中使用的土壤中的细菌数量大约在哪个数量级，你分离出的微生物主要有哪些种类？为什么？ 对于涂布均匀的培养皿来说，大约有四十个菌落，所以土壤中细菌含量为(个/g土壤 ) 40/（0.1×0.0001）= 4.0×106 为106数量级 分离的微生物中主要可能有各种真菌、放线菌的孢子及细菌芽胞，因为形成的菌落呈圆形，少量成片生长，表面光滑，淡黄色或白色。这些为上述微生物菌落的特征。 2、从你对周围环境中微生物存在的观察结果，你认为无菌操作要注意些什么？ （1）尽量减少空气流通（2）操作人员应戴无菌手套（3）操作人员必须戴口罩，穿上防护服（4）应该紫外线消毒，操作台用酒精消毒（5）实验器材应高温消毒（6）操作动作要准确迅速（7）各种器材不能混用（8）外流空气应进行高温消毒，以防污染外界环境。 3、在日常生活中如何讲究饮食和生活卫生？ （1）饭前便后洗手，洗手要仔细彻底（2）勤洗澡，勤洗衣物，被褥，毛巾，抹布（3）注意细节，水果要洗净后再食用，不用手揉眼睛，不啃指甲（4）注意食品的保质期，不吃过期食物，注意饮食卫生（5）室内要保持空气畅通，勤开窗通风（6）保持室内干净整洁，勤打扫。 4、试解释夏天时煮好的饭如果放在锅中保持盖着锅盖不动，不容易变质，而一旦盛在碗　里的饭就容易变质，如果是吃剩的剩饭就最容易变质的原因。 从与空气接触的平板实验知道，空气中有很多微生物，饭一旦盛在碗里，就会接触许多微生物，它们大量繁殖，加快了饭的变质速度。吃剩的饭由于接触了唾液，加快了饭的分解速度，更有利于微生物的繁殖。 5、根据实验结果，试从微生物角度批驳“洁僻行为”。 根据手指平板实验可以看出，手并不是越洗越干净的，总会感染一些水中和洗涤用品中的微生物，虽然于健康无碍，反复洗手并没有必要，只是心理安慰而已。 总结见最后。 实验二 　固定化酵母细胞发酵啤酒实验与酸奶制作 1、 实验目的 1． 了解固定化细胞技术的方法和意义； 2． 了解酵母发酵产生啤酒的过程； 3． 学习酸奶制作方法； 4． 了解纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别； 5． 了解基本微生物实验操作技术． 二、实验原理 1．固定化技术：就是将生物酶或细胞固定在一定的基质上，比之传统的方法，具有能多次使用菌体的特点。包埋法是固定化技术的一种，是将微生物细胞均匀的包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不易漏出。由于在制定固定化细胞时，细胞和载体不起任何反应，细胞处于最佳生理状态；同时固定化细胞有载体为屏障，可避免外界不利因素的影响，因此能迅速增殖，结果单位体积内的酵母数比通常液体培养的高。增殖酵母凝集在凝胶表面形成浓厚的菌体层，因此酵母能迅速与基质接触，从而缩短周期，提高啤酒的产量。 三、实验材料 无菌滴管，无菌封口膜封好的100ml三角瓶； 发酵培养基：150ml麦芽汁(8%~10%)/250ml三角瓶 2.5%海藻酸钠溶液5ml, 灭菌 1.5% CaCl2 50ml, 灭菌 0.9% 无菌生理盐水, 50ml， 袋装巴氏消毒的牛奶（三元牛奶，需选择无抗奶） 啤酒菌种：啤酒酵母（如五星啤酒酵母）； 酸奶菌种：市售酸奶（三元原味酸牛奶，不经过灭菌，保留活性乳酸菌）。 4、 实验步骤 （一）固定化酵母细胞发酵啤酒 1．菌体培养：将培养24h 的新鲜斜面菌种，接种于三角瓶中培养。 2．细胞固定化：在海藻酸钠溶液中，加入2ml 预热至35℃的酵母培养液，混合均匀，以无菌滴管（离液面5cm以上，离液面太近无法制得凝胶珠）缓慢而稳定的加入CaCl2 溶液，即可得到直径约3mm左右的凝胶珠。注意无菌操作。钙化30min左右（这期间可以进行酸奶制作）。 3．固定化细胞发酵啤酒：在无菌玻璃棒帮助下倒掉CaCl2 溶液，倒生理盐水于制得的固定化好的酵母细胞的瓶子中，洗一次凝胶珠。将100mL发酵培养基（麦芽汁）倒入制得的固定化小球的瓶子中，用无菌封口膜封好瓶口。20-28℃静置培养48h。注意无菌操作。 4．4℃冰箱放置一天后，品尝啤酒 （二）制作酸奶 1、直接把经过巴氏消毒的市售‘三元’牛奶中分装到纸杯中,加入约6%(w/v)白糖和加入约5%市面上销售的‘三元’酸奶，摇或搅拌到确保白糖溶解。 2、 用洁净的白纸将纸杯口盖住，42℃进行发酵培养10-12小时。 3、 置于冰箱或冰水中数小时，待冷却老熟后便成酸奶。 4．品尝酸奶。 五、实验结果 做好的啤酒 味道为苦涩，有市场上所售啤酒的口感。 酸奶比较粘稠，味道酸酸甜甜。 六、实验讨论 1、你酿制的啤酒和酸奶风味如何？ 见上实验结果 2、谈谈固定化细胞技术的意义？ 固定化技术有以下优点：固定化细胞能重复使用;发酵后菌体与发酵液易于分离;后处理工艺简单,成本低;可连续发酵,过程自动化。固定化技术可以实现对菌体的多次利用，这样可以极大地降低生产成本。例如使用包埋法固定酵母菌，由于细胞与载体不发生反应，细胞可以处于最佳的生理状态，这样可以提高生产效率，在单位时间内生产出更多的产品，同时有载体为屏障，可以避免外界的比例浓度，提高菌种的浓度，缩短生产周期，降低生产成本，提到产品产量。 3、 纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别 传统发酵多采用开放式，对设备要求不高，对无菌操作也没纯种发酵严格，培养基一般含有多种杂菌。现代发酵工业绝大多数采用纯种发酵，可以保证高产及生产过程和产品质量的稳定，培养基必须严格消毒。污染是纯种发酵工业的大敌，它会使发酵失败，造成巨大损失。因此，灭菌和无菌操作成为纯种发酵工业的重要环节。 传统发酵是以成分复杂的谷物为原料，有多种微生物分泌的酶系参与，水解与发酵混合进行，将原料成分转化成多种风味和营养物质的过程。纯种发酵是在成分单一的发酵基质中，仅接入一种微生物，通过对该微生物的培养，得到纯度较高的单一性产物。为使发酵顺利进行，必须保持发酵的始终单菌纯种，要求人工扩大的菌种不得被污染，一旦发现其它菌株出现，便称之为发酵事故。 4、为何有同学在用无菌滴管把海藻酸钠与酵母菌混合液中加入CaCl2溶液时。未得到凝胶珠，而得到了不规则形状的固体 海藻酸钠和钙离子反应生成凝胶进而可以形成胶珠，一般形成的形状就是液滴滴入时的形状，但是该反应是需要一定的时间的。如果低加的距离太低，海藻酸钠和钙离子溶液接触时液滴碰到钙离子液面而变成不规则的形状，形成的凝胶也会是不规则的形状；如果滴加过快，前面一滴还未形成凝胶就和后面滴连在一起也会形状不规则。总之，滴加速度影响着形状。 5、制作酸奶时为何要求使用“无抗奶”作为原料？ 使用无抗奶作为制作酸奶的原料是因为抗生素对乳酸菌的生长繁殖有抑制作用，甚至会杀死乳酸菌。 七、实验总结 此次试验接触了大量的微生物，不过这些微生物都是生活中比较常见而却容易被我们忽视的微生物，环境中的微生物种类非常多，实验中微生物的迅速繁殖以及产生的大量菌落也给我很大的影响，生活中应该注重卫生情况。此外，在啤酒和酸奶的制作环节，我们体验了利用环境中的微生物为人类造福产生的产品，这更加贴近我们的生活，使得我们对于微生物不至于非常陌生，也产生了对生物学习的热情，而且可以合理地利用微生物为人类造福。